生物分离工程-第二章-细胞破碎(医学相关)
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第2章 细胞分离与破碎
生物分离工程-第二章：细胞分离与破碎
a
b
c d e
生物分离工程-第二章：细胞分离与破碎
杂蛋白质的其它去除方法
加热 使杂蛋白质变性，因其溶解度降低而除去，但要 使杂蛋白质变性，因其溶解度降低而除去， 考虑是否影响目标产物的热稳定性 如在枯草杆菌发酵液中， 吸附 如在枯草杆菌发酵液中，常加入氯化钙和磷酸氢 二钠，以除去杂蛋白、菌体及其它不溶性粒子 二钠，以除去杂蛋白、 加入蛋白质沉淀剂 蛋白质能与一些阴离子如三氯乙酸 水杨酸盐等形成沉淀，也能与一些阳离子如Ag+ Ag+、 盐、水杨酸盐等形成沉淀，也能与一些阳离子如Ag+、 Cu2+、Zn2+等形成沉淀 Cu2+、Zn2+等形成沉淀
A 即：φs = (2.9) AP
f( ε )=ε -4.65 , (2.10)
ε --悬浮液的空隙率
由于菌体细胞体积小， 由于菌体细胞体积小，沉降 速度很慢， 速度很慢，实际应用时需加 中性盐或 入中性盐或高分子絮凝剂 （如聚丙烯酰胺或聚乙烯亚 ），使菌体间凝聚成较大 胺），使菌体间凝聚成较大 颗粒，提高沉降速度。 颗粒，提高沉降速度。
预处理的目的
改变发酵液的物理性能， 改变发酵液的物理性能，促进从悬浮液中分离固形物 的速度，提高固液分离器的效率； 的速度，提高固液分离器的效率； 尽可能使产物转入便于后处理的某一相中( 尽可能使产物转入便于后处理的某一相中(多数为液 相)； 去除发酵液中产分杂质， 去除发酵液中产分杂质，以利于后续各步操作
A2 ∆p (1- β cs ) dQ = dt µ L (Q +Q0 ) ρ Lα cs 恒压条件下： (Q +Q0 ) 2 = K (t +t0 ) 其中： A2 ∆p (1-βcs ) K= (2.34) µ Lρ L αcs 上式中，cs为料液中固形成分(形成滤饼) 的含量，β 为湿滤饼和干滤饼的质量比， Q0为形成相当于过滤介质阻力的滤饼时 透过的虚拟滤液体积，0为透过虚拟滤液 t 量Q0 所需的虚拟时间。 对2.33微分可得： dt 2Q 2Q0 = + 2.35 dQ K K 由2.35式可计算K 和Q0 (2.33) (2.32)
生化分离技术 第二章 细胞的破碎
第二节 细胞壁的破碎
破碎率是选择细胞破碎设备的重要依据之一. 在用球磨法破碎细胞的过程中,影响因素有以下几个方 面: (1)搅拌器外缘速率 搅拌器速度增加,剪切力增大, 细胞破碎量增大,但是高的能量消耗,高的热量产生和磨球 的磨损以及因剪切力引起产物失活,因此对于给定处理量和 对蛋白质的释放要求下,存在着最佳效率点.实际生产中, 搅拌器外缘速率控制在(5～15)m/s之间.
1 x = exp(kt )
式中 x——为释放蛋白质的分率; k——为蛋白质释放常数,min-1; t——为超声波发射时间,min.
(2-5)
蛋白质释放常数k取决于输入声能,由实验确定.对于 从啤酒酵母悬浮液中(200kg湿重/m3悬浮液),用190声瓦的 20HZ声频的超声波处理时: k=b(P-P0)0.9 (2-6)
第二节 细胞壁的破碎
式中 b——为常数; P——为输入功率,J/(kg.s); P0——为由超声波引起的空穴的临界功率,J/(kg.s). 当超声波声能通过探头向悬浮液传递能量,当产生的气 泡破裂时,绝大部分释放出的能量都以热的形式为液体吸收, 为避免高温,在破碎池中设计了冷却水夹套,并在开始时先 把悬浮液冷却至0℃～5℃,并不断将冷却液连续通过夹套, 短期的声波破碎与短期的冷却交替进行操作,以防止高温使 蛋白质变性. 为提高破碎效率,在破碎池中可添加细小的球粒(可以 是钢制的或玻璃的),以产生"研磨"效应,提高细胞破碎 率. 超声波破碎是实验室常用的一种普通方法,由于向大量 的悬浮液中输入足够的能量有一定的困难,因此在工业还未 采用.
