5第五讲分子克隆载体-PPT资料69页
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大肠杆菌分子克隆载体 PPT课件
第三节
大肠杆菌分子克隆载体
一、E.coli克隆载体的种类
1. 质粒载体—复制起点来自一些天然质粒。 2. 噬菌体载体—λ，P1和M13、fd载体，复制 起点来自噬菌体。 3. COS质粒载体—质粒载体中插入λcos片段， 以利于体外包装 4.噬粒载体（phagemid）—有质粒和M13、fd 的复制起点，以质粒或噬菌体方式复制。
6) λ载体的种类
i. 插入型—即将外源DNA直接插入已构建载体中，如 λgt11，可以插入长达7 Kb的DNA。这类载体被限制酶 切成左右臂。 ⅱ.取代型—即利用一段外源DNA去取代载体中的一段 DNA，而这段DNA常含有一定的标记基因。这类载体 常被限制酶切为三段：左臂、隔离段和右臂。 * 有的取代型λ载体亦可用作插入型载体,如Charon 4A
ⅲ. 多克隆位点集中排列，有利于克隆片段的物理图谱的
绘制。 除上述三个特点外，pUC系列载体还可用于表达外源 基因 （LacZα启动子）。
pBS载体的结构
pBS-SK(-)
T7
Plac
T3
pBS-KS(-)
Plac
LacZα ori
F1(-)
pBS
(3.0 kb) Ampr
ori
三. 噬菌体载体
二、质粒与质粒载体
1. E．coli的质粒种类
1) colE1因子（大肠杆菌素因子）—多数不能进行接 合转移DNA，属高拷贝松弛型。 2) R因子（抗药性因子） 可接合转移DNA，属低拷贝 严紧型， 质粒较大，操作不便 3) F因子（性因子）
2.质粒的特点
1) 质粒DNA复制与染色体复制无关 2) 质粒DNA以超螺旋形式存在 3) 质粒DNA可以接合转移 4) 质粒的不相容性和不相容群 5) 质粒DNA的消除—化学和物理法(吖啶染料， EtBr，高温等) 6) 质粒的整合—F因子又可整合到E.coli染色体中
大肠杆菌分子克隆载体
一、E.coli克隆载体的种类
1. 质粒载体—复制起点来自一些天然质粒。 2. 噬菌体载体—λ，P1和M13、fd载体，复制 起点来自噬菌体。 3. COS质粒载体—质粒载体中插入λcos片段， 以利于体外包装 4.噬粒载体（phagemid）—有质粒和M13、fd 的复制起点，以质粒或噬菌体方式复制。
6) λ载体的种类
i. 插入型—即将外源DNA直接插入已构建载体中，如 λgt11，可以插入长达7 Kb的DNA。这类载体被限制酶 切成左右臂。 ⅱ.取代型—即利用一段外源DNA去取代载体中的一段 DNA，而这段DNA常含有一定的标记基因。这类载体 常被限制酶切为三段：左臂、隔离段和右臂。 * 有的取代型λ载体亦可用作插入型载体,如Charon 4A
ⅲ. 多克隆位点集中排列，有利于克隆片段的物理图谱的
绘制。 除上述三个特点外，pUC系列载体还可用于表达外源 基因 （LacZα启动子）。
pBS载体的结构
pBS-SK(-)
T7
Plac
T3
pBS-KS(-)
Plac
LacZα ori
F1(-)
pBS
(3.0 kb) Ampr
ori
三. 噬菌体载体
二、质粒与质粒载体
1. E．coli的质粒种类
1) colE1因子（大肠杆菌素因子）—多数不能进行接 合转移DNA，属高拷贝松弛型。 2) R因子（抗药性因子） 可接合转移DNA，属低拷贝 严紧型， 质粒较大，操作不便 3) F因子（性因子）
2.质粒的特点
1) 质粒DNA复制与染色体复制无关 2) 质粒DNA以超螺旋形式存在 3) 质粒DNA可以接合转移 4) 质粒的不相容性和不相容群 5) 质粒DNA的消除—化学和物理法(吖啶染料， EtBr，高温等) 6) 质粒的整合—F因子又可整合到E.coli染色体中
分子克隆技术讲解课件
pUC19
pUC18 和 pUC19
小、高拷贝数, 长2686 bp 只有多克隆位点(MCS)排列 方向不同pUC18/19 含有: (1) pMB1 复制子rep (来自 pBR322)，因缺失了rop 基因和在pMB1的 rep 复制子
单个位点突变而导致了高拷贝数; (2)编码 beta-内 酰胺酶的bla基因，赋予对氨苄青霉素的 抗性 (来自 pBR322)，这个基因上有两个点突变， 因而不同于pBR322的 bla基因; (3) lac 操作元的区域
pUC19图
pBluescript II系列
均为2961 bp 长，用于DNA 克隆、双脱 氧 DNA 测序、体外诱变和在简单体系中 体外转录。 pBluescript II SK 和 KS 这两 个载体只有lacZ基因中的多克隆位点的方 向不同。
pBluescript II载体上的重要位点
Lambda噬菌体唯一切点
Lambda噬菌体载体
cos质粒
是lambda噬菌体和质粒的杂种，其优点 是可以用来插入较大的DNA片段，再转 入细菌。
cos质粒 载体
一个典型的质粒克隆技术涉及5步
1) 用限制性内切酶消化 DNA 样品 2)用限制性内切酶消化 质粒DNA 3) 连接样品DNA和质粒DNA的消化产物
pUC系列质粒
是2.7Kb的双链DNA质粒，有一个复制起点，一 个氨苄青霉素抗性基因和一个多克隆位点，多 克隆位点处于表达LacZ基因产物-β-半乳糖苷 酶的氨基端片段，用pUC质粒转化LacZ基因有 突变的大肠杆菌株（M15）时，因为由质粒表 达的α－肽补充了大肠杆菌却失的α－肽，所 以恢复了分解半乳糖的能力。在加入IPTG和Xgal的培养基上，长出蓝色克隆。如果在多克隆 位点内插入外源DNA，由于它破坏了α－肽的 表达，因而在加入IPTG和X－gal的培养基，不 能长出蓝色克隆，这就是所谓的蓝白筛选。
基因克隆的载体 PPT课件
基因克隆的载体
载体（vector）是由在细胞中能 够自主复制的ＤＮＡ分子构成的一种 遗传成分，通过实验手段可使其它的 ＤＮＡ片段连接在它的上面，而进行 复制，作为基因工程的载体，必须具 备以下几个性能：
1、分子较小，可携带比较大的ＤＮＡ片段。
2、能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。
3、要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制
主要基因
非接合型质粒 自主复制基因，长生大肠杆菌素基因
按抗性记号分类 Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基因
R质粒(R因子)
