第二章菌种
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第2章：发酵微生物菌种2007
2.原理的应用 A.初选、复选条件尽量接近“实际生产条件” (环境)，以免出现筛选工作之假象。 B.注意表型延迟 基因突变引起的表型变化在微生物繁殖、传代过 程中稳定下来，形成新的、稳定的遗传特征需要一定 时间。不稳定的表型改变将在这段时间内消失。 诱变与筛选之间要有足够长的时间间隔，让不稳 定的特征消失，保留稳定的特征。 即传代多次后才能筛选到稳定的高产突变株。
发酵工业的菌种
自然选育 原生质融合与 基因工程育种 常规诱 变育种
育种方法
菌种筛选
半理性 化筛选
抗代谢物调节
菌种管理
退化 原因 菌种 退化 防治退化 的方法
放线菌菌落
霉菌菌落
细菌菌落
种子罐
第2章： 发酵工业菌种
§2.1 高产菌种选育 概述
从自然界分离到的菌种，不能立即适应实际生产需要，通 过选育，得到适合工业化生产所需的优良菌种，才可以用于发 酵生产。 一.菌种选育的目的 “提高产量；改进品质；简化工艺”。 1.提高代谢产物产量：高产 2.改进产品质量：杂质少，分离纯化难度小。优质 3.简化工艺：对原料要求低；杂质少，工艺简单。高效 二.工业生产菌种的选育方法：5种 1.自然选育：从自然突变株中选育高效菌 2.常规诱变育种： 物理、化学诱变处理，摇瓶、琼脂块法筛选； 3.调节诱变育种：据代谢调节原理选育； 4.原生质融合育种：去细胞壁，质配+核配，遗传重组； 5.基因工程： DNA重组
§2.2
发酵微生物的分离样品采集！！
选择样品采集点时的注意事项： 要获得理想的目的菌，就必需考虑如何选择分离源 问题：自然界或人工环境有没有目的菌存在的可能性。 这就涉及“资源生态学” ，可以从以下几方面考虑。 一.温度、酸碱等极端环境 原理：微生物在特定的环境下生息繁衍，作为长期适 应这种环境的结果，它必然具有与之适应的代谢类型并产 生相应的代谢产物。
第二章、菌种的扩大培养2010
实例
放线菌(抗生素生产) 放线菌的细胞生长繁殖速度较慢， 放线菌(抗生素生产)：放线菌的细胞生长繁殖速度较慢，常 常用三级种子扩大培养， 常用三级种子扩大培养，即将种子罐中之菌丝移植到较大的 种子罐中扩大培养后，再移入发酵罐中， 种子罐中扩大培养后，再移入发酵罐中，这种流程称为三级 发酵。一般50t发酵罐多采用三级发酵， 50t发酵罐多采用三级发酵 发酵。一般50t发酵罐多采用三级发酵，有的甚至采用四级 发酵，如链霉素生产。 发酵，如链霉素生产。 霉菌（酶制剂）：酶制剂发酵生产也采用三级发酵。 ）：酶制剂发酵生产也采用三级发酵 霉菌（酶制剂）：酶制剂发酵生产也采用三级发酵。 细菌(谷氨酸)：谷氨酸及其他氨基酸发酵所用的菌种是细菌， 细菌(谷氨酸) 谷氨酸及其他氨基酸发酵所用的菌种是细菌， 生长繁殖速度很快，所以采用二级发酵。 生长繁殖速度很快，所以采用二级发酵。
第二节、 第二节、种子扩大培养
扩大培养的目的：为每次发酵罐的投料，提供相当 扩大培养的目的：为每次发酵罐的投料， 数量的代谢旺盛的种子，以提高发酵效率。 数量的代谢旺盛的种子，以提高发酵效率。 种子的要求：一定的数量、代谢旺盛、不能染菌。 种子的要求：一定的数量、代谢旺盛、不能染菌。 种子扩大培养流程如下： 种子扩大培养流程如下： 斜面菌种---一级种子摇床培养---二级种子罐培 斜面菌种---一级种子摇床培养---二级种子罐培 ---一级种子摇床培养------发酵罐 发酵罐。 养----发酵罐。
接种量的确定
大量地接入成熟的菌种， 大量地接入成熟的菌种，可以缩短生长过程的缓慢 因而缩短发酵周期， 期，因而缩短发酵周期，节约了发酵培养的动力消 提高了设备利用率，并有利于减少染菌机会。 耗，提高了设备利用率，并有利于减少染菌机会。 接种量过多也无必要，因种子培养费时， 接种量过多也无必要，因种子培养费时，而且过多 地移入代谢废物，反而会影响正常发酵。 地移入代谢废物，反而会影响正常发酵。 接种量与菌种的生长速度有关， 接种量与菌种的生长速度有关，如霉菌接种量一般 10%，酵母5 10%，细菌1 5%。 为10%，酵母5-10%，细菌1-5%。 接种量与菌液中菌体的浓度有关，如使用孢子接种， 接种量与菌液中菌体的浓度有关，如使用孢子接种， 接种量可明高的营养缺陷型突 根据代谢控制的要求， 变菌株或调节突变菌株或野生菌株； 变菌株或调节突变菌株或野生菌株； 抗噬菌体能力强的菌株，不易感染噬菌体； 抗噬菌体能力强的菌株，不易感染噬菌体； 菌种纯粹，不易变异退化， 菌种纯粹，不易变异退化，以保证发酵生产和产品 质量的稳定性； 质量的稳定性； 不是病源菌， 不是病源菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒 包括抗生素、激素和毒素等) 以保证安全。 素(包括抗生素、激素和毒素等)，以保证安全。
二章节菌种及其扩大培养4学时-PPT精选
斜面冰箱保藏法（低温）
