ISO_DALT双向电泳方法的优化与改进

福建农林大学学报(自然科学版)第35卷第2期Journal of Fujian Agriculture and Forestry University(Natural Science Editi on)2006年3月I S O2DAL T双向电泳方法的优化与改进王经源1,陈舒奕2,梁义元1,林文雄1(1.福建农林大学农业生态研究所,福建福州350002;2.宁德出入境检验检疫局,福建宁德352100)摘要:通过对I S O2DALT双向电泳技术进行优化与改进,建立了一套适合于UV2B胁迫下水稻蛋白质组分析的双向电泳技术.用此方法对经低剂量UV2B辐射处理的水稻品种I R64的叶片蛋白进行双向电泳,可以分辨出1200-1300个蛋白(肽)点,等电点(p I)在3.5-9.3之间,相对分子质量在10-120ku之间,分辨率较高,且重复性较好.关键词:I S O2DALT;双向电泳;蛋白质组;水稻中图分类号:Q946文献标识码:A文章编号:167125470(2006)022*******I m provem en t of I SO2DAL T electrophoresis systemWANG J ing2yuan1,CHE N Shu2yi2,L I A NG Yi2yuan1,L I N W en2xi ong1(1.I nstitute of Agr o2ecol ogy,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou,Fujian350002,China;2.N ingde Entry2Exit I n2 s pect and Quarantine Bureau,N ingde,Fujian352100,China)Abstract:This paper intr oduced an i m p r oved I S O2DALT electr ophoresis system for O ryza sativa p r oteom ic res ponding t o UV2B radi2 ati on.The leaf p r oteins of I R64radiated with UV2B were extracted and separated with22di m enti on electr ophoresis.About1200-1300p r otein s pots were identified on the2D2gel.The p I of these p r oteins ranged fr om3.5t o9.3with molecular weight distributing fr om10t o120ku.Key words:I S O2DALT;22di m enti on electr ophoresis;p r oteome;O ryza sativa随着包括水稻、人类在内多种生物基因组测序的完成,生命科学研究进入了后基因组时代,而从蛋白质组(p r oteome)水平上研究基因功能的蛋白质组学(p r oteom ics)分析是进行功能基因组学研究的重要内容与方法[1],也是作物分子生态学的核心技术之一[2].自1975年O′Farrell提出高分辨率双向电泳技术[3]以来,该技术有了长足的发展,并与质谱技术、生物信息学成为蛋白质组学研究的三大核心技术[4].根据第1向等电聚焦方式的差异,双向电泳依其第1向电泳介质的不同主要有I S O2DALT与I PG2DALT两大系统.其中,使用载体两性电解质的I S O2DALT可自由决定等电聚焦电泳规模和pH梯度曲线,而且对仪器设备要求不高、费用较低,被广泛地应用于蛋白质组学研究[5-7],但在实际应用中,与I PG2DALT系统相比, I S O2DALT存在着阴极漂移(cathode drift)、重复性较低等缺点[4].