自主复制基因，转移基因，细菌染色体区段 F质粒（ F因子）
自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因 自主复制基因，转移基因，抗菌素抗性基因 自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因
流程：
首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠 （SDS）来促进大肠杆菌的细胞裂解。
将溴化乙锭的氯化铯溶液加到清亮的 大肠杆菌裂解液中，EB会嵌入到DNA链 的碱基中去。
在EB达到饱和时，进行氯化铯密度 梯度离心。
2.碱变性法：
根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体 DNA片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来 的。
酶又要最少的切割位点（多克隆位点 multiple cloning sites ，MCS） 。
4、有适合的标记，易于选择。
5、有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达， 并且尽可能是高效的表达。
6、从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于 在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。
载体
功能
克隆载体: 克隆一个基因或DNA片断
作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适 当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的 质粒载体。
载体（vector）是由在细胞中能 够自主复制的ＤＮＡ分子构成的一种 遗传成分，通过实验手段可使其它的 ＤＮＡ片段连接在它的上面，而进行 复制，作为基因工程的载体，必须具 备以下几个性能：
1、分子较小，可携带比较大的ＤＮＡ片段。
2、能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。
3、要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制
主要基因
非接合型质粒 自主复制基因，长生大肠杆菌素基因
按抗性记号分类 Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基因
R质粒(R因子)
自主复制基因，转移基因，细菌染色体区段 F质粒（ F因子）
自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因 自主复制基因，转移基因，抗菌素抗性基因 自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因
流程：
首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠 （SDS）来促进大肠杆菌的细胞裂解。
将溴化乙锭的氯化铯溶液加到清亮的 大肠杆菌裂解液中，EB会嵌入到DNA链 的碱基中去。
在EB达到饱和时，进行氯化铯密度 梯度离心。
2.碱变性法：
根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体 DNA片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来 的。
酶又要最少的切割位点（多克隆位点 multiple cloning sites ，MCS） 。
4、有适合的标记，易于选择。
5、有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达， 并且尽可能是高效的表达。
6、从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于 在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。
载体
功能
克隆载体: 克隆一个基因或DNA片断
作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适 当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的 质粒载体。
分子克隆载体的选择-PPT课件
5. 合适的克隆位点
单克隆位点和多克隆位点
第九节
分子克隆载体的组建
构建克隆载体必须考虑的条件：复制起点，克隆位点， 标记基因，载体容量等。
1. 克隆位点的建立
1) 体外重组
i. 减少限制酶识别位点 ii. 增加限制酶识别位点： 人工接头，匹配接头
2) 体内重组或突变
i. 减少限制酶识别位点 体内自发突变和体外限制酶切富集。如在构建pSUPV系 列载体时，去除Kanr 基因中的indIII位点就采用了以下技 术路线： 培养有pNG35的大肠杆菌细胞 提取质粒DNA 用HindIII 完全酶切 转化大肠杆菌 再提取质粒DNA 再酶切，
2. 标记基因的建立
1）启动子 2）编码区—密码子偏爱性，基因产物适用范围 3）终止子
3. 载体容量
尽可能除去无关的DNA序列。
第二章 练习题
1．当一DNA片段插入终止子探针型载体pBU10的HindⅢ克隆位 点后，重组质粒仍可转化E.coli (CmlsTcs) 为CmlrTcr ，为什么? 可设计什么实验证明其假设? 2．当一DNA片段插入pUC18后，在x-gal平板上出现两类菌落， 兰色菌落和白色菌落。从白色菌落中分离纯化的质粒经电泳 检查，均比原载体DNA分子大；但从兰色菌落随机分离的质 粒DNA却有两类，其中一类与载体大小相同，另一类却与白 色菌落中分离的质粒大小相同。如何解释这一实验结果? 可 设计何种实验证明你的解释是正确的? 3．当把一外源DNA插入一克隆载体后，重组DNA分子转化 E.coli 细胞所获得的重组子分子可根据其限制酶图谱分为两类， 即这两类转化子中所含的重组DNA分子的限制酶图谱不一样， 从这两类转化细胞中分离到的重组DNA分子可用限制酶回收 插入的片段。而从这两类转化细胞培养液所分离到的DNA却
克隆载体课件