➢ 短期、过渡的保藏方法 ➢ 新鲜斜面接种后，置最适条件下培养到菌体或孢子生
长丰满后，放在4°C冰箱保存。 ➢ 一般保存期为三个月到六个月。
11
第二章 菌种扩 大培养
沙土管保藏法（缺营养、低温）
适合于产孢子或芽孢的微生物。制备方法： ① 将沙与土洗净烘干过筛后，按沙与土的比例为1—2：
要从保藏在试管中的微生物菌种逐级扩大为生产 用种子，是一个由实验室制备到车间生产的过程。
种子液质量的优劣 对发酵生产起着关键性的作用
3
第二章 菌种扩 大培养
种子扩大培养 – 将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休 眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后， 再经扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养 而获得一定数量和质量的纯种。这些纯 种培养物称为种子。
8
第二章 菌种扩 大培养
菌种保藏的意义
菌种 –微生物学以及生命科学研究的基本材料 –世代时期很短，传代过程中易发生变异、死亡 –造成工业生产菌种的退化、使优良菌种丢失。
菌种保藏是微生物学研究和微生物育种工作的重要 组成部分
要采用最合适的保存方法使菌种的变异和死亡减少 到最低限度
9
第二章 菌种扩 大培养
1混合均匀，分装于小试管中，装料高度约为1厘米左 右，121°C间歇灭菌三次，灭菌试验合格后烘干备用。 一般沙用80目过滤，土用80一100目过筛。 ② 将斜面孢子制成孢子悬浮液接入沙土管中或将斜面孢 子刮下直接与沙土混合，置干燥器中用真空泵抽干， 放在冰箱内保存。一般保存期为一年左右。
12
第二章 菌种扩 大培养
22
第二章 菌种扩 大培养
2.2.2 种子罐级数的确定
种子罐级数： 是指制备种子需逐级扩大培养的次数。
➢ 短期、过渡的保藏方法 ➢ 新鲜斜面接种后，置最适条件下培养到菌体或孢子生
长丰满后，放在4°C冰箱保存。 ➢ 一般保存期为三个月到六个月。
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第二章 菌种扩 大培养
沙土管保藏法（缺营养、低温）
适合于产孢子或芽孢的微生物。制备方法： ① 将沙与土洗净烘干过筛后，按沙与土的比例为1—2：
要从保藏在试管中的微生物菌种逐级扩大为生产 用种子，是一个由实验室制备到车间生产的过程。
种子液质量的优劣 对发酵生产起着关键性的作用
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第二章 菌种扩 大培养
种子扩大培养 – 将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休 眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后， 再经扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养 而获得一定数量和质量的纯种。这些纯 种培养物称为种子。
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第二章 菌种扩 大培养
菌种保藏的意义
菌种 –微生物学以及生命科学研究的基本材料 –世代时期很短，传代过程中易发生变异、死亡 –造成工业生产菌种的退化、使优良菌种丢失。
菌种保藏是微生物学研究和微生物育种工作的重要 组成部分
要采用最合适的保存方法使菌种的变异和死亡减少 到最低限度
9
第二章 菌种扩 大培养
1混合均匀，分装于小试管中，装料高度约为1厘米左 右，121°C间歇灭菌三次，灭菌试验合格后烘干备用。 一般沙用80目过滤，土用80一100目过筛。 ② 将斜面孢子制成孢子悬浮液接入沙土管中或将斜面孢 子刮下直接与沙土混合，置干燥器中用真空泵抽干， 放在冰箱内保存。一般保存期为一年左右。
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第二章 菌种扩 大培养
22
第二章 菌种扩 大培养
2.2.2 种子罐级数的确定
种子罐级数： 是指制备种子需逐级扩大培养的次数。
第二章菌种选育3
基同步培养离心洗涤玻璃珠震荡分散过滤
单细胞或孢子悬浮液
诱
活菌计数
诱变处理 诱变处理预备实验
变
处理液活菌计数 平板分离
育
形态变异并计算其变异率
种
斜面培养
初筛、复筛 自然分离和再复筛
保藏及扩大试验
• 出发菌株的选择 • 诱变剂的选择 • 诱变操作（包括诱变剂量的选择） • 突变株的筛选 • 突变高产菌的表现及筛选条件的配合
步骤七
由第五步骤的第一区中划出第二区，如右上 图。
步骤八
重复第六以及第七步骤，由第七步骤的第二区中 划出第三区，如右上图。
步骤九
重复第六以及第七步骤，由第八步骤的第三区 中划出第四区，划满剩下的空间。完成后的营 养平板，如右上图。
步骤十
在营养平板上贴好标签， 标示好接种日期、操作者 姓名、菌种学名以及培养 基名称。