为此,在水稻对UV2B辐射胁迫反应的差异蛋白质组学研究中对I S O2DALT技术进行了优化,以期为深入研究其逆境分子生态学机制提供技术支撑.1　材料与方法1.1　试剂与仪器两性电解质Ampholine(pH3.5-10,pH5-8)购自Amersha m Phar macia,Nonidet P240、CHAPS、TE MED、丙烯酰胺、N,N′2甲叉双丙烯酰胺等购自上海生工生物工程有限公司,尿素、过硫酸铵等常规化学药品均为国产分析纯试剂.电泳仪及蛋白质双向电泳槽均为北京六一仪器厂产品.1.2　植物材料水稻品种I R64,由国际水稻研究所提供,培养至6叶期,按林文雄等[8]的方法进行UV2B胁迫处理.收稿日期:2005-06-22 修回日期:2005-11-14基金项目:国家自然科学基金(30471028);福建省教育厅(K03015)和福建省自然科学基金(B0510014)资助项目.作者简介:王经源(1972-),男,讲师,硕士.研究方向:植物分子生物学.福建农林大学学报(自然科学版)第35卷1.3　叶片蛋白质样品的制备1.3.1　叶片蛋白质干粉制备　取经UV2B处理的I R64旗叶500mg,液氮速冻后加50mg P VP2K30,于液氮浴中磨成细粉;迅速将粉末移至10mL离心管,加入5mL预冷体积分数为10%的三氯乙酸丙酮溶液(含10mmol・L-1巯基乙醇),混匀;于-20℃沉淀1h以上;于4℃18000g离心15m in;沉淀用5mL预冷的丙酮(含10mmol・L-1巯基乙醇)按上述方法重悬、沉淀并离心,最后真空抽干所得的沉淀.1.3.2　蛋白质溶液制备　取50mg叶片蛋白质干粉,加入750μL裂解液[9mol・L-1尿素,40g・L-1 CHAPS,5g・L-1DTT,体积分数为2%Ampholine(pH3.5-10),40mmol・L-1Tris],于超声波清洗器中25℃水浴超声处理10×1.5m in,每次超声处理间隔期间振荡混匀30s;25℃16000g离心15m in,上清按Garrels[9]的方法测定蛋白质含量后,直接用于上样或-70℃贮存待用.1.4　等电聚焦1.4.1　管状I EF胶的制备　取2.06g尿素,加入0.75mL水,0.75mL体积分数为10%的Nonidet P240, 0.25mL Ampholine混合液[pH(3.5-10)∶pH(5-8)=1∶3],0.5mL丙烯酰胺凝胶单体储液(283.8g・L-1丙烯酰胺,16.2g・L-1N,N′2甲叉双丙烯酰胺);25℃水浴超声处理使之溶解后,10000g离心5s去除气泡,加入8μL体积分数为10%过硫酸铵和1.5μL TE ME D;混合后立即灌入长21c m、内径1.5mm的玻璃管中,胶长18c m;顶部用10μL水覆盖,室温下聚合1h以上.待胶充分聚合后,除去覆盖的水,用微量进样器将蛋白质溶液加到胶的顶部,上样量为120μg.先用10μL5mol・L-1尿素溶液覆盖,再加阴极电泳缓冲液至管口,随即进行电泳.1.4.2　等电聚焦电泳参数　阴极、阳极缓冲液分别为50mmol・L-1Na OH、25mmol・L-1H3P O4.28℃下,依次按300、400、500、600V各30m in,800V16h,1500V1h的电压梯度进行电泳.1.5　I EF胶的平衡电泳结束后,取出玻璃管用双蒸水漂洗后,用接上200μL微量移液器Ti p的注射器靠水压轻轻将胶条挤出,置于小平皿内,直接使用或-70℃暂存.进行第2向电泳前将胶条用平衡液[60mmol・L-1Tris2 HCl(pH6.8),20g・L-1S DS,体积分数为5%的巯基乙醇,体积分数为20%的甘油,0.5g・L-1溴酚蓝]平衡15m in,更换新鲜的平衡液再次平衡20m in,立即进行第2向聚丙烯酰胺凝胶电泳(S DS2P AGE).1.6　S D S2PAGE电泳凝胶规格为190mm×190mm×1.0mm,分离胶为120g・L-1聚丙烯酰胺凝胶,无浓缩胶.