第二节 细胞壁的破碎
Y % = [ ( N 0 N ) N 0 ] ×100%
式中 N0——原始细胞数量; N——经t时刻操作后保留下来的未受损害完整细胞的数 量. N0和N可由直接计数法和间接法求得. 直接计数法是直接对稀释后的样品用血球计数器或平板菌落计 数法进行计数. 间接计数法是在细胞破碎后,将悬浮液离心分离,除去细 胞碎片,未破碎的细胞及其他悬浮物,然后对清液进行蛋白质 含量或酶的活性进行分析.通过细胞释放出来的化合物的量R 与所有细胞理论最大释放量Rm的比值R/Rm,求出破碎率. (2-3)
生物分离工程 第二章
细胞分离与破碎
（2）珠磨
影响因素：搅拌速度、停留时间、微珠粒径、细胞本身 适用对象：绝大多数微生物细胞
2
细胞分离与破碎
（3）喷雾撞击破碎
喷雾撞击破碎器结构简图
特点：细胞破碎程度均匀，可避免过度破碎，适用 于细胞器（线粒体、叶绿体等）的回收 适用对象：大多数微生物细胞和植物细胞
2
细胞分离与破碎
（4）超声波破碎 机理：在超声波作用下液体发生空化作用，空穴的 形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞 破碎。 影响因素：细胞种类，细胞浓度，频率、功率 适用对象：多数微生物细胞
物理渗透法
（1）渗透压冲击法
（2）冻结-融化法
2
细胞分离与破碎
2.2.4 目标产物的选择性释放
细胞破碎的目的是使胞内的目标产物释放出来，以 进行进一步的分离纯化，因此，理想的破碎方法应当是
使目标产物尽可能多的释放出来，而杂质成分尽可能少 得释放。 ① 仅破坏或破碎目标产物的周围。
① 选择性溶解目标产物。
Rc
W
A
kp
m
一般需缓慢增大操作压力，最终操作压力不超过 0.3 ～ 0.4MPa。
2
细胞分离与破碎
2.1.3.2
过滤设备
工业上常用的过滤设备：加压叶滤机、板框过滤机、 转鼓真空过滤机。
加压叶滤机
转鼓真空过滤机
2
细胞分离与破碎
板框过滤机
2
细胞分离与破碎
2.2 细 胞 破 碎
2.2.1 细胞结构
不同生物细胞，其细胞结构差异很大。
2.2.2 细胞破碎和产物释放原理
摩擦力、撞击作用力、剪切力、化学溶解、酶解
渗透作用力等。
生物分离工程：02-细胞分离(2008)
第二章细胞的分离与破碎2.1 细胞分离2.1.1 重力沉降2.1.2 离心分离Centrifugation粒子在离心场中运动时的受力情况离心力F c=mω2r排开流体的向心力F b=-m oω2r摩擦力F f=-fv一些生物分子的沉降系数RNADNA胞内成分酶、激素，可溶性蛋白核糖体病毒线粒体细胞膜离心分离——固定角离心(Fixed-Angle Centrifugation)离心分离——水平离心(Swinging-Arm Centrifugation)2No.1No.2离心分离法差速离心Differential centrifugation密度梯度离心Density gradient centrifugation差速离心Differential centrifugation10,000 ×g for 10 mins离心分离——差速分级离心(Differential Centrifugation)影响因素：离心力（‘×g‘）和离心时间离心管尺寸、形状和摆放角度差速离心存在的问题？•污染（小分子粘附在大分子上）•分离精度有限（相似性质的分子难以分开）•振动和对流的影响密度梯度离心Density Gradient Centrifugation (常用于生化研究, 如蛋白质、核酸分离)最大密度小于待分离对象的密度最大密度大于待分离对象的密度密度梯度离心的一般步骤处理量小！工业离心分离设备管式离心机和碟式离心机碟片式离心机料液重相轻相(3) dr/2.1.3 过滤分离Filtration过滤——死端过滤(Dead-End Filtration)过滤——错流过滤(Cross-Flow Filtration)不同过滤方式的比较。
第二章细胞破碎技术PPT课件
碎片分离 （离心分离、双水相萃取、膜分离）
提取 初步纯化 （沉淀、吸附、萃取、超滤、结晶）
精制 高度纯化 （重结晶、离子交换、色谱分离、膜分离）
成品加工 （浓缩、无菌过滤、干燥、成型）
2.1 概述 2.2 细胞壁的成分和结构 2.3 细胞破碎技术 2.4 破碎率的评价及破碎率的选择依据
2.1 概述
一、微生物细胞
细胞外层结构
革兰氏阴性菌（Gram-negative），泛指革兰氏染色反应呈红色的细菌。葡萄 球菌、链球菌。 革兰氏阳性菌（Gram Positive）是能够用革兰氏染色染成深蓝或紫色的细菌。 大肠杆菌。
各种微生物细胞壁的结构及组成
1、细菌的细胞壁