初筛：以量为主 复筛：以质为主
二、诱变育种
用各种物理、化学的因素人工诱发基因突 变。 诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质。
诱变剂
物理：紫外线，快中子 化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍 生物：噬菌体
诱变育种的主要环节 （1）以合适的诱变剂处理细胞悬浮液
——诱变 （2）用合适的方法淘汰负效应变异株，
选出性能优良的正变异株——筛选
变异株 代谢控制育种
基因工程定向育种
微生物工业对大规模生产用菌的要求原则：
（1）所需培养基易得，价格低廉； （2）培养和发酵条件温和（糖浓度、温度、pH、
溶解氧、渗透压等） （3）生长速度和反应速度较快，发酵周期短 （4）单产高 （选择野生型、营养缺陷型或调节
突变株）
（5）抗病毒能力强 （6）菌种纯粹，不易变异退化，稳定性好 （7）菌体不是病源菌，不产生任何有害的生
第二章 菌种的筛选、选育和保藏
1、能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高 效地合成产物。 2、有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌 种改造的可操作性要强。 3、遗传性能要相对稳定。 4、不易感染它种微生物或噬菌体。 5、产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上 最好与致病菌无关）。 6、生产特性要符合工艺要求。
菌种的筛选、选育和保藏
造成变异的原因是有： 长期保藏，频繁的传代，菌体在代谢过程中产生具有诱变 作用的物质，诱发DNA结构的改变。DNA中存在的增变基因 也可能诱发自然突变等。 由于引起变异的因素一般不很剧烈，而且变异了的基因要 通过繁殖时DNA复制传给子代，使突变基因在数量上增加 到占优势时，才能使群体表现出性状的变异来，可以看出 这是一个缓慢渐变的过程。
发酵工业菌种的分离、筛选 二、菌种获得的途径
1、从菌种保存机构直接购买 2、从自然界中筛选 3、在生产过程中发酵分离筛选的步骤
定方案--样品采集--样品预处理--目的菌富集培养-菌种分离--菌种初筛--菌种复筛--菌种发酵性能鉴定
菌种的筛选、选育和保藏
发酵工业菌种的分离、筛选 定方案
菌种的筛选、选育和保藏
菌种的选育 （一）、诱变剂和诱变处理（见书P38） 物理诱变剂：射线如紫外线、X—射线、γ—射线，
快中子； 物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外线。 许多高产菌株的选育都用过紫外线，对于一般实验室、 中小型工厂都适用，也很安全。 其他的几种射线都是电离性质的，有一定的穿透力，一 般都由专业人员在专门的设备中使用，否则有一定危险 性。
目的:经过富集的微生物虽然在数量上占优势,但是得到的 培养物还是多种微生物的混合物,所以需要进行菌种的分 离。 常用的分离方法有： 1、平板划线分离法 2、稀释分离法 3、简单平板分离法 4、涂布分离法 5、毛细管分离法 6、小滴分离法
菌种的筛选、选育和保藏
造成变异的原因是有： 长期保藏，频繁的传代，菌体在代谢过程中产生具有诱变 作用的物质，诱发DNA结构的改变。DNA中存在的增变基因 也可能诱发自然突变等。 由于引起变异的因素一般不很剧烈，而且变异了的基因要 通过繁殖时DNA复制传给子代，使突变基因在数量上增加 到占优势时，才能使群体表现出性状的变异来，可以看出 这是一个缓慢渐变的过程。
发酵工业菌种的分离、筛选 二、菌种获得的途径
1、从菌种保存机构直接购买 2、从自然界中筛选 3、在生产过程中发酵分离筛选的步骤
定方案--样品采集--样品预处理--目的菌富集培养-菌种分离--菌种初筛--菌种复筛--菌种发酵性能鉴定
菌种的筛选、选育和保藏
发酵工业菌种的分离、筛选 定方案
菌种的筛选、选育和保藏
菌种的选育 （一）、诱变剂和诱变处理（见书P38） 物理诱变剂：射线如紫外线、X—射线、γ—射线，
快中子； 物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外线。 许多高产菌株的选育都用过紫外线，对于一般实验室、 中小型工厂都适用，也很安全。 其他的几种射线都是电离性质的，有一定的穿透力，一 般都由专业人员在专门的设备中使用，否则有一定危险 性。
目的:经过富集的微生物虽然在数量上占优势,但是得到的 培养物还是多种微生物的混合物,所以需要进行菌种的分 离。 常用的分离方法有： 1、平板划线分离法 2、稀释分离法 3、简单平板分离法 4、涂布分离法 5、毛细管分离法 6、小滴分离法
发酵工程第二章发酵工业菌种
