课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
知识清单+练习（一）筛选菌株（1）实验室中微生物的筛选应用的原理人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。
（2）选择性培养基在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。
（3）配制选择培养基的依据根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。
例如，培养基中不加入有机物可以选择培养自养微生物；培养基中不加入氮元素，可以选择培养能固氮的微生物；加入高浓度的食盐可选择培养金黄色葡萄球菌等。
（二）统计菌落数目（1）测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法和显微镜直接计数。
（2）稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目的原理当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活细菌。
为了保证结果准确，一般设置3～5个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取平均值。
统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。
（三）设置对照设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。
（四）实验设计实验设计包括实验方案，所需仪器、材料、用具和药品，具体的实施步骤以及时间安排等的综合考虑和安排。
（1）土壤取样从富含有机物、潮湿、pH≈7的土壤中取样。
铲去表层土，在距地表约3～8cm的土壤层取样。
（2）制备培养基准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基。
牛肉膏蛋白胨培养基作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。
（3）微生物的培养与观察将土样以1、101、102……依次等比稀释至107稀释度，按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。
注明培养基种类、培养日期以及平板培养样品的稀释度。
将涂布好的培养皿放在30℃温度下培养。
随着培养时间的延长，会有不同的菌产生。
课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
【土壤中分解尿素的细菌的分离和计数】一、研究思路1．筛选菌株尿素是一种重要的肥，农作物不能直接吸收利用，而是首先通过土壤中的细菌将尿素分解为和CO2，才能被植物利用，土壤中的这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成。
可以利用这一特点，将其从土壤中筛选出来。
(1)实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于_____ _生长的条件(包括营养、、pH等)，同时____ _或其他微生物生长。
(2)选择培养基：在微生物学中，将允许的微生物生长，同时和其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。
2．统计菌落数目(1)常用来统计样品中数目的方法是__________ _______。
即当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中。
通过统计平板上的，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
为了保证结果准确，一般选择菌落数在的平板进行计数。
例如每克样品中的菌株数= ,C代表 ,V代表 ,M代表。
通常统计出的菌落数比活菌的实际数目。
这是因为。
因此，统计结果一般用而不是活菌数来表示。
(2) 也是测定微生物数量的常用方法。
(3)细菌的数目还可以通过法来测定。
例如，测定饮水中大肠杆菌的数量，可将的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现色，可以根据培养基上的数目，计算出水样中大肠杆菌的数量。
在该实验中至少应取___个水样。
3．设置对照(1)设置对照的主要目的是排除实验组中___________对实验结果的影响，提高实验结果的。
例如为了排除培养基是否被杂菌污染了，需用______________________________ 作为空白对照。
(2)对照实验是指除了的条件外，其他条件都的实验，其作用是比照实验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试的条件引起相应的结果。
二、实验设计实验设计包括对实验方案，所需仪器、材料，用具和药品，具体的以及时间安排等的综合考虑和安排。
关于土壤中某样品细菌的分离与计数的实验操作步骤如下：1．土壤取样土壤微生物约70%～80%为，主要分布在距地表的近性土壤中。
