基因工程菌的稳定性(20201014084828)
生物工艺学课件 基因工程菌的稳定性问题
第七章基因工程菌发酵第二节工程菌的稳定性问题近年来，重组DNA技术（基因工程）已开始由实验室走向工业生产。
现在，由工程菌产生的珍稀药物如：胰岛素、干扰素、人生长激素、乙肝表面抗原等等都已先后供应市场，基因工程不仅保证了这些药物的来源，而且可使成本大大下降，但是从许多研究中发现，工程菌的保存过程中及发酵生产过程中表现出不稳定性，因而工程菌的稳定性的解决已日益受到重视并成为基因工程这一高技术的成就转变为生产力的关键之一。
一、工程菌不稳定性的表现（倾向）工程菌的不稳定实际上包括质粒的不稳定及其表达产物的不稳定两个方面。
具体表现为下列三种形式：质粒的丢失；重组质粒发生DNA片段脱落；表达产物不稳定。
由于某种环境因素或生理、遗传学上的原因，质粒从某些宿主细胞中丢失（消除curing），丢失率因环境、宿主、质粒结构而有不同。
由于质粒的丢失，工程菌的发酵过程实际上是两种菌的混合物。
在非选择性条件下，含有重组质粒的工程菌的比生长速率（μ+）往往小于不含重组质粒的比生长速率（μ-）。
宿主细胞的生长优势对工程菌的发酵极为不利。
有时质粒不稳定并非由于质粒丢失的缘故，而是重组质粒上一部分片段脱落，表现为质粒变小或某些遗传信息发生变化甚至丧失。
表达产物不稳定也是一个很重要的问题。
发现人干扰素工程菌在表达干扰素时，随着培养时间的延长，干扰素活性反而下降。
这种情况在别的工程菌培养过程中也有发现。
二、引起工程菌不稳定性的一些因素及对策组建成的工程菌的稳定与否，取决于重组质粒本身的分子组成、宿主细胞生理和遗传性及环境条件等三个方面。
就质粒本身的分子结构而言，引起工程菌不稳定常常是由于稳定区受到影响。
某些质粒如PSC101、R1、F等的分配系统在质粒上的位置已经确定，质粒col DF13有两个DNA序列part A, part B对它的稳定起着不可缺少的作用。
枯草杆菌质粒pUB110上几个与膜结合的蛋白基因对稳定性有关。
如质粒在重组过程中影响到这些序列的完整性，则其稳定性也受影响，另外可能由于重组质粒上有重复序列，或与宿主染色体有部分同源等等都会造成质粒的不稳定。
基因工程菌质粒的稳定性
四、提高质粒稳定性的措施
1．选择合适的宿主菌和合适的载体 （1）宿主菌
（2）载体
大肠杆 菌
酵母菌
四、提高质粒稳定性的措施
2．选择适宜的培养方式
（1）两步发酵方式：生长阶段外源基因表达阶段 （2）控制基因过量表达
3．控制合适的培养条件 （1）施加选择压力 （2）培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有 利于稳定 （3）培养温度： 较低的培养温度有利于重组质粒 的稳定
4．采用固定化技术
1. 质粒的不稳定性有哪几种表现？ 2. 质粒不稳定性产生的机制有哪些？ 3. 影响质粒不稳定性的因素有哪些？ 4. 如何提高质粒的稳定性？
课程名称:生物工艺学
基因工程菌质粒的稳定性
1 质粒不稳定的表现 2 质粒不稳定性的产生机制 3 影响质粒稳定性的因素 4 提高质粒稳定性的措施
一、质粒不稳定的表现
n 质粒丢失：脱落性不稳定
由环境因素或生理、遗传学原因，质粒从宿主中 丢失，丢失率因环境、宿主、质粒结构而不同。
n 质粒的基因结构突变：结构不稳定性
在pH为6．0时，基因工程酵母表达乙肝表面抗原的质粒最稳定， 在pH值为5.0时，质粒最不稳定。
设法控制pH值在合适范围内，确保质粒的稳定性。
（3)溶解氧和搅拌
当溶解氧浓度在培养基中周期变化时，连续培养酵母的质粒稳 定性强烈依赖于生长速率，在较低生长速率下完全稳定。
增加氧浓度能引起细胞内氧化性胁迫，稳定阶段缺氧限制产物 的形成和质粒稳定性。
在不同培养基中基因工程菌，还存在质 粒丢失概率的差异；比生长速率也不同。
2．发酵操作方式
n 流加操作方式 n 两段连续培养 n 固定化后
细胞
凝胶网 格载体
半透膜 胶囊ຫໍສະໝຸດ 3．发酵培养条件（1）温度
(附具体方法)基因工程菌质粒(遗传)稳定性--原创
质粒遗传稳定性目前没有明确的规定，但一般用斜面传代法，一定数量点接抗性和非抗性板，生长计数（主要证明分裂稳定性）；更严谨时，可进一步双酶切、测序等验证（证明结构稳定性--国家药品监督管理局的新生物制品审批）。
工业用菌确实存在很多问题，免不了质粒丢失严重，高突变等现象，但是一般工业用菌都是经过10代以上稳定筛选之后才用于小试、中试和工业生产的。
菌体不稳定造可能成的损失巨大，所以鲜有工业用菌使用在2-3代菌就没有产量或者产量低的菌株。
一般来说，一代菌用一点少一点，一代菌上罐太伤了，工业用菌一般会存储足够量的二代菌（多数是冷冻干燥安瓿管）用于生产，在生产中需要活化、制作摇瓶种子，如果菌体生长慢，还要进一步做种子罐，最后才能用于生产。