将平衡后的胶条平放于凝胶顶部,避免在二者间留下气泡,用40-50℃8g・L-1琼脂糖封好,于15℃,以每片胶15mA恒流电泳15m in,再以每片胶35mA恒流电泳直至溴酚蓝移至距胶底边约0.5c m处为止(约5-6h).1.7　蛋白质成像根据Shevchenko et al[10]的方法修改后进行银染.体积分数为50%的甲醇,5%乙酸溶液固定30m in; 50%甲醇溶液洗15m in;水洗3次,各10m in;0.2g・L-1硫代硫酸钠溶液浸泡2m in;水洗2次,各1m in;冰冷的1g・L-1硝酸银溶液于4℃浸泡20m in;水洗2次,各1m in;0.04%甲醛(37%溶液),20g・L-1无水NaCO3溶液显影,5%乙酸溶液停显,湿胶用透射法扫描成像.22　结果与讨论经过改变蛋白质裂解液及提取方法和第1向胶条的平衡液成分,适当提高等聚焦的最高电压并控制总伏时数等后,用I S O2DALT双向电泳方法经过质谱相容性银染后,分辨率得到明显提高,可以在单片S DS2P AGE胶上分辨出1200-1300个水稻叶片蛋白质(肽)斑点,等电点(p I)在3.5-9.3之间,相对分子质量在10-120ku之间.斑点形状规则,稳定性好且有较高的重复性,特别是阴极漂移现象得到有效控制(图1、2),基本可以满足水稻叶片蛋白组学分析及其相关分子生态学研究工作的需要.2.1　蛋白质样品制备蛋白质样品制备是双向电泳工作的基础,其质量直接影响电泳的分辨率、可靠性和重复性.对于水稻叶片组织,采用三氯乙酸与冷丙酮联用来沉淀蛋白质是个有效的方法,可以抑制蛋白酶的活性,避免蛋白881质的降解,还可除去脂类以及在植物组织中大量存在的色素、多酚等次生物质的干扰[11].但这种方法可能导致所制备的蛋白质干粉难以完全溶解.由于溶解液中高浓度的尿素在高于30℃时不稳定,分解产生的氰酸盐(cyanate )会引起氨基甲酰化,导致蛋白质荷电不均一,若提高溶解温度则影响等电聚焦的结果[12].为此,在25℃或更低温度下用水浴超声波处理来溶解样品,有效地解决了这个问题.但太低的温度(<20℃)可能引起尿素结晶析出,而影响蛋白质的溶解,因此,把第1向等电聚焦电泳的环境温度控制在28℃左右,以免蛋白质在电泳过程中沉淀.在整个操作过程中,都应尽量避免样品的过热与反复冻融.图1　改进后的水稻叶片蛋白双向电泳图谱Fig .1　Map of p r oteins fr om rice leaves by i m p r oved 22DE method 图2　改进前的水稻叶片蛋白双向电泳图谱Fig .2　Map of p r oteins fr om rice leaves by original 22DE method2.2　等电聚焦pH 梯度的稳定性在I S O 2DALT 系统中,第1向电泳是根据蛋白组分的p I 不同,在电场中会向其等电点移动的原理将蛋白质分离.因此,载体两性电解质所形成的pH 梯度的稳定性对电泳结果的稳定性和可重复性有非常重要的影响.本试验使用兼性离子去污剂CHAPS 代替裂解液中的Trit on X 2100并去除离子型去污剂S DS,在提高疏水性蛋白质溶解度的同时有效地减轻了阴极漂移现象.此外,凝胶单体储液的纯度对pH 梯度的稳定性也有很大的影响,陈旧的单体储液将导致严重的阴极漂移,因此等电聚集应使用新鲜配制的单体储液,储存时间最好不超过2周.2.3　蛋白质成像由于植物细胞内大部分蛋白质的表达丰度很低,高灵敏度的蛋白质成像技术对2D 电泳在蛋白质组学中的应用是一个重要环节.蛋白质2D 电泳的成像技术主要有考马斯亮蓝染色法、金属离子染色法和荧光染料染色法等.考马斯亮蓝与质谱分析的兼容性好,但灵敏度低,经典的考马斯亮蓝R 2250染色法的灵敏度仅为100ng 左右,即使是改进的胶体考马斯亮蓝G 2250染色法的灵敏度也只能达到10-50ng,大大制约了它在蛋白质组研究中的应用.银染法是金属离子染色法的代表,其灵敏度可以达到1ng,但银染法中常用的敏化剂中含有戊二醛,会导致蛋白质的肽链交联,将严重影响后续的质谱分析.