生物选修一2-2 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
一、 筛选菌株
自然界筛选 生存环境 寻找目的菌种时要根据它对________ 的要求， 相应 的环境中去寻找。 到______ 实验室筛选 目的菌株 生长的条件（包括营养、 人为提供有利于_________ 抑制或阻止 温度、PH等），同时__________ 其他微生物生长。 特定 选择培养基：在微生物学中，将允许＿＿＿
脲酶
CO2 + 2NH3
（一）筛选菌株 KH2PO4 1.4g
NaHPO4 2.1g
MgSO4 H2O
葡萄糖
0.2g
10.0g
该培养基的配方中，为 微生物的生长提供碳源和氮 源的分别是什么物质？ 碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素
此配方能否筛选出产生 琼脂 15.0g 脲酶的细菌？为什么？ 将上述物质溶解后， 能。只有产生脲酶的 用蒸馏水定容到 细菌能利用尿素作为氮 1000mL。 源而生存。
(四) 实验过程
2．1 根据图示2－7填写以下实验流程： 配制土 壤溶液 系列 稀释 涂布平板 与培养 菌落计 数
（五）操作提 示 （六）鉴定： 鉴别培养基：不影响微生 物的生存 酚红培养基： 原理：脲酶催化尿素分解 成氨→培养基碱性增强→ 酚 红变红→脲酶阳性
甲：没有重复实验（至少涂布3个平板） 乙：A组结果误差过大，不应用于计算平均值
（二）统计菌落数目 为什么？ 1、活菌计数法 （4）统计结果：统计的菌落数往往比活菌的实 际数目低，因此统计结果一般用菌落数表示。 每克样品中的菌株数=（C/V)* M C:某一稀释度下平板上生长的平均菌落数； V:所用稀释液的体积；M:稀释倍数。 当两个或者多个细胞连在一起时，平板 上只能观察到一个菌落。
１．某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平 板上ห้องสมุดไป่ตู้落数的平均值为234，涂布平板时所用稀 释液的体积为0.1mL，那么每克样品中的菌落数 是 (Ｂ ) A．2.34×108 B．2.34×109 C．234 D．23.4
2-2课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数研究思路（一）筛选菌株1、尿素是一种重要的氮肥，农作物（能，不能）直接吸收利用，而是首先通过土壤中的细菌将尿素分解为，这是因为细菌能合成。
2、PCR技术中使用的耐高温的酶是，它是从中分离出来的。
科学家能从中把筛选出来是因为，这样也适用于实验室中微生物的筛选，原理是_ 。
点评：生物适应一定环境，环境对生物具有作用。
所以通过配制选择培养基、控制培养条件等选择目的微生物。
〖本课题使用的培养基——见旁栏资料〗〖思考1〗在该培养基配方中，为微生物的生长提供碳源的是，提供氮源的的是，琼脂的作用是。
〖思考2〗该培养基对微生物（具有，不具有）选择作用。
如果具有，其选择机制是。
3、选择培养基是指特定种类的微生物生长，同时其他种类微生物生长的培养基（二）统计菌落数目1、在统计菌落数目时，常用来统计样品中活菌数目的方法是。
除此之外，也是测定微生物数量的常用方法。
【补充】显微镜直接计数是测定微生物的方法。
公式：观察到的红细胞平均数∶观察到的细菌平均数＝红细胞含量∶细菌含量2、统计菌落数目的理论依据是：当样品的稀释度足够时，_ 。
通过统计，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
因此，恰当的是成功地统计菌落数目的关键。
3、．为保证统计结果准确，通常将都涂布在平板上，培养后再选择的平板进行计数。
4、在设计实验时，一定要涂布至少个平板作为重复组，才能增强实验的说服力和准确性。
在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果，结果，意味着操作有误，需要重新实验。
〖思考3〗统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数的计算方法是_ 〖思考4〗第位同学的结果接近真实值。
你认为这两位同学的实验需要改进的操作是第一位同学需；第二位同学_ 。
5、统计的菌落数比活菌的实际数目。
因为当两个或多个细胞时，平板上观察到的只是菌落。
因此，统计结果一般用来表示。
课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
专题二微生物的培养与应用课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数吴晓宁1.（2017·广东揭阳模拟，39）下表是某公司研发的一种培养大肠杆菌菌群的培养基配方，请根据表格和所学知识回答下列相关问题：（1）大肠杆菌的同化类型为，从生态系统的成分上看，大肠杆菌属于。
（2）在微生物的实验室培养中，获得纯净培养物的关键是，因此需对培养基和培养皿进行（填“消毒”或“灭菌”），操作者的双手需要进行清洗和。
空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使，还能破坏DNA的结构。