如果菌体稳定性差，几代传下来，发酵的不稳定造成损失是很难估计的，而且一般不稳定菌都是先做小试、中试，成功后才能用于生产。
质粒在宿主中的稳定性确实需要进行筛选，实验中遇到的质粒突变能避免尽量避免，做好的质粒也不一定一直存放，由于不断的被用于各种改进实验，期间经过的大量筛选，避免了一代菌用完之后就没有更好的使用。
使用高保真酶扩增、保证没有物理化学因素促变，使用合适的宿主，还是很容易得到没有突变的质粒的，后续连续传代培养也可以得到比较稳定的质粒的。
质粒不稳定是重组基因工程菌培养过程中的常见问题，也是影响外源基因高效表达的限制因素之一[77~78]。
Koch[79]最早对外源基因引入宿主而对细胞产生的代谢负荷进行考察，研究表明质粒的大小、拷贝数，质粒的维持，抗性基因的表达，培养环境的变化，都会对宿主细胞产生代谢负荷，当供氧不足或营养物质受限制时，代谢负荷对细胞生长的影响会更加明显。
基因工程菌中质粒稳定性问题是影响基因工程菌实现规模生产的一个重要因素,这种不稳定性主要表现为两种形式: 一种是重组DNA 质粒的丢失, 称为脱落性不稳定; 另一种是质粒中的基因结构发生突变, 称为结构性不稳定。
工程菌的高效表达和稳定性
2.接种量的影响 接种量的大小影响发酵的产量和发酵周期。接 种量小，菌体延迟期较长，使菌龄老化，丌利
于外源基因表达；接种量大，可缩短生长延迟
期，菌体迅速繁衍，很快迚入对数生长期，适 于表达外源基因；接种量过高，使菌体生长过 快，代谢物积累过多，反而会抑制后期菌体的 生长。
3.温度的影响
温度对发酵过程的影响是多方面的。它影响各 种酶的反应速度，改变菌体代谢产物的反应方 向，影响代谢调控机制。适宜的发酵温度是既 适合菌体的生长，又适合代谢产物合成的温度
外源基因在真核细胞中的表达 哺乳动物细胞做宿主表达体系的优点：
（1） 能识别和除去外源基因中的内含子，剪
切加工成成熟的mRNA；
（2） 表达的蛋白质在翻译后被加工的机会多
（如糖基化），更接近于体内构型； （3） 易被重组DNA转染，具有遗传稳定性和 可重复性； （4） 经转化的哺乳动物细胞可将表达的产物
2.选择合适的载体
改造、构建能稳定表达的质粒载体是构建工程菌的重要一环。针对不同的载体及 不同的目的采取不同的策略。 3.选择压力 从遗传学来说，选择意味着利用某些生长条件使得只有那些具有一定遗传特性 的细胞才能够生长。
4.分段控制培养 提高质粒稳定性的目的是为了提高克隆菌的发酵生产率，但外源基因表达水平越 高，重组质粒往往越不稳定。 可采用两阶段培养法，即在发酵前期控制外源基因不过量表达，使重组质粒稳 定地遗传；到后期通过提高质粒的拷贝数或转录、翻译效率使外源基因高效表 达。
分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。 结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改 变
导致质粒不稳定的常见的三个因素： 1.含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；
基因工程菌培养及其不稳定性
5. 搅拌器转速和通气应适当
6. 空气过滤系统要采用活性碳和玻璃纤维棉材料
7. 培养液要经化学处理或热处理后才可排放
8. 发酵罐的排气口须有蒸汽灭菌或微孔滤器除菌后才将废气放出。
9. 轴封可采用磁力搅拌或双端面密封
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中，大量乙酸在透析器中透过半透膜，降低培养基中的乙酸浓度，并
可通过在透析液中补充养分而维持较合适的基质浓度，从而获得高密
度菌体。
膜的种类、孔径、面积，发酵液和透析液的比例，透析液的组成
循环流速，开始透析的时间、透析培养的持续时间段都对产物的产率
有影响。
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一、基因工程菌的培养方式
5. 固定化培养
基因工程菌培养的一大难题是如何维持质粒的稳定性。 有人将固定化技术应用到这一领域，发现基因工程菌经固定化 后，质粒的稳定性大大提高，便于进行连续培养，特别对分泌型菌 更为有利。 由于这一优点，基因工程菌固定化培养研究已得到迅速开展。
提高发酵罐的供氧能力。
有些含质粒的菌对发酵环境的改变比不含质粒的菌反应慢，因
而采用间隙改变培养条件的方法以改变这两种菌的比生长速率，从
而改善质粒的稳定性。通过间隙供氧的方法和通过改变稀释速率的
方法都可提高质粒的稳定性。
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提高基因工程菌稳定性的方法