本试验中所采用的银染方法不使用戊二醛作敏化剂,因此有较好的质谱兼容性,且灵敏度较高,是昂贵的荧光染料理想的替代方法.2.4　其它I S O 2DALT 系统涉及许多复杂的实验过程,很多因素都可能影响到最后的实验结果.为此还在实验细节上做了许多改进.第1向电泳上样时,在蛋白质样品上覆盖一层5mol ・L -1尿素溶液,以保护样品免受强碱性的阴极缓冲液影响.第2电泳之前,需对第1向胶条进行平衡,传统方法中这一时间长达30-120981第2期王经源等:I S O 2DALT 双向电泳方法的优化与改进福建农林大学学报(自然科学版)第35卷m in,在平衡过程中将导致蛋白质丢失、蛋白带变宽等[3],而不经平衡,又会导致高表达丰度蛋白纹理现象加剧,影响分辨率.因此,将平衡改为2次,在保证平衡效果的前提下缩短平衡时间.此外,必须指出的是,植物叶片组织蛋白质组分析中存在的最大问题仍然是蛋白样品的制备.大量RuBP羧化酶(Rubisco)蛋白的存在,严重制约了表达丰度低的蛋白的上样量,在双向电泳图谱上形成大的斑块,并可能导致垂直条纹,遮蔽了其它的蛋白点,从而大大地影响了低丰度蛋白的检出,还可能造成第1向胶局部pH梯度的改变,对此我们正在探索解决方法.参考文献:[1]杨何义,应万涛,钱小红.蛋白质组技术的研究进展[J].自然科学进展,2002,12(1):13-17.[2]曾建敏,林文雄,梁康迳,等.水稻对低剂量UV2B辐射胁迫的分子应答研究[J].应用生态学报,2003,14(6):941-944.[3]O′F ARRE LL P H.H igh res oluti on t w o2di m ensi onal electr ophoresis of p r oteins[J].J B i ol Che m,1975,250(10):4007-4021.[4]廖翔,应天翼,黄留玉,等.蛋白质组学研究中的双向电泳技术[J].生物技术通讯,2003,14(6):522524.[5]何瑞锋,丁毅,张剑锋,等.植物叶片双向电泳技术的改进与优化[J].遗传,2000,22(5):319-320.[6]孙国荣,彭永臻,阎秀峰,等.干旱胁迫对白桦实生幼苗叶片蛋白质的影响[J].林业科学,2003,39(4):151-154.[7]范宝莉,王振英,陈宏,等.小麦T型细胞质雄性不育系、保持系蛋白质双向电泳比较研究[J].实验生物学报,2004,37(1):45-49.[8]林文雄,金吉雄.水稻对UV2B辐射增强的抗性遗传及其生理生化特性研究[J].应用生态学报,1999,10(1):31-34.[9]G ARRE LS J I.Quantitative t w o2di m ensi onal gel electr ophoresis of p r oteins[J].M ethods Enzy mol,1983,100:411-423.[10]SHE VCHE NK O A,W I L M M,VOR M O,et al.Mass s pectr ometric sequencing of p r oteins silver2stained polyacryla m ide gels[J].Anal Che m,1996,68(5):850-858.[11]JOCE LY N K C R,S AJ I D B,JAM ES J G,et al.Tackling the p lant p r oteome:p racticeal app r oaches,hurdles and experi m en2tal t ools[J].Plant J,2004,39:715-733.[12]L I PP I N C OTT J,AP OST OL I.Carbamylati on of cysteine:a potential artifact in pep tide mapp ing of he mogl obins in the p res2ence of urea[J].Anal B i oche m,1999,267:57-64.(责任编辑:陈幼玉) 091。