（3）根据用途划分，该培养基属于（填“选择”或“鉴别”）培养基，若要分离能分解尿素的细菌需将培养基中换成，若要鉴定分解尿素的细菌还需将伊红－美蓝换成。
（4）培养大肠杆菌时，通过接种方法分离得到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，称为。
（5）使用以下微生物发酵生产特定产物时，所利用的主要微生物的细胞结构与大肠杆菌相同的是（多选）。
A.制作果酒B.由果酒制作果醋C.制作泡菜D.制作腐乳2.（2016·四川卷，10）图甲是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程，图乙是脲酶基因转录的mRNA部分序列。
（1）图中选择培养基应以为唯一氮源；鉴别培养基还需添加作指示剂，产脲酶细菌在该培养基上生长一段时间后，其菌落周围的指示剂将变成色。
（2）在5个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为105的土壤样品液0.1 mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。
该过程采取的接种方法是，每克土壤样品中的细菌数量为×108个；与血细胞计数板计数法相比，此计数方法测得的细菌数较。
（3）现有一菌株的脲酶由于基因突变而失活，突变后基因转录的mRNA在图乙箭头所示位置增加了70个核苷酸，使图乙序列中出现终止密码（终止密码有UAG、UGA和UAA）。
突变基因转录的mRNA中，终止密码为，突变基因表达的蛋白质含个氨基酸。
课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数核心知识要点1．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(1)分离原理：土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起到催化作用。
(2)统计菌落数目：统计样品中的活菌一般用稀释涂布平板法。
2．实验流程(1)土壤取样→富含有机质的土壤表层土(2)样品的稀释→通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板(3)接种→用稀释涂布平板法接种(4)培养⎩⎪⎨⎪⎧细菌：30～37 ℃培养1～2天放线菌：25～28 ℃培养5～7天霉菌：25～28 ℃培养3～4天(5)观察→根据菌落的特征区分微生物 (6)计数→统计菌落的数目(7)计算→根据公式“每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M[C 代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V 代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M 代表稀释倍数]”进行计算【重难详解】1．选择培养基四种常见制备方法或实例 方法一 加入某些特定物质2．两种计数方法的比较【解析误区】1．“选择菌落数在30～300的平板”的两个提醒用稀释涂布平板法计数微生物时，要求选择菌落数在30～300的平板进行计数。
解题时易出现以下误解： (1)只得到1个菌落数在30～300的平板是错误的。
错误的原因是不符合实验的重复原则，易受到偶然因素的影响。
(2)得到3个或3个以上菌落数在30～300的平板，也不一定正确，这可能有两种情况：①不同平板间差异较大，如得到3个平板，菌落数分别为230、34、240，虽然菌落数均在“30～300”，这也是不正确的，因为“34”与“230”“240”差异太大，应重新实验找出原因。
②不同平板之间差异不大，是符合要求的，用其平均值作为估算的最终结果。
可见，并不是只要得到3个“菌落数在30～300的平板”即可，而应该是涂布的同一稀释度的平板均符合“菌落数在30～300之间”且无较大差异，说明实验操作合格，才能按照计算公式进行计算。
专题二 课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
()
A．3 号试管中的菌落稀释倍数为 103 倍 B．4 号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数可能是 5
号的 10 倍 C．5 号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为 1.7×109 个 D．该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要高
2.结果分析与评价
内容
结论分析
①空白对照组培养基上无菌落生长→未被杂菌
是否有杂菌污 污染；②空白对照组培养基上有菌落生长→被
染
杂菌污染；③实验组选择培养基上菌落形态多
样，菌落数偏高→培养基上可能混入其他氮源
选择培养基是 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目明显多于选
否具有筛选作 择培养基上的菌落数目→选择培养基具有筛选