装到噬菌体颗粒中，以实行对大肠杆菌非常有效的侵染。 噬菌斑的形成：将λ侵染的细胞分布在未被侵染的大肠杆菌菌苔中会形成噬菌斑，是由 于侵染和细胞裂解循环而抑制了细胞生长的区域。 λ溶原体：利用λ噬菌的溶原生长期将克隆基因整合进大肠杆菌基因组，以使其长期表达。 溶原体 样操作双链环状M13NDA，但产生的噬菌体颗粒内仅含有环状ssDNA。 克隆到M13：用标准质粒克隆方法将重组DNA整合到M13载体，重组的M13DNA侵染敏 克隆到 感性大肠杆菌细胞，并形成生长缓慢的噬菌斑，然后从纯培养基中的噬菌体颗粒中分离出 ssDNA。 质粒－ 质粒－M13杂合载体：在辅助噬菌体帮助下，对宿主细胞的侵染，可诱导含有M13复 杂合载体 制起点的质粒形成单链噬菌体颗粒。
连接产物
将目的片段与质粒载体连接时，最常见的非目标产物就是 线性载体片段自身环化所形成的空质粒载体。自环化载体 可通过从转化克隆中小量提取质粒，然后酶解及随后的琼 脂糖凝胶电泳分析的方法来与重组体相区分，但用此法进 行大规模筛选是极不方便的，目前已开发出更有效的、便 于筛选的一系列载体。
双抗生素抗性
λ溶原体
λ 感染的溶原期也被克隆技术所利用。通过 含有目的序列的λ载体的整合作用可将基因或 外原序列整合进大肠杆菌基因组，这种基本 上是永久性的。该方法应用例子之一就是用 T7系统来过量表达蛋白质的菌株。含有Lac 启动子控制下的T7RNA聚合酶基因的菌株 BL21及其衍生物，作为λ溶原菌被命名为 DE3.该基因可被IPTG诱导，然后聚合酶将转 录出表达载体上的目的基因。
已克隆位点
因为在pUC载体上与克隆片段的插入位点相邻处有 一个启动子，很容易想象这样的启动子可用来转录 DNA，无论是在体外产生用作杂交探针的RNA转录 物，还是表达插入片段内基因的蛋白质产物，都不 成问题。 目前已构建了多种 转录型载体，以便开在体外进行 克隆片段的转录。例如，pGEM系列载体中就含有 来自噬菌体T7和SP6的启动子，两启动子间是MCS。 来自噬菌体的启动子只能被各自相应的噬菌体RNA 聚合酶所识别，上述两启动子中的任一种均可用于 体外转录克隆片段 的目的链。
《分子克隆实验设计》PPT课件
二、特点： 1、可用2ul菌液做模板，快速，方便，可批量
检测。 2、不能检测基因插入方向 3、不能检测基因内部突变。
可整理ppt
18
测序验证
一、选取阳性克隆，送公司测序； 二、特点： 1、最可靠的检测方法。可确定基因
的重组，插入的方向，基因内部的突变 等。 2、价格贵，适于1～2个克隆的验证。
（3）70％乙醇---------------------------沉淀质粒，除去异丙醇，盐分。 (4) RNase--------------------------------除去细菌RNA
可整理ppt
5
质粒的提取原理－碱裂解法
Protocal:
(1)
初 (2)
(3)
(4)
抽 (5)
(6)
烘干10-30 min, －－－－－－－－－－－－－－－－－ 除去乙醇
50 ul ddH2O (含0.1 mg/ ml RNase), 37°C* 30 min.－－－－除去细菌RNA
电泳鉴定
可整理ppt
6
质粒的保存
1.ddH2O (可含EDTA) 中可短期保存 [4 ℃保存1月; -20 ℃可保存一年]
11
转化
1、连接产物 5 ul加入感受态细胞中； 2、混匀，冰上30min-------cell 吸附DNA 3、42 ℃, 90 s－－－－热击，促进DNA进入cell 4、冰上1～2min－－使细胞复原 5、加1ml LB (无 Amp)－－外源DNA还未表达 6、 37 ℃培养1h－－Amp抗性基因表达 7、6000rpm*30s，浓缩100ul 8、涂板（Amp板）－－抗性筛选 9、37 ℃培养过夜。
16
酶切电泳筛选(*)
检测。 2、不能检测基因插入方向 3、不能检测基因内部突变。
可整理ppt
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测序验证
一、选取阳性克隆，送公司测序； 二、特点： 1、最可靠的检测方法。可确定基因
的重组，插入的方向，基因内部的突变 等。 2、价格贵，适于1～2个克隆的验证。
（3）70％乙醇---------------------------沉淀质粒，除去异丙醇，盐分。 (4) RNase--------------------------------除去细菌RNA
可整理ppt
5
质粒的提取原理－碱裂解法
Protocal:
(1)
初 (2)
(3)
(4)
抽 (5)
(6)
烘干10-30 min, －－－－－－－－－－－－－－－－－ 除去乙醇
50 ul ddH2O (含0.1 mg/ ml RNase), 37°C* 30 min.－－－－除去细菌RNA
电泳鉴定
可整理ppt
6
质粒的保存
1.ddH2O (可含EDTA) 中可短期保存 [4 ℃保存1月; -20 ℃可保存一年]
11
转化
1、连接产物 5 ul加入感受态细胞中； 2、混匀，冰上30min-------cell 吸附DNA 3、42 ℃, 90 s－－－－热击，促进DNA进入cell 4、冰上1～2min－－使细胞复原 5、加1ml LB (无 Amp)－－外源DNA还未表达 6、 37 ℃培养1h－－Amp抗性基因表达 7、6000rpm*30s，浓缩100ul 8、涂板（Amp板）－－抗性筛选 9、37 ℃培养过夜。
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酶切电泳筛选(*)
分子克隆技术概述最新PPT资料
核酸凝胶电泳
细菌转化技术 （包括感受态细胞制备）
DNA序列分析技术
《分子生物学实验指导》：郜金荣，叶林柏，武汉大学出版社，2007. Cohen Group第一次实现了细菌遗传性状转移示意图 19世纪中 孟德尔 豌豆杂交试验 确定遗传因子 1973年，Cohen Group将的tetr质粒psclol和nersrR6-3质粒进行体外限制酶切割，并连接成一个新的质粒，转化，在含四环素和新霉素 的平板上筛选出了terrNer的转化子,实现了细菌遗传性状的转移。 将成熟的胚胎移植到第三只母羊子宫中发育，妊娠（同正常一样），最后产下多利。
第一章分子克隆技术概述
本课程的主要内容
• 分子克隆概述 • 基因克隆工具酶 • 基因克隆载体和宿主 • 目的基因的分离 • 基因克隆操作过程 • 基因克隆的策略 • 目的基因在宿主中的表达
参考书目资料
• 《分子克隆实验指南》（第三版）：美J.萨姆布鲁克等著, 黄培堂等译， 科学出版社， .
• 《Gene IX》：Benjamin Lewin编著.