几乎所有细菌的细胞壁都是由坚固的骨架——肽聚 糖组成，是聚糖链借短肽交联而成，使细胞具有 一定的形状和强度。
综上所述：
不同生物体或同一生物体的不同部位，细胞破 碎难易程度不同，因此因采用不同的细胞破 碎方法进行破碎。
如：动物器脏细胞没有细胞壁，细胞膜比较脆 弱，容易破碎；植物和微生物细胞都具有纤 维素、半纤维素或肽聚糖组成的细胞壁，应 采用专门的破碎方法进行破碎。
二、植物细胞
真核细胞具有真正的细胞核，其结构要比 原核生物复杂的多。和原核细胞一样，真 核细胞也具有一层细胞膜。
除了细胞膜，真核细胞具有一些有特殊作 用的细胞器。
植物和大多数真菌具有细胞壁。
动 物 细 胞 模 式 图
植 物 细 胞 模 式 图
对于已停止生长的植物细胞来说，其细胞壁 可分为初生壁和次生壁两部分。初生壁是细 胞生长时期形成的。次生壁是细胞停止生长 后，在初生壁内部形成的结构。
对于胞内产物，则需首先收集菌体，进行细胞破 碎，使代谢产物转入液相中，然后，再进行细胞 碎片的分离。
第二章细胞的破碎与分离
本质上是一种增溶作用，细胞破碎的阻力来 自于细胞壁的结构和组成的差异。
细胞的结构根据细胞种类而异，动物、植物 和微生物细胞的结构差异很大。
动物细胞、嗜盐菌和支原体没有细胞壁，易于破碎；
植物细胞和微生物细胞有坚固的细胞壁，破碎困难， 需用强烈的破碎方法。
9
2细胞壁的结构和化学组成
原核生物细菌 肽聚糖、多糖、磷壁酸，主要阻力来自
4
1概述
大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖， 及氨基酸等目标产物存在于发酵液中。
有些目标产物存在于生物体中。
尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质
是在细胞内沉积。
脂类物质和一些抗生素包含在生物体中。
5
1 概述
胞外产品：各种胞外酶、胞外多糖、细胞代 谢物如氨基酸、抗生素
细胞本身： 单细胞蛋白 如面包酵母 胞内产品： 各种胞内酶、基因工程产物
22
WSK卧式高效全能珠磨机
ZM系列卧式密闭珠(砂)磨机
23
珠磨法 (bead mill)
实验室规模的细胞破碎设备有Mickle高速组织捣碎 机、 Braun匀浆器； 中试规模的细胞破碎可采用胶质磨处理；
在工业规模中，可采用高速珠磨机(瑞士WAB公司 和德国西门子机械公司制造)。
珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：降低能耗、 减少大分子目的产物的失活、减少由于高破碎率产 生的细胞小碎片不易分离而给后续操作带来的困难。
美国 Microfluidic速冲
击撞击环使细胞破碎，细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每 秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上， 被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中 经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成细胞破碎。
生物分离工程 第二章 细胞分离与破碎
酶法 酶消化法 细胞壁被消化，使 温和 昂贵 细胞破碎
差速离心分离应用实例
homogenate
Filtered homogenate
600g 10 min
15000g 100000g 300000g 10 min 60 min 120 min
Sedimentation
nuclei
Mitochondria Plasma
Riosomal Soluble part of
r22
r12
完全沉降的边界条件
z 0
r r1
zL
r r2
Q
vg
L r22 r12
g lnr2 r1
2
细胞分离－离心机处理能力
影响因素
处理样品的特性，如密度、粒径等 溶液的特性，如密度、粘度等 离心机机械结构，如r1和r2 操作条件，ω
细胞分离－过滤定义
真核细胞
动物细胞 植物细胞 酵母细胞
没有细胞壁，只有由脂质和蛋白质组成的细胞膜 细胞膜外有一层坚固的细胞壁 细胞壁由葡聚糖、甘露聚糖和蛋白质构成，更加难以破碎
原核细胞
革兰氏阳性菌 革兰氏阴性菌
细胞壁由肽聚糖层组成，壁厚约15～50 nm，肽聚糖含量 为40~90%，细胞壁较革兰氏阴性菌坚固。
细胞壁在肽聚糖的外侧还有分别由（1）脂蛋白和（2）磷 脂和脂多糖构成的两层外壁层，外壁层厚度越8～10 nm。
胞内产物释放 －细胞膜组成
（A）
（B）
胞内产物释放－影响产物释放的环境因素
在复杂培养基中生长的大肠杆菌细胞其破碎较单一培养基中 生长的大肠杆菌细胞更难；