④抑菌圈法 抑菌圈法所用的工具菌是一些抗生素的敏 感菌。将待检菌涂布于含高浓度的工具菌的平板培养基 上进行培养，若被检菌能分泌某些抑制工具菌生长的物 质，如抗生素等，就会在被检菌的菌落周围形成工具菌 不能生长的抑菌圈，从而使被检菌很容易被鉴别出来。 采用抑菌圈法，不仅能筛选抗生素，还能筛选某些酶类。 例如，Meevootison等提出一套利用抑菌圈筛选青霉素 酰化酶产生菌的方法。工具菌是一种对6-氨基青霉烷酸 敏感而对苄青霉素有抗性的黏性沙雷氏菌，这种菌只有 当苄青霉素尚未被别种微生物的青霉素酰化酶转化为6氨基青霉烷酸时才能生长。将工具菌与苄青霉素混合于 平板培养基中，然后将待检菌涂布于平板上，进行培养， 周围出现抑菌圈的菌落就是青霉素酰化酶产生菌。
③生长圈法 生长圈法所用的工具菌是一些营 养缺陷型菌株。将待检菌涂布于含高浓度的工 具菌并缺少工具菌所需营养物的平板培养基上， 进行培养，若某菌株能合成工具菌所需营养物， 在该菌株的菌落周围就会形成一个浑浊的生长 圈。 例如，用嘌呤缺陷型大肠杆菌作为工具菌，与 不含嘌呤的培养基混合倒平板，在平板培养基 上涂布含菌样品并恒温培养，周围出现生长圈 的菌落即为嘌呤产生菌。
养后，在数量上占优势。
分离：利用分离技术得到纯种。 菌种的筛选： 通过常规生产性能测定，进一步筛选产物合成能
力较高的菌株。
发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养
特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、 耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。
菌种保藏
等。
第二节 发酵工业菌种的分离筛选
菌种的来源
根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种 保藏部门索取或购买；
第二章 生产菌种的来源
4、其他防线菌生产的抗生素
其他生产的抗生素的防线菌有： 诺卡氏 其他生产的抗生素的防线菌有 ： 菌 形 放 线 菌 （ Nocardioform Actinomycetes ） 、 游 动 放 线 菌 （ Actinoplanetes ） 及 足 分 枝 菌 （Maduromyetes）。
5、青霉属（Penicillum） 青霉属（
6、粘细菌（Myxobacteria） 粘细菌（
粘细菌次级代谢产物中抗菌活性物质的检 出率非常高，并且许多都是新发现的抗生素。 出率非常高 ， 并且许多都是新发现的抗生素 。 如纤维素堆囊菌（ 如纤维素堆囊菌 （ Sorangium cellulosum ） 产 生的大环内酯类抗生素堆囊菌素、 生的大环内酯类抗生素堆囊菌素、
四、有机酸
柠檬酸 :黑曲霉 ,酵母 (解脂假丝酵母 、解脂 复膜孢酵母季也蒙假丝酵母 ） 乳酸 ：德氏乳杆菌 、赖氏乳杆菌 、植物乳杆 菌 、米根霉 苹果酸 ：黄曲霉 、米曲霉 、寄生曲霉 、华根 无根根霉、 霉 、无根根霉、膜醭毕赤酵母 衣康酸 ：土曲霉 、衣康酸曲霉、假丝酵母S-10 衣康酸曲霉、假丝酵母S
青霉菌属于腐生菌， 青霉菌属于腐生菌，广泛生存于土壤和 腐败的水果和蔬菜中。 腐败的水果和蔬菜中。 由于第一个工业化生产的抗生素青霉素是 中发现的， 由青霉属中的Penicillum notatum中发现的， 至今青霉素极其半合成抗生素仍是产量最大、 至今青霉素极其半合成抗生素仍是产量最大、 用途最广的抗生素， 用途最广的抗生素，因此青霉素在抗生素工 业中具有特别重要的地位。 业中具有特别重要的地位。
纤维素酶
纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的 总称。它不是单种酶， 总称。它不是单种酶，而是起协同作用的多组分 酶系。 酶系。 纤维素酶是由绿色木霉、康氏木霉、黑曲霉、 纤维素酶是由绿色木霉、康氏木霉、黑曲霉、 青霉和根霉等菌株经深层发酵制成的酶制剂产品。 青霉和根霉等菌株经深层发酵制成的酶制剂产品。 此外，漆斑霉、反刍动物瘤胃菌、嗜纤维菌、 此外，漆斑霉、反刍动物瘤胃菌、嗜纤维菌、产 黄纤维单孢菌、侧孢菌、黏细菌、 黄纤维单孢菌、侧孢菌、黏细菌、梭状芽孢杆菌 等也能产生纤维素酶。 等也能产生纤维素酶。
第二章发酵工业微生物菌种ppt课件
2019
-
7
(1) 曲霉属(Asprgillus)：曲霉种类繁多、分布 广泛，工业上利用曲霉生产各种酶制剂和有机 (2) 青霉属（Penicillium）：j既是使果实腐 酸。如米曲霉（ Asp. oryzae）用于酿酒和L败和实物变坏的有害菌，又是青霉素后葡萄 乳酸生产。制酱油用的酱油曲霉以及制造柠檬 糖酸的产生菌。 酸、草酸、葡萄糖酸和糖化酶、酸性蛋白酶、 (3) 根霉属（Rhizopus）：用于米酒、黄 果胶酶、单宁酶等的黑曲霉 (Asp. niger)。 酒生产。此外，广泛用作淀粉糖化菌、有机 酸发酵以及甾体转化等许多方面。 (4) 毛霉属（Mucor）：产生蛋白酶，有分 解大豆蛋白的能力。腐乳、酱油、转化甾族 化合物。土曲霉：衣康酸
11
连续培养菌种的筛选 比生长速率(u):每克菌体每小时增长的 菌体量.u=1/XdX/dt.