基因工程的基本特点是，分子水平操作，细胞水平表达。
我们应该记住他们——
1.第一个实现DNA重组的人－Berg
1972 年 ， Berg 用 Ⅰ 切 割 SV40DNA 和 λphageDNA ， 经 过 连 接 组 成 重 组 的 DNA 分 子 。 Berg 是 第 一 个 实 现 DNA重组的人。
2．(“交通工具车子”)——载体 （1）有了切割与缝合（ligase）基因DNA的工具，还得有
一个“车子”将重组DNA送到宿主细胞中去。 （2）1946年起，Lederberg开展了细菌性因子（F因子）
的研究。50-60年代相继发现了 R因子（抗药因子）， CoE(大肠杆菌因子)等质粒。 （3）然而，直到1973年Cohen才能将质粒作为基因工程载 体使用（至今一直是基因工程最重要最广泛使用的载体）。 这是基因工程的第二个技术准备。
克隆载体表达载体(课件)PPT课件
详细描述
组成型表达载体是将基因整合到宿主细胞的染色体上，使基因在任何生长条件下都能稳定表达。这种 表达载体适用于需要持续稳定表达的基因。
组织特异性表达载体
总结词
在特定的组织或器官中，表达载体才能 启动基因的表达。
VS
详细描述
组织特异性表达载体是将基因与特定的组 织或器官相关的调控序列结合，使基因只 在特定的组织或器官中表达。这种表达载 体适用于需要组织特异性表达的基因。
05
克隆载体和表达载体的未来发展
克隆载体和表达载体的新技术和新方法
基因编辑技术
利用CRISPR-Cas9等基因编辑技术，实现对克隆载体和表达载体的精确修饰，提高基 因治疗的效率和安全性。
人工染色体技术
开发人工染色体技术，实现对大型基因组的克隆和表达，为遗传病研究和治疗提供新的 工具。
克隆载体和表达载体的新应用和新领域
04
克隆载体和表达载体的应用
克隆载体在基因工程中的应用
基因克隆
克隆载体可以将目的基因插入到质粒 或病毒载体中，实现基因的复制和扩 增，为基因工程提供大量目的基因。
基因保存
基因突变
通过将目的基因插入到克隆载体中， 进行定点突变或随机突变，研究基因 功能和蛋白质活性。
克隆载体可以保存和传递目的基因， 为基因工程提供长期稳定的基因来源。
01
02
03
基因治疗
利用克隆载体和表达载体， 开发新型基因治疗策略， 针对遗传性疾病、肿瘤等 进行有效治疗。
生物制药
通过克隆载体和表达载体， 实现高效、大规模的蛋白 质药物生产，推动生物制 药产业的发展。
农业育种
利用克隆载体和表达载体， 培育抗逆、抗病、高产的 农作物新品种，提高农业 生产效益。
组成型表达载体是将基因整合到宿主细胞的染色体上，使基因在任何生长条件下都能稳定表达。这种 表达载体适用于需要持续稳定表达的基因。
组织特异性表达载体
总结词
在特定的组织或器官中，表达载体才能 启动基因的表达。
VS
详细描述
组织特异性表达载体是将基因与特定的组 织或器官相关的调控序列结合，使基因只 在特定的组织或器官中表达。这种表达载 体适用于需要组织特异性表达的基因。
05
克隆载体和表达载体的未来发展
克隆载体和表达载体的新技术和新方法
基因编辑技术
利用CRISPR-Cas9等基因编辑技术，实现对克隆载体和表达载体的精确修饰，提高基 因治疗的效率和安全性。
人工染色体技术
开发人工染色体技术，实现对大型基因组的克隆和表达，为遗传病研究和治疗提供新的 工具。
克隆载体和表达载体的新应用和新领域
04
克隆载体和表达载体的应用
克隆载体在基因工程中的应用
基因克隆
克隆载体可以将目的基因插入到质粒 或病毒载体中，实现基因的复制和扩 增，为基因工程提供大量目的基因。
基因保存
基因突变
通过将目的基因插入到克隆载体中， 进行定点突变或随机突变，研究基因 功能和蛋白质活性。
克隆载体可以保存和传递目的基因， 为基因工程提供长期稳定的基因来源。
01
02
03
基因治疗
利用克隆载体和表达载体， 开发新型基因治疗策略， 针对遗传性疾病、肿瘤等 进行有效治疗。
生物制药
通过克隆载体和表达载体， 实现高效、大规模的蛋白 质药物生产，推动生物制 药产业的发展。
农业育种
利用克隆载体和表达载体， 培育抗逆、抗病、高产的 农作物新品种，提高农业 生产效益。
克隆载体-精品
转移特征： 分转移性和非转移性两个特征
命名规则： pUC19
“p”表示质粒（plasmid）
“UC”表示发现或构建该质粒的作者或实验室名称
“19”表示该质粒的实验编号
2020/7/2
9
质粒的生物学特性
1. 寄生性，质粒的宿主范围很广 2. 稳定性 3. 自主复制性，质粒的拷贝数多 4. 传递性 5. 表型效应 6. 可消除性 7. 重组性 8. 分子量较小 9. 不相容性，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同
5. Phagemid载体
一类由噬菌体功能片段和质粒构建的复合载体
2020/7/2
6
I
细菌质粒 载体
II
噬菌体 载体
III
柯斯质粒 载体
2020/7/2
7
I.细菌质粒载体
概念： 质粒是细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的、 能自我复制、易分离和导入的环状双链DNA分子
质粒是基因工程中最常用的运载体 而最常用的质粒是大肠杆菌的质粒
质粒的复制能在宿主细胞外完成吗？ 质粒的存在对宿主细胞有无影响？
2020/7/2
8
分类：
F质粒（F因子或性质粒）