5. 控制培养条件
pH pH 影响重组菌的稳定性。
5. 控制培养条件
限制性基质
一般培养基中各成分并不是完全平衡的，经过一段时间的培养， 微生物的生长通常会受到一种或几种物质的限制。
限制性基质的种类对重组菌有不同的影响
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提高基因工程菌稳定性的方法
5. 控制培养条件
溶解氧
在基因重组菌的高密度培养时，为了ห้องสมุดไป่ตู้持所需的溶氧水平，除
基因工程菌的稳定性
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发酵罐的组成有：
发酵罐体、保证高传质作用的搅 拌器、精细的温度控制和灭菌系 统、空气无菌过滤装置、残留气 体处理装置、参数测量与控制系 统、培养液配制和连续操作系统。
对发酵罐要求： 提供菌体生长最适生长条件， 培养过程不得污染， 保证纯菌培养， 培养及消毒过程不得游离异物， 不能干扰细菌代谢活动等。
温度还影响蛋白质的活性和包 含体的形成。
⒋ 溶解氧的影响
对于好氧发酵,溶解氧浓度是重 要的参数。
好氧微生物利用溶解于培养液 中的氧气进行呼吸。
若能提高溶氧速度和氧的利用 率，则能提高发酵产率。
发酵时，随DO2浓度的下降， 细胞生长减慢，ST值下降，发酵后 期下降幅度更大。
外源基因的高效表达需要大量 的能量，促进细胞的呼吸作用，提 高对氧的需求。
第五节 基因工程菌的 稳定性
基因工程菌在传代过程中常 出现质粒不稳定的现象。
质粒不稳定可分为： 分裂不稳定 结构不稳定
分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一 定比例不含质粒子代菌的现象。
结构不稳定：指外源基因从质粒上丢 失或碱基重排、缺失所致工程菌性 能的改变
3.2第三章_基因工程菌的稳定性_生物制药
遗传特性
载体的选择 宿主的选择 外源基因整合到宿主染色体上 培养基 生长速率 限制性基质 温度 pH 和溶氧 外源基因表达
发酵工艺
改进载体受体系统 以增加质粒稳定性为目的的构建方法包括：
1.将 R1 质粒上的 parB 基因引入表达型载体中 其表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞 2.正确设置载体上的多克隆位点 禁止 DNA 片段插在稳定区内 3.将受体细胞的致死性基因安装在载体上 同时构建条件致死性的相应受体系统，如大肠杆菌的 ssb 基因
的稳定性，在第二级进行表达。
提高基因工程菌稳定性的策略
控制目的基因的过量表达
使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表达程度
使用可控型复制子控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数
优化基因工程菌的培养工艺
培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有利于稳定
培养温度： 较低的培养温度有利于重组质粒的稳定
提高基因工程菌稳定性的策略
分批培养中选用不同的碳源、补料培养中控制补料速度、 连续培养中控制稀释速率等培养方法，都能在一定范围内控 制菌体的生长，从而控制乙酸的产生，减少它的抑制作用， 以实现工程菌的高密度培养和提高重组产物的表达水平。 实质：控制菌体的糖酵解速度，使之低于三羧酸循环和 呼吸链的最大代谢能力，从而避免乙酰辅酶A的积累和乙酸的 产生，以降低供能速度或前体供应速度来降低蛋白合成和菌 体生长速度。
连续培养：
连续培养是将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至菌体浓度达到一定程度 后，开动进料和出料蠕动泵，以一定稀释率进行不间断培养。
连续培养可以为微生物提供恒定的生活环境，控制其比生长速率，为研究
基因工程菌的发酵动力学、生理生化特性、环境因素对基因表达的影响等创造了 良好的条件。 但是由于基因工程菌的不稳定性，连续培养比较困难。为了解决这一问 题，人们将工程菌的生长阶段和基因表达阶段分开，进行两阶段连续培养。在这
关于基因工程菌的稳定性
关于基因工程菌的稳定性摘要：研究了定态与周期操作对基因工程酒精酵母质粒稳定性的影响,周期操作有利于提高底物的利用率并增强质粒的稳定性；发现了固定化重组菌高稳定性的原因，另外还讨论了诸多培养条件对基因工程菌稳定性的影响。
关键字：固定化；基因工程菌；质粒；稳定性；基因工程基因工程菌就是将目的基因导入细菌体内使其表达，产生所需要的蛋白的细菌成为基因工程菌。
基因工程菌在传代过程中常出现质粒不稳定的现象。