时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的 一个 活菌 。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中
大约含有多少活菌。 (2)测定微生物数量的常用方法还有 显微镜直接计数法 。 3．设置对照：排除实验组中 非测试因素 对实验结果的影响，
提高实验结果的 可信度 。
二、实验设计
土壤取样 → 样品的稀释 → 微生物的培养与观察
3．制定计划：对于耗时较长的生物实验，要事先 规划时间 ， 以便提高工作效率。
四、菌种鉴定 1．原理：分解尿素的细菌合成的 脲酶 将尿素分解成氨，使培
养基的碱性 增强 。 2．方法：在以 尿素 为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培
养细菌，若指示剂变 红 ，可确定该种细菌能够分解尿素。
[核心语句识记] 1．实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于目的菌株生长
养时间 。 (2)观察：每隔 24 h 统计一次 菌落数目，最后选取菌落数目
稳定 时的记录作为结果。 三、操作提示 1．无菌操作：取土样用的小铁铲和盛土样的信封都要进行灭
专题2-课题2-土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 个体小的细菌在显微镜下难以观看
2.间接计数法〔活菌计数法〕 〔1〕常用方法：稀释涂布平板法
〔2〕原理：当样品的稀释度足够高时，培育基表
面生长的一个菌落，来源于样品稀释 液中的一个活菌，通过统计平板上的 菌落数，就能推想出样品中大约含有 多少活菌。
提出的问题 —如何查找耐高温的酶？
解决问题的思路—查找耐高温环境
原理—高温淘汰其他菌种，选出耐 高温菌种，耐高温菌种提取耐高温
酶。 启发：查找目的菌种时要依据它对 生存环境的要求，到相应的环境中 去查找。
阅读P21-23，思考： 1、说出试验室中微生物的筛选原理 2、依据本课题所使用的培育基，答复：
脲酶的细菌才能利用尿素作为氮源而生存。
怎样证明此培育基具有选择性呢？
培育基 类型
以尿素为
试验组 唯一氮源
的培育基
是否 接种
是
比照组
牛肉膏 蛋白胨
是
培育基
目的 结果
分别分 只生长分 解尿素 解尿素的 的细菌 细菌
推断该 培育基 有无选 择性
生长多 种微生 物
㈡.统计菌落数目：
1、显微镜直接计数：
可以利用血球计数板，在显微镜下计算肯定容 积里样品中微生物的数量。
3、本课题所使用的培育基：
KH2PO4 NaH2PO4 MgSO4`7H2O 葡萄糖
尿素
琼脂
1.4g 2.1g 0.2g 10.0g 1.0g 15.0g
①从物理性质看此培育 基属于哪类？固体培育基 ②该培育基的配方中，为 微生物的生长供给碳源和 氮源的分别是什么物质？
碳源：葡萄糖 氮源：尿素
③此培育基能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？ 能。该培育基的唯一氮源为尿素，只有产生
课题2土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
课题2土壤中分解尿素的细菌的分离和计数1．图甲是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程，图乙是脲酶基因转录的mRNA部分序列。
（1）图中选择培养基应以________为唯一氮源；鉴别培养基还需添加________作指示剂，产脲酶细菌在该培养基上生长一段时间后，其菌落周围的指示剂将变成________色。
（2）在5个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为105的土壤样品溶液0.1 mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。
该过程采取的接种方法是________，每克土壤样品中的细菌数量为________×108个；与血细胞计数板计数法相比，此计数方法测得的细菌数较________。
（3）现有一菌株的脲酶由于基因突变而失活，突变后基因转录的mRNA在图乙箭头所示位置增加了70个核苷酸，使图乙序列中出现终止密码（终止密码有UAG、UGA和UAA）。
突变基因转录的mRNA中，终止密码为________，突变基因表达的蛋白含________个氨基酸。
2．耐高温淀粉酶在大规模工业生产中有很大的实用性。
研究者从热泉中筛选了能高效产生耐高温淀粉酶的嗜热菌，其筛选过程如下图所示：(1)从用途上来说，Ⅰ号培养基属于________培养基，仅以淀粉作为________源；从物理状态上来说，Ⅱ号培养基属于固体培养基，配制时一般加入________作为凝固剂。
(2)进行①过程的目的是________；②过程所使用的接种方法是________法。
(3)Ⅰ、Ⅱ号培养基配制和灭菌时，灭菌与调节pH的先后顺序是________________；一般对配制的培养基采用________________法灭菌。
(4)部分嗜热菌在Ⅰ号培养基上生长时可释放淀粉酶分解培养基中的淀粉，在菌落周围形成透明圈，应挑出透明圈________(填“大”或“小”)的菌落，接种到Ⅱ号培养基上。