2019
-
12
比生长速率u
A B
r
2019 -
基质浓度
13
限 制 性 基 质
当进行流加时基质浓度<r 时,A菌先被洗出; 当进行流加时基质浓度>r 时,,B菌先被洗出;
培养液
固体培养法
2019 14
2.随机分离方法 （1）.抗生素产生菌筛选 试验菌的灵敏性，以及与抗生素有关的酶、 酶的抑制剂（例如棒酸）、激活剂、抗体 等建立起来的高灵敏度、专一的检测技术。 （2）.药理活性化合物的筛选 （3）.生长因子产生菌的筛选 （4）.多糖生产菌的筛选 （5）.免疫激活剂产生菌的分离
2019
-
3
(3) 乳酸菌：由糖类生成乳酸的一类细菌总称为乳 酸菌，有乳链球菌和乳酸杆菌之分，主要用来制 造乳制品。凡发酵产物中只有乳酸者，称为同型 乳酸发酵；凡发酵产物中除乳酸外还有乙酸等和 CO2者，称为异型乳酸发酵。肠膜状明串珠菌属 于乳酸菌族，是制药工业生产有旋糖酐的重要菌。 (4) 大肠杆菌：工业上利用大肠杆菌的谷氨酸 脱羧酶，进行谷氨酸定量分析。还可以利用 大肠杆菌制取天冬氨酸、苏氨酸和缬氨酸等。 医药方面用它制造治疗白血症的天冬酰胺酶。 另外，在研究细菌遗传变异方面，以及构建 基因工程菌时，大肠杆菌是理想的研究材料。
农业固体废弃物处理第二章菌种分离技术
盖（2-20cm）、菌柄（2-6cm），偏生。 孢子椭圆形、孢子印白色。
目前该属有40多种，栽培10多个种。
糙皮侧耳
二、生长发育条件
• 营养 1.能分泌纤维素、半纤维素、木质素、
果胶酶； 2.氮源：铵盐、硝酸盐、尿素、氨基
酸、蛋白胨； 3.矿质元素:钙、镁、磷、钾。
2、温度
• 菌丝生长温度：5-35度，最适宜温度25
12、麦秆80%、麸皮15%、糖1%、石灰 4%、克霉灵0.1%；
13、豆杆粉78%、棉籽壳20%、石灰2%、 克霉灵0.1%；
14、玉米芯85%、稻糠10%、石灰3%、 石膏1%、糖1%、克霉灵0.1%；
15、玉米芯90%、玉米面6%、尿素0.5%、 二铵0.5%、石灰3%、克霉灵0.1%；
三、栽培方法
注意事项
1、转管最多不能超过5代，否则出现菌 种退化； 2、每个斜面可转接20-30母种和5-8瓶 原种。
二、二、三级种（原种）的扩繁技 术
1、二、三级种的培养基 （1）木屑培养基 木屑78%，麦麸20%，石膏1%，蔗糖1%，含水量
60-65%； （2）玉米芯培养基 玉米芯75%，糠麸20%，石膏2%，过磷酸钙2%，糖
4、棉籽壳70%、稻草15%、麸皮12%、糖1%、 石膏1%、过磷酸钙1%、克霉灵0.1%；
5、木屑67%、棉籽壳20%、麸皮10%、尿素 0.5%、石灰2%、克霉灵0.1%；
6、木屑82%、麸皮10%、石膏3%、过磷酸钙 2.5%、石灰2%、尿素0.5%、克霉灵0.1%；
7、稻草76%、麸皮20%、糖1%、过磷酸钙2%、 石膏1%、克霉灵0.1%；
（1）多孢分离法
• 孢子弹射法
(2)单孢子分离法
• 多采用连续稀释法 稀释至毎滴水含有1-2个孢子；
目前该属有40多种，栽培10多个种。
糙皮侧耳
二、生长发育条件
• 营养 1.能分泌纤维素、半纤维素、木质素、
果胶酶； 2.氮源：铵盐、硝酸盐、尿素、氨基
酸、蛋白胨； 3.矿质元素:钙、镁、磷、钾。
2、温度
• 菌丝生长温度：5-35度，最适宜温度25
12、麦秆80%、麸皮15%、糖1%、石灰 4%、克霉灵0.1%；
13、豆杆粉78%、棉籽壳20%、石灰2%、 克霉灵0.1%；
14、玉米芯85%、稻糠10%、石灰3%、 石膏1%、糖1%、克霉灵0.1%；
15、玉米芯90%、玉米面6%、尿素0.5%、 二铵0.5%、石灰3%、克霉灵0.1%；
三、栽培方法
注意事项
1、转管最多不能超过5代，否则出现菌 种退化； 2、每个斜面可转接20-30母种和5-8瓶 原种。
二、二、三级种（原种）的扩繁技 术
1、二、三级种的培养基 （1）木屑培养基 木屑78%，麦麸20%，石膏1%，蔗糖1%，含水量
60-65%； （2）玉米芯培养基 玉米芯75%，糠麸20%，石膏2%，过磷酸钙2%，糖
4、棉籽壳70%、稻草15%、麸皮12%、糖1%、 石膏1%、过磷酸钙1%、克霉灵0.1%；
5、木屑67%、棉籽壳20%、麸皮10%、尿素 0.5%、石灰2%、克霉灵0.1%；
6、木屑82%、麸皮10%、石膏3%、过磷酸钙 2.5%、石灰2%、尿素0.5%、克霉灵0.1%；
7、稻草76%、麸皮20%、糖1%、过磷酸钙2%、 石膏1%、克霉灵0.1%；
（1）多孢分离法
• 孢子弹射法
(2)单孢子分离法
• 多采用连续稀释法 稀释至毎滴水含有1-2个孢子；
微生物菌种
虽然遗传工程等新的育种方法迅速发展，但诱变育种仍是目 前广泛使用的育种手段。
《发酵工程》
第二章 微生物菌种选育
原始菌株（出发菌株）