质粒不稳定可分为：分裂不稳定和结构不稳定。
分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。
结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。
1 常见分裂不稳定的两个因素：1.1 含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；1.2 这两种菌比数率差异的大小。
2 提高质粒稳定性的方法2.1 选择合适的宿主菌；2.2 选择合适的载体，适当增加质粒拷贝数；2.3 加入选择性压力；2.4 采用两阶段培养法；先使菌体生长至一定密度，再诱导外源基因的表达。
由于第一阶段外源基因未表达，减小了重组菌与质粒丢失菌的生长速率的差别，增加了质粒稳定性。
在培养基中加入抗菌素抑制质粒丢失菌的生长，提高质粒稳定性。
调控环境参数如温度、pH、培养基组分和溶解氧浓度。
有些含质粒菌对发酵环境的改变比不含质粒菌反应慢，间歇改变培养条件以改变两种菌比生长速率，可改善质粒稳定性。
通过间歇供氧和改变稀释数率，都可以提高质粒稳定性。
2.5 控制工程菌的培养条件；2.6 采用固定化培养基因工程技术是生物技术的核心和关键,已成功地表达了一系列与人类健康有关的重要多肽物质以及使多种氨基酸和抗生素增产,对人类社会生活产生了深远的影响。
基因工程菌中质粒稳定性问题是影响基因工程菌实现规模生产的一个重要因素,这种不稳定性主要表现为两种形式:一种是重组ＤＮＡ质粒的丢失,称为脱落性不稳定;另一种是质粒中的基因结构发生突变,称为结构性不稳定。
这两种不稳定都能使细胞失去生产能力。
重组人超氧化物岐化酶基因工程菌稳定性研究
重组人超氧化物岐化酶基因工程菌稳定性研究目的：研究重组人超氧化物岐化酶毕赤酵母基因工程菌的遗传稳定性。
方法：基因工程菌连续传代50次，每10代取样保藏菌种，通过对菌株形态、菌落形态、质粒稳定性、目的基因的PCR鉴定，蛋白表达的SDS-PAGE鉴定来评价工程菌的稳定性。
结果：在连续传代50代的过程中，菌株、落形态与原始工程菌相比无明显差异，质粒保有率高，PCR鉴定结果显示，重组载体携带目的基因传至50代未消失，SDS-PAGE结果表明，传至50代蛋白表达量无明显差异。
结论：该工程菌有良好的遗传稳定性。
标签：重组人超氧化物岐化酶；毕赤酵母工程菌；遗传稳定性Abstract：Objective：to study the genetic stability of recombinant human superoxide dismutase Pichia pastoris. Methods：the genetically engineered bacteria were subcultured for 50 times，and the preservation strains were sampled every 10 generations. The morphology of the strain，colony morphology，plasmid stability and target gene were identified by PCR. SDS-PAGE analysis of protein expression was used to evaluate the stability of engineering bacteria. Results：there was no significant difference in the strain and colony morphology between the original engineering strain and the original engineering strain in the course of successive subculture for 50 generations. The plasmid retention rate was higher than that of the original engineering strain. The results of PCR identification showed that the plasmid retention rate was high. The result of SDS-PAGE showed that there was no significant difference in the expression of protein from the recombinant vector to the 50th generation. Conclusion：the engineering strain has good genetic stability.Keywords：recombinant human superoxide dismutase；engineered Pichia pastoris；genetic stability超氧化物歧化酶是生物體防御氧化损伤的一种十分重要的生物酶，具有清除体内氧自由基的能力，能较好地抵御氧自由基和其他氧化物自由基对细胞质膜的毒性[1]，在机体保护方面起重要作用，在医药与化妆品方面有很好的应用前景。