R质粒（抗药性因子）
Col质粒（大肠杆菌素因子）
复制类型： “严紧型”的低拷贝复制质粒（拷贝数少，为1-5个） 与“松弛型”高拷贝复制质粒的（拷贝数多，可达10-200个拷 贝）。因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。
一个寄主细胞系中稳定地共存的现象
质粒能够“友好”地“借居”在宿主细胞中。一般来说，质 粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。但是，质粒的 复制则只能在宿主细胞内完成
2020/7/2
10
质粒载体的修饰改造
5第五讲分子克隆载体
黏粒载体(cosmid vector)
基本特征： 1 是质粒的衍生物，是带有cos位点的质粒。 2 其组成有质粒的复制起点(ColE1)、抗性基
因、cos位点、MCS。 3 大小为5～7kb 4 能克隆的外源DNA片段最大达40kb。
黏粒载体的特点：
（1）具有λ 噬菌体的特性（但因不含λ 噬菌 体的全部必需基因，因此不能通过溶菌周 期，无法形成子代噬菌体颗粒）；
质粒的存在形式：
一般以超螺旋共价闭环DNA分子(ccc-DNA) 的形式存在。
也可以开环DNA分子(oc-DNA)和线性DNA分 子(L-DNA)的形式存在。
质粒DNA的大小
质粒
宿主
pPbs
蓝藻
CoLE1
大肠杆菌
PV21
三叶草根瘤菌
多数在10kb左右
大小（kb） 1.5 6.4 700
质粒的基本性质： 1 复制
利用染色体的复制功能来驱动外源DNA片段 复制的载体。
1 酵母人工染色体载体(YAC) 2 细菌人工染色体载体(BAC)
酵母人工染色体载体(YAC)
利用酿酒酵母染色体的复制元件构建的载体。 复制的必须元件：
作为克隆载体的DNA分子具备的条件：
1 具有对受体细胞的可转移性，能携带外源 基因进入宿主细胞；
2 能在宿主细胞中自主复制，一限制酶识别位点组成的多克隆 位点(MCS）；
4 克隆载体必须具有用于选择克隆子的标记 基因；
5 克隆载体必须是安全的，不应含有对受体 细胞有害的基因，并且不会任意转入除受 体细胞以外的其他生物的细胞，尤其是人 的细胞。
MCS
lacZ`
Ampr Ori
含四个部分：
（1）来自pBR322的质粒 复制起点（ori）；
分子克隆ppt课件
精选ppt课件
22
重组DNA的筛选与鉴定
重组DNA的筛选与鉴定方法
1 平板筛选（插入失活、蓝白筛选） 2 限制酶切图谱筛选 3 PCR筛选重组体 4 原位杂交技术
精选ppt课件
23
• 平板筛选
是指利用载体的遗传性标记在平板上直接 筛选的方法。具有抗药性标记的载体转化 宿主细胞后，能在含抗生素（Amp或Tet） 的培养平板上生长；未转化的则不能生长
M13噬菌体
一种典型的纤维状结构，其DNA分子相比λ噬菌体要小的多，长 度仅6407个核苷酸，通常为环状双链DNA
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8
λ噬菌体结构
• 它本身是一种核蛋白，核心是一段DNA，结构上 有一个蛋白质外壳和尾巴，尾巴上的微丝可以把 噬菌体的DNA注入细菌内
精选ppt课件
9
cos位点的作用
• cos位点在λ噬菌体侵染周期中起着两种截 然不同的作用
α-互补
细菌表达： β-半乳糖苷酶活性↑
5-溴-4-氯-3-吲哚（ X-gal） → 形成蓝色菌落
当在质粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→不能与宿主β-半 乳糖苷酶的C端进行α-互补→产生白色菌落
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3 要有尽可能多种限制酶的切 割位点，但每一种限制酶又 要最少的切割位点
4
有时还要求载体要能启动外源 基因进行转录及表达，并且尽 可能是高效的表达
载体的特性
5
从安全角度考虑，要求载体不 能随便转移，仅限于在某些实 验室内特殊菌种内才可复制
6 有适合的标记，易于选择
精选ppt课件
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（2）具有质粒的特性（有质粒复制子及抗菌 素基因）；
（3）具有高容量的克隆能力（本身仅5-7kb, 克隆极限可达40kb左右）；
（4）具有与同源序列质粒进行重组的能力。 广泛应用于基因组DNA的构建。部分柯斯质粒的基本特性
人工染色体载体
(artificial chromosome vector) 人工染色体载体：
将质粒pSF124中含ampr基因的DNA片段和质粒pSC101 中含tetr基因的DNA片段同含ColE1复制起始点 (来源于 pMB1、 松散型 )的DNA片段重 组，构建成质粒克隆载体 pBR322。
普通型载体pBR322的结构图
PstI
ScaI
Ampr
HindIII BamHI
SalI
pBR322
1 插入型载体(insertion vector): 通过特定酶切位点允许外源DNA片段插
入的载体。外源DNA片段大小0～ 6 kb。 2 置换型载体(replacement vector):
允许外源DNA片段替换非必须DNA片段 的载体。外源DNA片段大小9～23kb。
插入型载体