活细胞计数 诱变剂处理 活细胞计数 中间培养
突变株分离
诱变预备处 理
初筛 复筛 生产性能试验
工业微生物来源
想菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需
菌株。
从自然界采集分离。
从一些发酵制品中分离目的菌株。
《发酵工程》
第二章 微生物菌种选育
微生物菌种的选择性分离
工业化菌种的要求
能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合 成产物； 有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造 的可操作性要强；
分离耐高渗透压酵母菌，可到甜果、蜜饯、甘蔗渣堆积处采样
《发酵工程》
第二章 微生物菌种选育
目的微生物富集的一些基本方法
让目的微生物在种群中占优势，使筛选变 富集的目的： 得可能。
富集的三种方案：
定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的
条件（加热、膜过滤等），进行培养。
当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分
能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明 圈，圈的大小初步反应菌株利用底物的能力。
分离水解酶产生菌时较多采用，如蛋白酶、淀粉酶、 脂肪酶、核酸酶等；
《发酵工程》
第二章 微生物菌种选育
例如用此法分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌 土壤经巴氏消毒，以减少不产芽孢的微生物；然 后铺在pH8-9的琼脂培养基（含有均匀的不溶性蛋白 质）表面；碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性 蛋白质，产生一透明圈。
遗传性能要相对稳定；
不易感染它种微生物或噬菌体； 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与 致病 菌无关）； 生产特性要符合工艺要求。
第二章菌种的选育
依（选照3种）资子根料的据或类待专型选家。种介如子绍研的，究生结抗理合菌学自素与己，生所可态学 掌特选握性择的，放知确线识定菌及培、工养真作基菌经，、验选细，择菌明培确养待条选件与 种方子法在。自然界的分布情况，确定采 样目标。 （4）在上述准备工作完成之后，制定具
体的筛选方案与操作步骤：
进行综合、具体问题分析来决定。
2. 快中子 快中子的生物学效应是由其撞击原
子核后产生的质子产生的。 能够引起较多的点突变和染色体变， 而产生诱变育种的效应。
3.氮芥(p40) 机理：氮芥的盐酸盐和碳酸氢钠
反应释放出氮芥子气，再与细胞作 用引起染色体发生畸变。
使用方法： 活化剂和解毒剂的配置 氮芥的盐酸盐配置 诱变作用 诱变终止
第二章菌种的选育
内容 1.菌种的来源 2. 菌种的选育 3. 菌种的保藏
2.1 菌种的来源 微生物具有的五大特性 1.种类多,分布广; 2.比面积大,代谢能力强; 3.生长迅速,繁殖快; 4.适应性强,容易培养; 5.易变异.
2.1.1生物物质产生菌的筛选 2.1.1.1微生物---生物产物的来源 两个成功因素
分生孢子
4.重组体的形成 异核体菌落在生长过程中，染色体
重叠的两节段（二体区）的不同位置发 生交换后能 产生重组体孢子。
+ 重组体
2.6.2.1放线菌的杂交技术 1.混合培养法 a.选择性平板法 b.异核系分析法
2.平板杂交法
3.玻璃纸转移法 成功报道：金霉素、土霉素、新霉素、红 霉素、新霉素等抗生素杂交育种方面。
1. 指示菌 大肠杆菌BR513(ATCC33313) 2.指示微生物培养 3.指示微生物倒固体检测平板 入ß-半乳糖苷酶的生色基质混合物 （84mg褪蓝RR和14mg6-溴-2萘-β-D半乳糖吡喃糖苷于2ml二甲基亚砜中）， 再加入琼脂静置，观察颜色变化情况。
体的筛选方案与操作步骤：
进行综合、具体问题分析来决定。
2. 快中子 快中子的生物学效应是由其撞击原
子核后产生的质子产生的。 能够引起较多的点突变和染色体变， 而产生诱变育种的效应。
3.氮芥(p40) 机理：氮芥的盐酸盐和碳酸氢钠
反应释放出氮芥子气，再与细胞作 用引起染色体发生畸变。
使用方法： 活化剂和解毒剂的配置 氮芥的盐酸盐配置 诱变作用 诱变终止
第二章菌种的选育
内容 1.菌种的来源 2. 菌种的选育 3. 菌种的保藏
2.1 菌种的来源 微生物具有的五大特性 1.种类多,分布广; 2.比面积大,代谢能力强; 3.生长迅速,繁殖快; 4.适应性强,容易培养; 5.易变异.