关于基因工程菌的稳定性
关于基因工程菌的稳定性摘要：研究了定态与周期操作对基因工程酒精酵母质粒稳定性的影响,周期操作有利于提高底物的利用率并增强质粒的稳定性；发现了固定化重组菌高稳定性的原因，另外还讨论了诸多培养条件对基因工程菌稳定性的影响。
关键字：固定化；基因工程菌；质粒；稳定性；基因工程基因工程菌就是将目的基因导入细菌体内使其表达，产生所需要的蛋白的细菌成为基因工程菌。
基因工程菌在传代过程中常出现质粒不稳定的现象。
质粒不稳定可分为：分裂不稳定和结构不稳定。
分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。
结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。
1 常见分裂不稳定的两个因素：1.1 含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；1.2 这两种菌比数率差异的大小。
2 提高质粒稳定性的方法2.1 选择合适的宿主菌；2.2 选择合适的载体，适当增加质粒拷贝数；2.3 加入选择性压力；2.4 采用两阶段培养法；先使菌体生长至一定密度，再诱导外源基因的表达。
由于第一阶段外源基因未表达，减小了重组菌与质粒丢失菌的生长速率的差别，增加了质粒稳定性。
在培养基中加入抗菌素抑制质粒丢失菌的生长，提高质粒稳定性。
调控环境参数如温度、pH、培养基组分和溶解氧浓度。
有些含质粒菌对发酵环境的改变比不含质粒菌反应慢，间歇改变培养条件以改变两种菌比生长速率，可改善质粒稳定性。
通过间歇供氧和改变稀释数率，都可以提高质粒稳定性。
2.5 控制工程菌的培养条件；2.6 采用固定化培养基因工程技术是生物技术的核心和关键,已成功地表达了一系列与人类健康有关的重要多肽物质以及使多种氨基酸和抗生素增产,对人类社会生活产生了深远的影响。
基因工程菌中质粒稳定性问题是影响基因工程菌实现规模生产的一个重要因素,这种不稳定性主要表现为两种形式:一种是重组ＤＮＡ质粒的丢失,称为脱落性不稳定;另一种是质粒中的基因结构发生突变,称为结构性不稳定。
这两种不稳定都能使细胞失去生产能力。
基因工程菌大规模培养
第7章基因工程菌的培养工程菌的稳定性一、工程菌不稳定的表现工程菌的不稳定实际上包括质粒的不稳定及其表达产物的不稳定两个方面。
具体表现为：质粒的丢失、重组质粒发生DNA片段脱落和表达产物的不稳定。
二、引起工程菌不稳定的一些因素及对策工程菌稳定与否，取决于质粒本身的分子组成、宿主细胞的生理和遗传特性及环境条件等三个方面工程菌不稳定的因素：控制基因的过量表达，菌体的比生长速率，培养温度，培养基的组成1、培养基的组成质粒在丰富培养基比在低限培养基中更加不稳定。
合成培养基往往有利于宿主细胞的生长，但不利于外源基因的表达。
2、培养温度进行工程菌培养时必须探索其最佳培养温度。
通常低温有利于重组质粒的稳定遗传。
3、菌体的比生长速率如果宿主菌的比生长速率比工程菌的大，质粒将严重丢失，导致工业上倒罐；如果宿主菌的比生长速率比工程菌小，大量繁殖时因竟争性利用基质，宿主细胞将会受到抑制，对发酵影响不大。
4、控制基因的过量表达外源基因表达水平越高，重组质粒就越不稳定。
可以采用两阶段培养法，即在发酵前期控制外源基因不过量表达，使质粒稳定遗传，到后期通过提高质粒的拷贝数和转录、转译效率使外源基因高效表达。
控制外源基因过量表达的方法：1)如构建含可诱导启动子的工程菌，这种工程菌发酵生产时，可选择培养条件使启动子受阻遏制一定时间，在此期间质粒稳定遗传，然后通过去阻遏（诱导）使质粒高效表达；2)采用温度敏感型质粒，温度较低时质粒拷贝数少，当温度升高到一定时质粒大量复制、拷贝数剧增。
高密度培养为了大量获得基因工程产品，通常采用高密度培养技术，即提高菌体的发酵密度，最终提高产物的比生产率(单位体积单位时间内产物的产量)的一种培养技术，通常指分批补料发酵技术。
这样不仅可减少培养体积、强化下游分离提取，还可缩短生产周期、减少设备投资，最终降低生产成本。
一、重组大肠杆菌的高密度培养重组大肠杆菌高密度发酵成功的关键是补料策略，即根据工程菌的生长特点及产物的表达方式采取合理的营养流加方案。