对数生长期的细胞会表现得更加脆弱。 从连续培养过程中获得的、具有较高比生长速率的念珠菌的
细胞破碎
细胞破碎技术生基硕51 邓亮05123010生物分离的第一步是将生物机体从发酵液中分离，通常使用过滤和离心等方法。
大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖，及氨基酸等目标产物存在于在发酵液中。
在上述过程中，需被分离的发酵液可被看作一种副产物来处理，以此分离和纯化产物。
有些目标产物不在发酵液中，而是存在于生物体中。
尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质不会被分泌到发酵液中，而是在细胞内沉积。
脂类物质和一些抗生素也是包含在生物体中。
还有一些目标产物就是细胞本身，如面包酵母。
还有，产物如类固醇不必通过细胞破碎提取。
大多数情况下，产物还是包裹在生物体内，属胞内产物。
使胞内产物释放出来一般需要破碎细胞壁，细胞破碎的方法在生物化学领域中得到了很广泛的运用，但多数在小规模生产中，在大规模生产尤其是基因工程中应用极少。
破碎技术的分类细胞破碎方法是十分有用的。
我们很容易将这些方法划分为两大类，化学法和机械法，下表中已经列出详细方法分类：化学方法主要的几种化学方法，有渗透冲击法，表面活性剂增溶法、脂溶法。
1． 酶消化法和碱处理法酶消化法的缺点在于酶的价格昂贵限制了在大规模生产中的使用，虽然条件温和、具有选择性。
细胞悬浮液中加入酶能迅速和细胞壁反应并破坏它们。
酶选择性的催化细胞壁反应，不破坏细胞内的其它物质。
碱处理法和酶消化法相反，反应激烈，不具选择性，而且较便宜。
碱加入细胞悬浮液中后和细胞壁进行了多种反应，包括使磷脂皂化。
该操作是细胞增溶的很好的例子，因为它使细胞壁的成分溶于表面活性剂，也使蛋白质变性。
该法不仅破坏了细胞壁也破坏了产物，因此即便很便宜，碱处理也是一种很不常用的方法。
2． 渗透冲击法三种主要细胞破碎化学方法中最简单的是渗透冲击法。
此法将一定体积的细胞液加到2倍体积的水中，细胞中溶质浓度高，水不断进入细胞，使细胞膨胀，最后导致破裂。
细胞破裂后释放到周围环境中的胞内物可用后续方法分离。
细胞破碎的难易决定于其类型，红血球细胞容易溶破，动物细胞只有当其组织被用4.3节所介绍的方法机械切碎或匀浆后才易溶破。
第二章 细胞分离与破碎
助滤剂。对于滤饼阻力较大的物料适应能力较 差。
58
➢离心过滤机（centrifugal filter）
➢结构：
转鼓(上有小孔，亦称悬框)； ➢滤网； ➢滤布；
机架。
➢原理：
转鼓 滤饼 滤布 滤网
离心过滤机工作原理图
由于离心力作用，液体产生径向压差，通过滤饼、滤 布及滤网而流出。
61
第四章 细胞破碎
31
（1）斜角式离心机
❖是一类结构最简单的实验室常用离心机。
32
（2）平抛式离心机
❖一类结构简单的实验室常用的低中速离心机，转速一般 在 3000-6000rpm。
平抛式离心机转子
33
（3）管式离心机（tubular-bowl centrifuge）
34
35
**管式离心机特点：
• 结构简单。 • 管状离心机可以安装冷却夹套，有利蛋
白质分离。 • 固体挂壁多时，可采用多台交替操作。 • 适用于于分离乳浊液及含细颗粒的稀悬
浮液，适用于固体含量低于1%，颗粒度 小于5微米，黏度大的悬浮液澄清或固液 两相密度差较小的分离。
36
（4）碟片式离心机（disk-bowl centrifuge） 工作原理
37
（5）螺旋式离心机（scroll-type centrifuge）
成本高 实验室，部分工业
94
四、**选择性释放目标产物的一般原则
(1)仅对目标产物的位置周围破碎 (2)机械破碎法和化学法并用可使操作条件
更加温和，在相同的目标产物释放率条 件下，降低细胞的破碎程度。
96
讨论题：青霉素酰化酶细胞破碎的研究
一. 化学法
20%(W/V)大肠杆菌悬浮液 + B.A
58
➢离心过滤机（centrifugal filter）
➢结构：
转鼓(上有小孔，亦称悬框)； ➢滤网； ➢滤布；
机架。
➢原理：
转鼓 滤饼 滤布 滤网
离心过滤机工作原理图
由于离心力作用，液体产生径向压差，通过滤饼、滤 布及滤网而流出。
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第四章 细胞破碎
31
（1）斜角式离心机
❖是一类结构最简单的实验室常用离心机。
32
（2）平抛式离心机
❖一类结构简单的实验室常用的低中速离心机，转速一般 在 3000-6000rpm。
平抛式离心机转子
33
（3）管式离心机（tubular-bowl centrifuge）