2.1.1生物物质产生菌的筛选 2.1.1.1微生物---生物产物的来源 两个成功因素
分生孢子
4.重组体的形成 异核体菌落在生长过程中，染色体
重叠的两节段（二体区）的不同位置发 生交换后能 产生重组体孢子。
+ 重组体
2.6.2.1放线菌的杂交技术 1.混合培养法 a.选择性平板法 b.异核系分析法
2.平板杂交法
3.玻璃纸转移法 成功报道：金霉素、土霉素、新霉素、红 霉素、新霉素等抗生素杂交育种方面。
1. 指示菌 大肠杆菌BR513(ATCC33313) 2.指示微生物培养 3.指示微生物倒固体检测平板 入ß-半乳糖苷酶的生色基质混合物 （84mg褪蓝RR和14mg6-溴-2萘-β-D半乳糖吡喃糖苷于2ml二甲基亚砜中）， 再加入琼脂静置，观察颜色变化情况。
第二章菌种选育、保藏与复壮
（一）样品采集
① 原则
样品来源越广泛，获得新菌种的可能性越大。
② 土壤采样方法
土壤的细有菌机、质放线含菌量：和耕通地风、状菜园况和（近5～郊土25壤cm；深度） 土壤的酵p母H和菌植：果被园状树况根的土壤中；
•pH＜7.0 ：霉菌、酵母菌居多 地理条霉件 菌：动植物残体及霉腐土层中； 季•p节H7.条0黑件～曲7.霉5：：细稻菌场、、谷放物线堆菌积丰处富。
黑曲霉
黑曲霉 栖土曲霉 根霉 毛霉 青霉菌 木霉菌 黄曲霉菌 红曲霉
产物 谷氨酸 肌苷酸 淀粉酶 蛋白酶
葡萄糖异构酶
酒精 单细胞蛋白 乳糖酶 柠檬酸 柚苷酶、酸性蛋白
酶 单宁酶、糖化酶 蛋白酶 糖化酶、甾体激素 蛋白酶 葡萄糖氧化酶 纤维素酶 淀粉酶 糖化酶、红曲色素
用途 食用、医药 食用、医药 葡萄糖、糊精、酒精发酵、啤酒酿造 酱油速酿、饲料
❖ 控制传代次数：不超过7代，易变异的不过5代 ❖ 砂土管、冻干管保藏的原种，开启不能超过3次，以防污染。 ❖ 选择良好保藏方法：保证菌不死、不衰、保存活性及原有典型性状 ❖ 良好的培养条件：注意斜面菌株的培养条件（保藏、活化培养基） ❖ 采用不同类型的细胞进行接种
产孢子霉菌 细菌
二、菌种的复壮
❖ 自然选育的定义
利用微生物在一定条件下产生自发变异，通过分离、筛选，排除劣质性 状的菌株，选择出维持原有生产水平或具有更优良生产性能的高产菌株， 达到纯化与复壮菌种、保持稳定生产性能的目的。其主要原理是微生物 群体分离。
❖ 自然选育的方法
（1）通过表现形态淘汰不良菌株； （2）考察目的代谢产物产量； （3）进行遗传基因型纯度试验，考察菌种纯度； （4）传代稳定性试验：斜面传3-5代。
❖ 菌种退化的主要表现 ① 产量下降，目的代谢产物减少，原料转化率下降； ② 生长速度缓慢，目的代谢产物合成能力下降，发酵周期延长； ③ 产孢子能力变弱，孢子形成数量减少； ④ 抗逆性减弱； ⑤ 形态畸形等。
第二章 微生物菌种选育
第二章 微生物菌种选育
• 优良的菌种是发酵工业的基础和关键，是 显著改善和提高产品种类、产量以及质量 的先决条件。 • 菌种选育，就是要利用微生物的遗传变异 的特性，采用各种手段，改变菌种的遗传 性状，使其符合工业生产的需要。
本章主要内容
• 第一节 微生物发酵工业的菌种类型及来源 • 第二节 微生物发酵高产菌种选育 • 第三节 菌种的退化和菌种保藏
土样的采集方法
使预被分解的物质成为唯一的碳源或氮源 pH7.0～7.5适于细菌和放线菌，pH4.5 ～6适于霉 菌和酵母 40℃利于放线菌孢子萌发，却不利于细菌生长 限制通入氧气使厌氧菌数量增加
采用平板划线法和稀 通过压力（高温、高压、抗生素）使非目的的 释法，以时间为变量， 类群比例减少 进行纯种分离
从一些发酵制品中分离目的菌株，如酒醪中 分离淀粉酶或糖化酶的产生菌，从酱油中分 离蛋白酶产生菌，从噬菌体污染的发酵液中 分离抗噬菌体的发酵菌株等。
三、菌种微生物的选择性分离
• 菌株的分离和筛选分为以下几步：
采 样 富 集 分 离 筛 选
各种生境下的土壤是 微生物菌种最全面的 来源 人为控制条件使所期 待的目的菌种占据优 势
是单产高的营养缺陷型突变菌株或调节突变菌株或野生菌株，最 好还是抗噬菌体能力强的菌株