主要用于cDNA克隆，允许插入的外源 DNA片段大小为0～6kb。基因cI内的E.coRI 位点作为唯一位点，可以用于外源DNA的插 入。
质粒的存在形式：
一般以超螺旋共价闭环DNA分子(ccc-DNA) 的形式存在。
也可以开环DNA分子(oc-DNA)和线性DNA分 子(L-DNA)的形式存在。
质粒DNA的大小
质粒
宿主
pPbs
蓝藻
CoLE1
大肠杆菌
PV21
三叶草根瘤菌
多数在10kb左右
大小（kb） 1.5 6.4 700
质粒的基本性质： 1 复制
（为什么？）
pUC质粒
pUC质粒系列是在pBR322基础上改建成的； 包括pBR322的ampr基因； 缺乏控制拷贝数的rop基因。
pUC的主要优点：
（1）分子量更小，仅为2686bp，容纳外源DNA量增大； 具有更高的拷贝数（每个细胞含500-700个拷贝）。 （2）含易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZ， 可利用-互补原理进行蓝白筛选。 （3）多克隆位点区（MCS）由人工合成的多个单一酶切 位点构成。
2 正确获得构建质粒载体克隆元件 一般用限制酶切割出发质粒DNA分子，获
得含有某种元件的DNA片段。 为了获得含某种元件的DNA片段，选用的
切割位点既要保证元件完整无缺，又要使 DNA片段愈小愈好，尽可能不含或少含不必 要的序列，使构建的载体尽可能小。
构建质粒载体的基本原则
3 组装合适的选择标记基因
作为克隆载体的DNA分子具备的条件：
1 具有对受体细胞的可转移性，能携带外源 基因进入宿主细胞；
2 能在宿主细胞中自主复制，并实现外源基 因的增殖；
3 具有由单一限制酶识别位点组成的多克隆 位点(MCS）；
4 克隆载体必须具有用于选择克隆子的标记 基因；
5 克隆载体必须是安全的，不应含有对受体 细胞有害的基因，并且不会任意转入除受 体细胞以外的其他生物的细胞，尤其是人 的细胞。
3’NN……CGCCGCTGGA5’ 把此末端称为 COS位点(cohesive end site) 3 其有50个以上基因 4 有56种限制酶识别位点 5 生长途径有溶源途径和溶菌途径。
溶菌途径：噬菌体感染宿主细胞后，其DNA不插 入染色体DNA，经过一段时间的潜伏期，就大 量增殖新的病毒颗粒，使宿主细胞破裂，释放 的病毒颗粒又感染其他细胞。（左图示）
当质粒载体承载目的基因转化受体细胞时，考虑 受体细胞内原有的质粒与作为克隆载体的质粒是否属 于亲和性质粒。
作为受体细胞最好不含内源质粒。
3 质粒的转移性
接合型质粒 (conjugative plasmid)： 转移基因tra：指令宿主细胞产生菌毛、合
成细胞表面物质，促使宿主细胞与受体细胞的 结合，使质粒从一个细胞转移到另一个细胞。
一般来说，希望构建的质粒克隆载体是 松散型的，所以在构建的克隆载体中应含 有松散型的复制起始位点和调控复制拷贝 数的基因。
2 质粒的不相容性(incompatibility): 两种质粒在同一宿主细胞中不能共存的现象。
亲缘关系密切的不同质粒一般属于不亲和性质粒。
野生型质粒与其衍生的重组质粒属于不亲和性质 粒。
多克隆位点
MCS
复制起始点 ori
遗传标记
Ampr
克隆载体
按功能分： 克隆载体 表达载体
质粒克隆载体 (plasmid cloning vector)
质粒(plasmid):是一种寓于宿主细胞中染色体外裸露 的dsDNA分子。
一个质粒就是一个DNA分子。
Plasmid
chromosome
存在于细菌、真菌、蓝藻和绿藻的细胞中，在外源DNA片段的大小 为0～7.2kb。基因lac5编码区终止密码子之 前有一个E.coRI，可以用于外源DNA的插入。
置换型载体
在填充片段两端有对称分布的MCS，这两 个载体的差别是MCS位点的排列位置相反。
M13噬菌体载体
基因工程中常对单链DNA测序、制备探针或 实施定点突变，应用此载体就可以获得单链DNA。
3.构建的质粒克隆载体必须含有供选择克隆 子的标记基因。
4.构建的质粒克隆载体DNA分子应尽可能小。
5.根据特殊需要，使构建的质粒克隆载体中 组装各种元件，构建成不同用途的质粒克 隆载体。
质粒的命名
用小写字母p代表质粒（plasmid），在p字 母后用两个或三个大写字母代表发现这一质粒 的作者或实验室名称，再加上质粒编号。
λDNA的限制性核酸内切酶谱（Kb）
λ噬菌体载体的构建过程
1 去除非必须区，建立外源DNA片段的克隆或替 换位点；
2 在λDNA的非必须区内插入选择标记基因 cI基因：它的表达使噬菌体进入溶原状态，
基因产物活性受到影响会促进噬菌体进入裂解 循环。
如果外源DNA片段插入基因cI中，将高效地 使hfl突变的E.coli进入裂解生长状态。
如：pBR322：p表示一种质粒，而“BR”则是分 别取自该质粒的两位主要构建者F. Bolivar和R. L. Rodriguez，322为编号。
选择标记基因：(用于鉴别目的DNA的存在， 将成功转化了载体的宿主挑选出来）
(1)氨苄青霉素抗性基因 (ampr apr) (2)卡那霉素抗性基因 (kanr kmr)
非接合型质粒(non-conjugative plasmid)： 顺式作用元件： bom位点 移动基因：mob基因 (分子质量小、拷贝数多、被动迁移)
构建质粒载体的基本原则
1 选择合适的出发质粒 必备元件： A 复制起始点 B 选择标记基因 C 克隆位点 D 启动子 E 终止子 等等………..