34
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**管式离心机特点：
• 结构简单。 • 管状离心机可以安装冷却夹套，有利蛋
白质分离。 • 固体挂壁多时，可采用多台交替操作。 • 适用于于分离乳浊液及含细颗粒的稀悬
浮液，适用于固体含量低于1%，颗粒度 小于5微米，黏度大的悬浮液澄清或固液 两相密度差较小的分离。
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（4）碟片式离心机（disk-bowl centrifuge） 工作原理
37
（5）螺旋式离心机（scroll-type centrifuge）
成本高 实验室，部分工业
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四、**选择性释放目标产物的一般原则
(1)仅对目标产物的位置周围破碎 (2)机械破碎法和化学法并用可使操作条件
更加温和，在相同的目标产物释放率条 件下，降低细胞的破碎程度。
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讨论题：青霉素酰化酶细胞破碎的研究
一. 化学法
20%(W/V)大肠杆菌悬浮液 + B.A
生物分离-细胞破碎
选择性释放：使细胞不完全破碎，选择性释放目标产物， 选择性释放：使细胞不完全破碎，选择性释放目标产物，尽量 减少其他物质的释放。 减少其他物质的释放。
选择性释放原则： 选择性释放原则： 仅破坏或破碎存在目标产物的位置 细胞膜附近：温和的方法(酶法) 细胞膜附近：温和的方法(酶法)，或采用较温和 的机械破碎条件，降低细胞破碎程度。 的机械破碎条件，降低细胞破碎程度。 细胞内： 细胞内：机械破碎 选择性溶解目标产物 目标产物与细胞膜或细胞壁处于结合状态 调整溶液pH、离子强度、添加能够溶解释放目标 调整溶液pH、离子强度、 pH 产物的试剂(如表面活性剂、螯合剂) 产物的试剂(如表面活性剂、螯合剂)。
化学方法
1. 酸碱处理 破坏细胞壁和细胞膜， 破坏细胞壁和细胞膜，适用于酸碱稳定的产品 细菌L 天门冬酰胺酶的提取， 如：细菌L-天门冬酰胺酶的提取，将菌体悬浮 pH11~12.5的碱溶液中，振荡20min即可。 12.5的碱溶液中 20min即可 在pH11 12.5的碱溶液中，振荡20min即可。 2. 有机溶剂处理 甲苯、 甲苯、丙酮等 溶解脂类物质，增加细胞壁和细胞膜通透性， 溶解脂类物质，增加细胞壁和细胞膜通透性， 可实现选择性释放。 可实现选择性释放。
四、破碎率的测定
a. 直接测定 利用显微镜观察或计数； 利用显微镜观察或计数；染色可将破碎细胞和完 整细胞区分开。 整细胞区分开。 如革兰氏染色能将破碎后的革兰氏阳性菌染成阴性 菌的颜色； 菌的颜色； 受损的酵母细胞为亮红色， 受损的酵母细胞为亮红色，未受损的酵母细胞为紫 色。 b. 测定释放的蛋白量或酶活 将破碎后的细胞悬液离心， 将破碎后的细胞悬液离心，测定上清液中蛋白浓度 或酶活。 或酶活。 c. 测电导率 电导率随破碎率的增加而线性增加
分离工程第二章,细胞分离与破碎
4.1.4 干燥法
• 经干燥后的细胞，其细胞膜的渗透性发生变化， 同时部分菌体会产生自溶，然后用丙酮、丁醇 或缓冲液等溶剂处理时，胞内物质就会被抽提 出来。
4.2 非机械法
• 非机械方法很多 ⑴酶解 ⑵渗透压冲击 ⑶冻结和融化 ⑷干燥法 ⑸化学法溶胞 • 其中酶法和化学法溶胞应用最广
4.2.1 酶解
随着重组DNA技术和组织培养技术上的重大进展， 以前认为很难获得的蛋白质现在可以大规模生产。
2.2 细胞破碎
2、目标产物的定位
胞外
一些微生物在代谢过程中将产物分泌到细胞之 外的液相中（称胞外酶），这些产品主要为医药 和保健产品，如胰岛素、某些细胞因子和疫苗亚 单位成分等。
这些蛋白质在细胞培养时被宿主细胞分泌到 培养液中，提取过程只需直接采用过滤和离心进 行固－液分离，然后将获得的澄清滤液再进一步 纯化即可。其后续分离和纯化都相对简单。
半乳糖醛酸聚糖 、 鼠李半乳糖醛酸聚糖
果胶物质 半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖
蛋白质 结构蛋白 各种酶类
凝集素
• 目前已发展了多种细胞破碎方法，以便适应不同 用途和不同类型的细胞壁破碎。
• 破碎方法可规纳为机械法和非机械法两大类。
4. 细胞破碎方法分类
破碎方式
机械法
非机械法
固体剪切 作用
液体剪切
干燥
作用
• 其中 R — 破碎率；
•
K一 一级反应速度常数；
•
t一 时间。