菌种纯粹，不易变异退化，以保证稳定性
菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素（包括 抗生素、激素、毒素等），以保证安全
类型：包括细菌、酵母菌、霉菌和放线菌等类群，还有担子菌及藻类等
一、工业发酵常见的微生物种类
担子菌就是人们常说的菇类（mushroom）微生物。
担子菌资源的利用正引起人们的重视，如多糖、 橡胶物质和抗癌药物的研发。
6、藻类（alga）
• 优良的菌种是发酵工业的基础和关键，是 显著改善和提高产品种类、产量以及质量 的先决条件。 • 菌种选育，就是要利用微生物的遗传变异 的特性，采用各种手段，改变菌种的遗传 性状，使其符合工业生产的需要。
本章主要内容
• 第一节 微生物发酵工业的菌种类型及来源 • 第二节 微生物发酵高产菌种选育 • 第三节 菌种的退化和菌种保藏
土样的采集方法
使预被分解的物质成为唯一的碳源或氮源 pH7.0～7.5适于细菌和放线菌，pH4.5 ～6适于霉 菌和酵母 40℃利于放线菌孢子萌发，却不利于细菌生长 限制通入氧气使厌氧菌数量增加
采用平板划线法和稀 通过压力（高温、高压、抗生素）使非目的的 释法，以时间为变量， 类群比例减少 进行纯种分离
从一些发酵制品中分离目的菌株，如酒醪中 分离淀粉酶或糖化酶的产生菌，从酱油中分 离蛋白酶产生菌，从噬菌体污染的发酵液中 分离抗噬菌体的发酵菌株等。
三、菌种微生物的选择性分离
• 菌株的分离和筛选分为以下几步：
采 样 富 集 分 离 筛 选
各种生境下的土壤是 微生物菌种最全面的 来源 人为控制条件使所期 待的目的菌种占据优 势
是单产高的营养缺陷型突变菌株或调节突变菌株或野生菌株，最 好还是抗噬菌体能力强的菌株
菌种纯粹，不易变异退化，以保证稳定性
菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素（包括 抗生素、激素、毒素等），以保证安全
类型：包括细菌、酵母菌、霉菌和放线菌等类群，还有担子菌及藻类等
一、工业发酵常见的微生物种类
担子菌就是人们常说的菇类（mushroom）微生物。
担子菌资源的利用正引起人们的重视，如多糖、 橡胶物质和抗癌药物的研发。
6、藻类（alga）
第二章 食用菌的分类
(2)干制标本。 对木质、木栓质、革质、半肉质和其它含水分少不 易腐烂的标本，可作干制标本。 作法：先用太阳晒、风干、微火烘烤、或者采用红 外灯照射、恒温干燥箱烘干。烘干的标本待其自然 吸收空气中水分片刻，再用纸包好、标明编号，放 于有防虫、防霉的标本盒和标本柜内；在标本盒或 者袋外贴上标签，注明其菌名、编号，采集地点， 日期和采集人等，以便查找。
是指含有毒性物质人们误食后发生中毒反应的大型真菌又称为毒菇毒蕈类型胃肠型致幻型肝损型溶血型呼吸与循环衰竭型光过敏性皮炎型胃肠型致幻型肝损型溶血型呼吸与循环衰竭型光过敏性皮炎型33胃肠型80余种毛头乳菇细褐鳞蘑菇毒红菇赭红口蘑34臭黄菇毒粉褶菌极毒返回本节35豹斑毒伞哈蟆菌神经致幻型60余种返回本节36半卵形斑褶菇白毒鹅膏红蝇伞返回本节37溶血型较少鹿花毒菌毒鹅膏返回本节鹿花菌味道极鲜美但如河豚般危险有致命巨毒关键要漂洗鹿花菌味道极鲜美但如河豚般危险有致命巨毒关键要漂洗38肝损型20余种白毒伞毒鹅膏残托斑毒伞鳞柄白毒伞中毒后引发内出血死亡率极高又称致命小天使11毒菌种类及识别鹅膏属毒菌
特点 种类少，经济价值高，多为野生菌。
麦角菌目、麦角菌科 — 冬虫夏草 子 囊 菌 马鞍菌科 盘菌目 马鞍菌属 — 马鞍菌 鹿花菌属— 鹿花菌
羊肚菌科、羊肚菌属—羊肚菌 块菌目、块菌科、块菌属 — 块菌
17
18
马鞍菌
19
20
鹿花菌
羊肚菌
21
夏块菌
22
（二）担子菌亚门
耳类（木耳、银耳、桂花耳）
多为担子菌亚门、伞菌目、鹅膏科、鹅膏属
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胃肠型
致幻型
类型
肝损型
溶血型
呼吸与循环衰竭型
光过敏性皮炎型
胃肠型（80余种）