构建质粒载体的基本原则
黏粒载体(cosmid vector)
基本特征： 1 是质粒的衍生物，是带有cos位点的质粒。 2 其组成有质粒的复制起点(ColE1)、抗性基
因、cos位点、MCS。 3 大小为5～7kb 4 能克隆的外源DNA片段最大达40kb。
黏粒载体的特点：
（1）具有λ 噬菌体的特性（但因不含λ 噬菌 体的全部必需基因，因此不能通过溶菌周 期，无法形成子代噬菌体颗粒）；
目的基因
限制性内切酶
载体
限制性内切酶
重组体
DNA ligase
载体自连
目的基因 自连
基因操作的基本步骤
载体
单独一个包括启动子、编码区和终止子的 基因，或者组成基因的某个元件，一般是不 易进入受体细胞的，即使采用理化方法进入 细胞后，也不容易在受体细胞内维持。
载体(vector): 能携带外源基因（或 DNA片段）进入细胞复制、整合或表达 的工具。
MCS
lacZ`
Ampr Ori
含四个部分：
（1）来自pBR322的质粒 复制起点（ori）；
（2）ampr ;
（3）大肠杆菌β半乳糖苷酶
基因（lacZ）的启动子及其 编码α-肽链的DNA序列；
（4）多克隆位点（MCS）
pUC18 pUC19
Lac Z`
Lac Z`
Insert
ampr
No insert
利用染色体的复制功能来驱动外源DNA片段 复制的载体。
1 酵母人工染色体载体(YAC) 2 细菌人工染色体载体(BAC)
酵母人工染色体载体(YAC)
利用酿酒酵母染色体的复制元件构建的载体。 复制的必须元件：
的基因。（外源DNA片段的插入）
λ噬菌体的基因组分区
右区：gam基因右边—Rz基因之间的基因 主要用于噬菌体的复制和裂解宿主菌。
用λ噬菌体作为克隆载体的依据
1 它是一种温和噬菌体。 2 能承载比较大的外源DNA片段。
野生型的头部能包装λ DNA分子大小 75%～105%的DNA片段，约36.4～51kb。 3 在λ DNA分子上有许多限制性酶识别位点。
4
5
构建供转化大肠杆菌用的质粒载体，
可组装蓝/白颜色进行选择的(B-半乳糖苷酶
基因)lacz’基因。
6
但构建供转化蓝藻用的质粒载体不能
用这个基因。因为蓝藻含有大量的藻蓝蛋白。
构建质粒载体的基本原则
4 选用合适的启动子
如果用真核生物基因的启动子作为原核 生物表达克隆载体的启动子，其功效下降；
原核生物和病毒基因的启动子用作真核 生物表达克隆载体的启动子，可保留其原来 的功效。
溶源途径：感染宿主细胞后，其DNA与宿主细 胞染色体DNA整合，一起复制和传代，无感染其 他细胞的能力。（右图示）
λ噬菌体的生长途径
裂解循环
溶源态
λ噬菌体的基因组分区
左区：Nul基因—J基因之间的基因 其产物用于噬菌体DNA的包装和噬菌体颗粒
（3）具有高容量的克隆能力（本身仅5-7kb, 克隆极限可达40kb左右）；
（4）具有与同源序列质粒进行重组的能力。 广泛应用于基因组DNA的构建。部分柯斯质粒的基本特性
人工染色体载体
(artificial chromosome vector) 人工染色体载体：
将质粒pSF124中含ampr基因的DNA片段和质粒pSC101 中含tetr基因的DNA片段同含ColE1复制起始点 (来源于 pMB1、 松散型 )的DNA片段重 组，构建成质粒克隆载体 pBR322。
普通型载体pBR322的结构图
PstI
ScaI
Ampr
HindIII BamHI
SalI
pBR322
1 插入型载体(insertion vector): 通过特定酶切位点允许外源DNA片段插
入的载体。外源DNA片段大小0～ 6 kb。 2 置换型载体(replacement vector):
允许外源DNA片段替换非必须DNA片段 的载体。外源DNA片段大小9～23kb。
插入型载体
主要用于cDNA克隆，允许插入的外源 DNA片段大小为0～6kb。基因cI内的E.coRI 位点作为唯一位点，可以用于外源DNA的插 入。
质粒的存在形式：
一般以超螺旋共价闭环DNA分子(ccc-DNA) 的形式存在。
也可以开环DNA分子(oc-DNA)和线性DNA分 子(L-DNA)的形式存在。
质粒DNA的大小
质粒
宿主
pPbs
蓝藻
CoLE1
大肠杆菌
PV21
三叶草根瘤菌
多数在10kb左右
大小（kb） 1.5 6.4 700
质粒的基本性质： 1 复制
（为什么？）
pUC质粒
pUC质粒系列是在pBR322基础上改建成的； 包括pBR322的ampr基因； 缺乏控制拷贝数的rop基因。
pUC的主要优点：
（1）分子量更小，仅为2686bp，容纳外源DNA量增大； 具有更高的拷贝数（每个细胞含500-700个拷贝）。 （2）含易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZ， 可利用-互补原理进行蓝白筛选。 （3）多克隆位点区（MCS）由人工合成的多个单一酶切 位点构成。
2 正确获得构建质粒载体克隆元件 一般用限制酶切割出发质粒DNA分子，获
得含有某种元件的DNA片段。 为了获得含某种元件的DNA片段，选用的
切割位点既要保证元件完整无缺，又要使 DNA片段愈小愈好，尽可能不含或少含不必 要的序列，使构建的载体尽可能小。
构建质粒载体的基本原则
3 组装合适的选择标记基因
作为克隆载体的DNA分子具备的条件：
1 具有对受体细胞的可转移性，能携带外源 基因进入宿主细胞；
2 能在宿主细胞中自主复制，并实现外源基 因的增殖；
3 具有由单一限制酶识别位点组成的多克隆 位点(MCS）；
4 克隆载体必须具有用于选择克隆子的标记 基因；
5 克隆载体必须是安全的，不应含有对受体 细胞有害的基因，并且不会任意转入除受 体细胞以外的其他生物的细胞，尤其是人 的细胞。
3’NN……CGCCGCTGGA5’ 把此末端称为 COS位点(cohesive end site) 3 其有50个以上基因 4 有56种限制酶识别位点 5 生长途径有溶源途径和溶菌途径。