• 一级反应速度常数K与许多操作参数有关，如 如搅拌转速、细胞悬浮液的浓度和循环速度、 玻璃小珠的装量和珠体的直径，以及温度等。
瑞士Ｄyno珠磨机
• 高速珠磨机（High speed bead mill）
生物分离工程-第二章-细胞破碎(医学相关)
优质课件
5
1、重力沉降定义
重力沉降是传统化工过程中常用的从含有固体 颗粒的流体中将颗粒分离出来的操作。
重力沉降是利用流体与颗粒间的密度差， 在重力的作用下使颗粒与流体之间产生 相对运动，从而实现两者的分离。
在生物分离过程中，定义中颗粒为细胞、细胞 碎片等有形物
优质课件
6
千姿百态的微生物世界
High-density cell culture
优质课件
47
1、过滤定义
过滤是利用多孔性介质（如滤布）截留 固液悬浮液中的固体粒子，进行固液分 离的方法。
过滤本身是一种膜分离技术。在分离细胞、菌体或 它们的碎片过程中除了沉降分离方法外，过滤技术也是 一种常备的分离方法。
优质课件
48
2、过滤过程受力分析
推动力：过滤操作以压力差为主要推动力； 阻 力：过滤过程的阻力来自多孔性过滤介 质和介质表面不断堆积形成的滤饼
(d) Axial solids-ejecting disk bowl.
(e) Nozzle bowl with pressurized
solids discharge.
(f) Nozzle bowl with peripheral
优质课di件scharge nozzles.
42
优质课件
43
离心设备比较
优质课件
49Biblioteka 过滤速率dQ dt
A p
L Rm Rc
Q：液体的流量 A:面积
Rm表示介质的阻力； Rc表示滤饼的阻力； μL为滤液的粘度
优质课件
50
恒压过滤方程
Ruth恒压过滤方程
Q Q0 2 Kt t0
chapter2细胞分离与破碎2
2.2.4 目标产物的选择性释放
• 利用珠磨法破碎酵母细胞时，酵母内各种酶的释 放速率常数不同。一般靠近细胞壁和细胞膜的酶 释放速度快，而细胞内部或细胞器内的酶随破碎 的进行缓慢释放出来。因此，选择发现地释放目 标产物是可能的，关键是要知道目标产物的性质 和在细胞同存在的位置，选择适当的破碎方法和 操作条件。
真核细胞的细胞壁不同于原核细胞，需采用不同 的酶。
2.2.3 细胞破碎技术
自溶作用是酶解的另一种方法，利用生物体自身 产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶。
在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水 解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续下去。 可是，改变其生长环境，可以诱发产生过剩的这 种酶或激发产生其它的自溶酶，以达到自溶目的。
A、提取产物在细胞质内，用机械法破碎 B、提取产物在细胞膜附近，用化学法 C、提取产物与细胞膜和细胞壁结合，可采用化学法和机械
法结合的方法
破碎技术杂交研究应注意的问题
A、杂交技术可产生很大优势。 B、破碎技术对下游分离技术的影响。破碎颗粒清除，产物
的分离纯化 C、在发酵阶段，考虑到发酵过程和环境对破碎难易程度的
机械破碎法缺点：
A、高能、高温、高噪音、高剪切力(四高)，易使产品变性 失活；
B、非专一性，胞内产物均释放，分离纯化困难； C、细胞碎片大小不一，难分离。
化学破碎法缺点：
A、费用高； B、引起新的污染，尤其是其他化学方法； C、一般只有有限的破碎，常需与其他物理法连用。
破碎方法的选择
选择的一般原则
2.2.4 目标产物的选择性释放
• 选择性释放目标产物的一般原则
⑴仅破坏或破碎存在目标产物的位置周围 当目标产物存在于细胞膜附近时，可采用较混和
第二章细胞分离和破碎
细胞的收集或除去为目的的固液离心分离，是分级离心 操作的一种特殊情况，即为一级分级分离。
主要菌体和细胞的离心分离
菌体、细胞 大小/μm
大肠杆菌 酵母 血小板 红血球 淋巴球 肝细胞
2～4 2～7 2～4 6～9 7～12 20～30
第二章细胞分离和破碎
离心力 实验室 工业规模
1 500g 1 500g 5 000g 1 200g 500g 800g
2. 操作中，根据实际物料的特点(目标产物和其他 组分的性质和相互作用等)、分离的目的和所需 分离的程度，选择适当的操作条件(离心转数和 时间)，可使料液中的不同组分得到分级分离。
第二章细胞分离和破碎
第二章细胞分离和破碎
差 速 离 心
第二章细胞分离和破碎
第二章细胞分离和破碎
2.2.3.2 离心分离法 差速离心是生化工业中常用离心分离方法。以菌体
酵母菌
霉菌
100～300
