自己总结：流式细胞仪的原理和用途.

流式细胞仪(Flow Cytometry

1 流式细胞仪的概念及其发展历史

1. 1 流式细胞仪的基本概念流式细胞仪(flow cytonletry , FCM 是对高速直线流动的细胞或生物微粒进行快速定量测定和分析的仪器,主要包括样品的液流技术、细胞的计数和分选技术,计算机对数据的采集和分析技术等。流式细胞仪以流式细胞术为理论基础,是流体力学、激光技术、电子工程学、分子免疫学、细胞荧光化学和计算机等学科知识综合运用的结晶。流式细胞术是一种自动分析和分选细胞或亚细胞的技术。其特点是:测量速度快、被测群体大、可进行多参数测量,即对同一个细胞做有关物理、生物化学特性的多参数测量,且在统计学上有效。

1. 2 流式细胞仪的发展简史最早的流式细胞仪雏形诞生于 1934年, Moldavan 提出使悬浮的单个血红细胞流过玻璃毛细管 , 在亮视野下用显微镜进行计数 , 并用光电记录装置测量的设想。 1953年 Crosland-Taylor 根据牛顿流体在圆形管中流动规律设计了流动室。其后又经过 Coulter 、 Parker & Horst 、Kamentsky 、 Gohde 、 Fulwyler 、 Herzenberg 等人的不断改进,设计了光电检测设备和细胞分选装置、完成了计算机与流式细胞仪的物理连接及多参数数据的记录和分析、开创了细胞的免疫荧光染色及检测技术、推广流式细胞仪在临床上的应用。近 20年来,随着流式细胞仪及其检测技术的日臻完善, 人们越来越致力于样品制备、细胞标记、软件开发等方面的工作,以扩大 FCM 的应用领域和使用效果。

宋平根的《流式细胞术的原理和应用》是迄今为止对流式细胞仪及其技术阐述的最为详尽和透彻的中文著作。这本书非常详细地介绍了流式细胞术的历史、结构、原理、技术指标等,例举了其在医学和生物工程中的应用, 非常适合从事此方面专业研究的人。由于这本书是 13年前出版的, 所以基本上没有涉及植物流式细胞仪检测技术。此外对于只需要对流式细胞仪有些基本认识的人士来说,这本书太复杂太深奥。谢小梅主要介绍了流式细胞仪在生物工程中的应用。杨蕊概括了流式细胞仪的工作原理,简单提及了流式细胞仪的应用。本文在分析这三篇论著或文章

的优缺点后,用比较通俗的语言介绍了掌握流式细胞仪检测技术必须了解的一些原理,并对目前市场上的主流型号进行了客观的性能概括。

2 流式细胞仪的工作原理和技术指标

2. 1 流式细胞仪工作原理除电源外,流式细胞仪主要由四部分组成:流动室和液流系统:激光源和光学系统;光电管和检测系统;计算机和分析系统,其中流动室是仪器的核心部件。这四大部件共同完成了信号的产生、转换和传输的任务。

流动室和液流系统

流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成,常用光学玻璃、石英等透明、稳定的材料制作。设计和制作均很精细, 是液流系统的心脏。样品管贮放样品, 单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出; 鞘液由鞘液管从四周流向喷孔,包围在样品外周后从喷嘴射出。为了保证液流是稳液,一般限制液流速度υ<10m/s。由于鞘液的作用,被检测细胞被限制在液流的轴线上。流动室上装有压电晶体,受到振荡信号可发生振动。

激光源和光学系统

经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收集检测。常用的光源有弧光灯和激光; 激光器又以氩离子激光器为普遍 ,也有配和氪离子激光器或染料激光器。光源的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定。汞灯是最常用的弧光灯 ,其发射光谱大部分集中于 300~400nm ,很适合需要用紫外光激发的场合。氩离子激光器的发射光谱中,绿光 514nm 和蓝光 488nm 的谱线最强, 约占总光强的 80%;氪离子激光器光谱多集中在可见光部分,以 647nm 较强。免疫学上使用的一些荧光染料激发光波长在 550nm 以上,可使用染料激光器。将有机染料做为激光器泵浦的一种成份,可使原激光器的光谱发生改变以适应需要即构成染料激光器。例如用氩离子激光器的绿光泵浦含有 Rhodamine6G 水溶液的染料激光器 , 则可得到 550~650nm 连续可调的激光,尤在 590nm 处转换效率最高,约可占到一半。为使细胞得到均匀照射,并提高分辨率,照射到细胞上的激光光斑直径应和细胞

直径相近。因此需将激光光束经透镜会聚。光斑直径 d 可由下式确定:d=4λf/πD 。λ为激光波长; f 为透镜焦距; D 为激光束直径。色散棱镜用来选择激光的波长,调整反射镜的角度使调谐到所需要的波长λ。为了进一步使检测的发射荧光更强,并提高荧光讯号的信噪比,在光路中还使用了多种滤片。带阻或带通滤片是有选择性地使某一滤长区段的光线滤除或通过。例如使用 525nm 带通滤片只允许 FITC (Fluoresceinisothiocyanate, 异硫氰荧光素发射的 525nm 绿光通过。长波通过二向色性反射镜只允许某一波长以上的光线通过而将此波长以下的另一特定波长的光线反射。在免疫分析中常要同时探测两种以上的波长的荧光信号,就采用二向色性反射镜,或二向色性分光器,来有效地将各种荧光分开。

光电管和检测系统

经荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光是通过光电转换器转变成电信号而进行测量的。光电倍增管(PMT 最为常用。 PMT 的响应时间短,仅为 ns 数量级;光谱响应特性好,在 200~ 900nm 的光谱区,光量子产额都比较高。光电倍增管的增益从 10到 10可连续调节 ,因此对弱光测

量十分有利。光电管运行时特别要注意稳定性问题, 工作电压要十分稳定, 工作电流及功率不能太大。一般功耗低于 0.5W ;最大阳极电流在几个毫安。此外要注意对光电管进行暗适应处理,并注意良好的磁屏蔽。在使用中还要注意安装位置不同的 PMT ,因为光谱响应特性不同,不宜互换。也有用硅光电二极管的,它在强光下稳定性比 PMT 好。

从 PMT 输出的电信号仍然较弱,需要经过放大后才能输入分析仪器。流式细胞计中一般备有两类放大器。一类是输出信号辐度与输入信号成线性关系,称为线性放大器。线性放大器适用于在较小范围内变化的信号以及代表生物学线性过程的信号,例 DNA 测量等。另一类是对数放大器,输出信号和输入信号之间成常用对数关系。在免疫学测量中常使用对数放大器。因为在免疫分析时常要同时显示阴性、阳性和强阳性三个亚群,它们的荧光强度相差 1~2个数量级;而且在多色免疫荧