溶菌途径：噬菌体感染宿主细胞后，其DNA不插 入染色体DNA，经过一段时间的潜伏期，就大 量增殖新的病毒颗粒，使宿主细胞破裂，释放 的病毒颗粒又感染其他细胞。（左图示）
当质粒载体承载目的基因转化受体细胞时，考虑 受体细胞内原有的质粒与作为克隆载体的质粒是否属 于亲和性质粒。
作为受体细胞最好不含内源质粒。
3 质粒的转移性
接合型质粒 (conjugative plasmid)： 转移基因tra：指令宿主细胞产生菌毛、合
成细胞表面物质，促使宿主细胞与受体细胞的 结合，使质粒从一个细胞转移到另一个细胞。
一般来说，希望构建的质粒克隆载体是 松散型的，所以在构建的克隆载体中应含 有松散型的复制起始位点和调控复制拷贝 数的基因。
2 质粒的不相容性(incompatibility): 两种质粒在同一宿主细胞中不能共存的现象。
亲缘关系密切的不同质粒一般属于不亲和性质粒。
野生型质粒与其衍生的重组质粒属于不亲和性质 粒。
多克隆位点
MCS
复制起始点 ori
遗传标记
Ampr
克隆载体
按功能分： 克隆载体 表达载体
质粒克隆载体 (plasmid cloning vector)
质粒(plasmid):是一种寓于宿主细胞中染色体外裸露 的dsDNA分子。
一个质粒就是一个DNA分子。
Plasmid
chromosome
存在于细菌、真菌、蓝藻和绿藻的细胞中，在外源DNA片段的大小 为0～7.2kb。基因lac5编码区终止密码子之 前有一个E.coRI，可以用于外源DNA的插入。
置换型载体
在填充片段两端有对称分布的MCS，这两 个载体的差别是MCS位点的排列位置相反。
M13噬菌体载体
基因工程中常对单链DNA测序、制备探针或 实施定点突变，应用此载体就可以获得单链DNA。
3.构建的质粒克隆载体必须含有供选择克隆 子的标记基因。
4.构建的质粒克隆载体DNA分子应尽可能小。
5.根据特殊需要，使构建的质粒克隆载体中 组装各种元件，构建成不同用途的质粒克 隆载体。
质粒的命名
用小写字母p代表质粒（plasmid），在p字 母后用两个或三个大写字母代表发现这一质粒 的作者或实验室名称，再加上质粒编号。
λDNA的限制性核酸内切酶谱（Kb）
λ噬菌体载体的构建过程
1 去除非必须区，建立外源DNA片段的克隆或替 换位点；
2 在λDNA的非必须区内插入选择标记基因 cI基因：它的表达使噬菌体进入溶原状态，
基因产物活性受到影响会促进噬菌体进入裂解 循环。
如果外源DNA片段插入基因cI中，将高效地 使hfl突变的E.coli进入裂解生长状态。
如：pBR322：p表示一种质粒，而“BR”则是分 别取自该质粒的两位主要构建者F. Bolivar和R. L. Rodriguez，322为编号。
选择标记基因：(用于鉴别目的DNA的存在， 将成功转化了载体的宿主挑选出来）
(1)氨苄青霉素抗性基因 (ampr apr) (2)卡那霉素抗性基因 (kanr kmr)
非接合型质粒(non-conjugative plasmid)： 顺式作用元件： bom位点 移动基因：mob基因 (分子质量小、拷贝数多、被动迁移)
构建质粒载体的基本原则
1 选择合适的出发质粒 必备元件： A 复制起始点 B 选择标记基因 C 克隆位点 D 启动子 E 终止子 等等………..
构建质粒载体的基本原则
黏粒载体(cosmid vector)
基本特征： 1 是质粒的衍生物，是带有cos位点的质粒。 2 其组成有质粒的复制起点(ColE1)、抗性基
因、cos位点、MCS。 3 大小为5～7kb 4 能克隆的外源DNA片段最大达40kb。
黏粒载体的特点：
（1）具有λ 噬菌体的特性（但因不含λ 噬菌 体的全部必需基因，因此不能通过溶菌周 期，无法形成子代噬菌体颗粒）；
目的基因
限制性内切酶
载体
限制性内切酶
重组体
DNA ligase
载体自连
目的基因 自连
基因操作的基本步骤
载体
单独一个包括启动子、编码区和终止子的 基因，或者组成基因的某个元件，一般是不 易进入受体细胞的，即使采用理化方法进入 细胞后，也不容易在受体细胞内维持。
载体(vector): 能携带外源基因（或 DNA片段）进入细胞复制、整合或表达 的工具。
MCS
lacZ`
Ampr Ori
含四个部分：
（1）来自pBR322的质粒 复制起点（ori）；
（2）ampr ;
（3）大肠杆菌β半乳糖苷酶
基因（lacZ）的启动子及其 编码α-肽链的DNA序列；
（4）多克隆位点（MCS）
pUC18 pUC19
Lac Z`
Lac Z`
Insert
ampr
No insert
利用染色体的复制功能来驱动外源DNA片段 复制的载体。
1 酵母人工染色体载体(YAC) 2 细菌人工染色体载体(BAC)
酵母人工染色体载体(YAC)
利用酿酒酵母染色体的复制元件构建的载体。 复制的必须元件：
的基因。（外源DNA片段的插入）
λ噬菌体的基因组分区
右区：gam基因右边—Rz基因之间的基因 主要用于噬菌体的复制和裂解宿主菌。
用λ噬菌体作为克隆载体的依据
1 它是一种温和噬菌体。 2 能承载比较大的外源DNA片段。
野生型的头部能包装λ DNA分子大小 75%～105%的DNA片段，约36.4～51kb。 3 在λ DNA分子上有许多限制性酶识别位点。
4
5
构建供转化大肠杆菌用的质粒载体，
可组装蓝/白颜色进行选择的(B-半乳糖苷酶
基因)lacz’基因。
6
但构建供转化蓝藻用的质粒载体不能
用这个基因。因为蓝藻含有大量的藻蓝蛋白。
构建质粒载体的基本原则
4 选用合适的启动子
如果用真核生物基因的启动子作为原核 生物表达克隆载体的启动子，其功效下降；
原核生物和病毒基因的启动子用作真核 生物表达克隆载体的启动子，可保留其原来 的功效。
溶源途径：感染宿主细胞后，其DNA与宿主细 胞染色体DNA整合，一起复制和传代，无感染其 他细胞的能力。（右图示）
λ噬菌体的生长途径
裂解循环
溶源态
λ噬菌体的基因组分区
左区：Nul基因—J基因之间的基因 其产物用于噬菌体DNA的包装和噬菌体颗粒