多层 葡聚糖 (30%～40%) 甘露聚糖 (30％) 蛋白质 (6%～8%) 脂类 (8.5%～13.5%)
100～250
多层 多聚糖 (80%～90%) 脂类 蛋白质
第二章细胞分离和破碎
细胞破碎法
• 机械破碎 • 化学和生物化学渗透 • 物理渗透法
第二章细胞分离和破碎
细胞破碎和产物释放原理
2000～7000 8000～80000 100000～600000
适用
适用
适用
适用
适用
适用
—
适用
适用
—
—
适用
第二章细胞分离和破碎
离心沉降速度
离心设备的一个重要技术指标是其所能达到的离心 力与重力的比值，称为分离因数。分离因数是衡量 离心程度的参数，用Z表示
主要菌体和细胞的离心分离
菌体、细胞 大小/μm
大肠杆菌 酵母 血小板 红血球 淋巴球 肝细胞
2～4 2～7 2～4 6～9 7～12 20～30
第二章细胞分离和破碎
离心力 实验室 工业规模
1 500g 1 500g 5 000g 1 200g 500g 800g
2. 操作中，根据实际物料的特点(目标产物和其他 组分的性质和相互作用等)、分离的目的和所需 分离的程度，选择适当的操作条件(离心转数和 时间)，可使料液中的不同组分得到分级分离。
第二章细胞分离和破碎
第二章细胞分离和破碎
差 速 离 心
第二章细胞分离和破碎
第二章细胞分离和破碎
2.2.3.2 离心分离法 差速离心是生化工业中常用离心分离方法。以菌体
酵母菌
霉菌
100～300
多层 葡聚糖 (30%～40%) 甘露聚糖 (30％) 蛋白质 (6%～8%) 脂类 (8.5%～13.5%)
100～250
多层 多聚糖 (80%～90%) 脂类 蛋白质
第二章细胞分离和破碎
细胞破碎法
• 机械破碎 • 化学和生物化学渗透 • 物理渗透法
第二章细胞分离和破碎
细胞破碎和产物释放原理
2000～7000 8000～80000 100000～600000
适用
适用
适用
适用
适用
适用
—
适用
适用
—
—
适用
第二章细胞分离和破碎
离心沉降速度
离心设备的一个重要技术指标是其所能达到的离心 力与重力的比值，称为分离因数。分离因数是衡量 离心程度的参数，用Z表示
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d
2 P
(
S
L)
2r
18L
令： S
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2 P
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L)
18 L
vS S 2r
优质课件
20
3、离心分离方法
差速离心分级 区带离心
差速区带离心 平衡区带离心
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21
差速离心分离
差速离心是以菌体细胞的收集或除去为目的 的固液离心分离方法，应用某一特定颗粒沉淀 的离心力在预定的离心时间内得到一部分颗粒 沉淀及包含未沉淀颗粒的上清液。
识记：重力沉降、离心沉降和过滤的概念。 理解：重力沉降、离心分离与过滤原理、理
论；掌握Stokes（斯托克斯）沉降公式 。 应用：常用离心方法及优缺点；利用掌握的
提高分离效率的方法分析决实际问题
优质课件
4
（一）、重力沉淀
1、重力沉淀的定义 2、重力沉淀的理论 3、提高重力沉降的途径
动态离心分离方法
优质课件
28
平 衡 区 带 离 心
优质课件
29
平衡区带离心
梯度液密度范围含盖全部待分离颗粒密度 离心过程中，颗粒不断沉降至其浮力密度
与梯度液密度相等 平衡离心分离方法
优质课件
30
梯度液的种类和应用
优质课件
31
细胞分离－区带离心异同
区带离心种类 共同点 梯度介质 密度梯度 区带形成条件
优质课件
22
差速离心分离应用实例
homogenate
Filtered homogenate
600g 10 min
15000g 100000g 300000g 10 min 60 min 120 min
Sedimentation
nuclei
Mitochondria Plasma
Riosomal Soluble part of
生物工程下游技术
第二章 细胞分离与破碎 3 学时
优质课件
1
学习目的和要求
掌握解细胞分离和目标产物的释放的 原理和方法，熟知各种方法的优缺点 和应用范围。
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2
目录
一、细胞分离 （一）、重力沉降 （二）、离心沉降 （三）、过滤 二、细胞破碎与胞内物释放
优质课件
3
细胞分离－学习要点
Newton公式
优质课件
13
千姿百态的微生物世界
球形颗粒？
无限稀释溶液？
Bacterial morphology diagram 优质课件 High-density cell cultu1r4e
3、提高重力沉降的途径
S
A AP
F ( )
加入中性盐：双电层排斥电位降低 加入高分子絮凝剂：架桥作用形成大 絮凝图 引入外力
9
重力沉降理论
重力： 浮力s ：
阻力：
d,Ps—分别指颗粒的直径（m）和密度（kg.m-3）
fg
1 6
d
3 p
s
g
fb
1 6
d
பைடு நூலகம்3 p
L
g
fS
L
v
2 g
2
d
2 p
4
优质课件
10
Sedimentation
Figure3.1 Schematic representation of separation of solids by setting
lysosom优e质s 课件 membrane
subunits
cytoplasm
23
区带离心分离－前提
在离心管内的溶液存在密度梯度。采用 事先配好的不同浓度（密度）的梯度介质 （蔗糖等），按照浓度从大到小的原则，依 次层层加入。加入离心管中的梯度介质经高 速离心或静置后可形成连续的密度梯度。
优质课件
当球形颗粒处于过渡区（1 Re 103 ）时
10
Re 0.5
vg
0.27
d
p
S
L
L g
Re
0.6
0.5
Allen公式
当球形颗粒处于湍流区（103 Re 2 105）时
0.44
vg
1.74
d
p
S
L
L g 0.5
优质课件
11
重力沉降理论
当球形颗粒自身的重力与其所受到浮力和阻力 达到平衡时，
fg fS fb
则
v
2 g
4 3
S
L
L
d
p
g
优质课件
12
重力沉降理论
当球形颗粒处于滞流区（103 Re 1 ）时
24
Re
vg
d
2 p
S
L g
18 L
Stokes公式
24
操作过程
优质课件
25
区带离心种类
差速区带离心(速度区带离心） 平衡区带离心（等密度离心）
优质课件
26
差 速 区 带 离 心
优质课件
27
差速区带离心
基于颗粒的大小、形状的分离
梯度液的最大密度不能超过所分离颗粒的 最大密度
离心过程中，颗粒不断沉降至其浮力密度 与梯度液密度相等
Bacterial morphology diagram 优质课件
7
2、重力沉降理论
理论假设
细胞或细胞碎片按照球形颗粒处理； 颗粒在无限稀释的溶液中进行沉降，颗粒
之间无相互干扰
受力分析
球形颗粒重力fg
液体的浮力fb
颗粒运动方向相反的阻力 fs
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8
Fs
球形颗粒沉降的受力情况
优质课件
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15
（二）、离心沉淀
1、离心沉淀的定义
2、离心沉淀的理论
3、离心分离方法
4、离心分离设备
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16
1、离心沉降定义
离心沉降是利用沉降设备使流体和颗粒旋 转，在离心力的作用下，由于颗粒和流体 间存在密度差，所以颗粒沿径向与流体产 生相对运动，从而使颗粒和流体分离。
优质课件
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5
1、重力沉降定义
重力沉降是传统化工过程中常用的从含有固体 颗粒的流体中将颗粒分离出来的操作。
重力沉降是利用流体与颗粒间的密度差， 在重力的作用下使颗粒与流体之间产生 相对运动，从而实现两者的分离。
在生物分离过程中，定义中颗粒为细胞、细胞 碎片等有形物
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6
千姿百态的微生物世界
High-density cell culture
17
centrifugation
Suprenatant
Wet Solids Figure 3.2 Schematic representation of centrifugal separation
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18
优质课件
19
2、离心沉降理论
离心沉降速度
vg
d
2 p
S
L
g
18 L
vS
离心条件
差速区带离心
平衡区带离心
事先在离心管内用低分子量溶质调配好密度梯度
常用蔗糖
常用氯化铯
最大的密度梯度低于最大密 度的沉降样品
根据各个组分沉降系数的差 别，形成各自的区带
最大的密度梯度大于最大密 度的沉降样品