(5)下图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图，请分析接种的具体方法。
课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
（二） 统计菌落数目 方①的为平法了板保 上证进结行果计准数确。，一般选择菌落数在30—300
②为使运结用果稀接释近涂真布实平值板，法需来培统养计计样算品中出的三活个菌或数三。个
原以理上的平板菌落平均数。
③统计的1个菌菌落落往→往1比个活活菌菌的实际数目低。
件下下叙恒述温 ，培 不养 正确3天的，是结果D 如图所示。从实验结果分析以
A链霉素能阻止结核菌的生长 B链霉素对结核菌比对霍乱菌更有效 C链霉素对结核菌比对伤寒菌更有效 D链霉素可以用于治疗伤寒病人
• 4、培养基、培养皿、接种环、实验操作者 的双手、空气、牛奶所采用的灭菌或消毒 方法依次是 ( A )
注意事项
阅读教材22页“（二）统计菌落数目”一段，并讨论教 材中提出的问题。
甲：没有重复实验（至少涂布3个平板） 乙：A组结果误差过大，不应用于计算平均值
计算公式：
某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得
平板上菌落数的平均数为234，那么每克样
品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液
的体积为0.1ml）
葡萄糖 10.0g
氮源：尿素
尿素 1.0g
此配方能否筛选出产生脲酶
琼脂 15.0g 的细菌？为什么？
将上述物质溶解后， 用蒸馏水定容到 1000mL。
能。只有产生脲酶的 细菌能利用尿素作为氮 源而生存。
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生 长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培 养基，称做选择培养基。
1.使用选择培养基的目的是（
A.培养细菌
）
C
B.培养真菌
C.使需要的微生物大量繁殖
课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
课题2：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数【课程标准】研究培养基对微生物的选择作用，进行微生物数量的测定【学习重点】对土样的选取和选择培养基的配制。
【学习难点】对分解尿素的细菌的计数。
【自主阅读】一、研究思路（一）筛选菌株1．实验室中微生物的筛选主要是指人为提供有利于目的菌株生长的，同时抑制或阻止其他微生物的生长。
2．分解尿素的细菌主要有，，。
3．选择培养基是指。
加入可以分离出，。
加入可以分离出。
（二）统计菌落数目4．统计菌落数目的方法主要有，，。
5．统计菌落数目的理论依据是当样品度足够高时，。
6．为保证统计结果准确，通常将涂布在平板上，培养后再选择的平板进行计数。
7．在设计实验时，一定要涂布至少个平板作为重复组，才能增强实验的说服力和准确性。
（三）设置对照8．设置对照的主要目的是，。
9．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的研究思路是，。
二、实验设计10．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的实验流程是，，，，，。
11．土壤中的微生物大约有的细菌，绝大多数分布在。
12．测定土壤中细菌的数量一般选用倍的稀释液进行平板培养，一般在温度下培养天，每隔，小时统计一次菌落数目，选取时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足导致遗漏菌落数目。
13．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数操作中需要注意的问题是，，。
14．准确鉴定分解尿素细菌的方法是在以尿素为唯一氮源的培养基中加入，出现的现象是。
【典例分析】试验目的：略实验材料和用具：略实验方法和步骤：（1）接种①接种前，准备好盛有上述配方的培养基，放入培养皿中并灭菌，供试验用②取10g土壤，放在无菌研钵中，注入5ml水，并用无菌玻璃棒搅拌均匀，备用③将接种环放在酒精灯的火焰上灭菌。
将培养皿盖轻轻放在桌面上，手拿培养皿，将接种环放在培养基边缘处冷却。
然后，用接种环沾取少许泥浆，轻轻的点接在培养基表面上，共点接15－20处④接种后，轻轻地盖上培养皿盖，将培养皿放在试验桌上。
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A. 2.34×108
B. 2.34×109
(B)
C. 234
D. 23.4
结果：统计的菌落往往比活菌的实际数目低。
思考2：
两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌 数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下结果： 甲同学：在该浓度下涂布了1个平板，统计菌落数为230。 乙同学：在该浓度下涂布了3个平板，统计菌落数分别为 21、212、256，然后取平均值163作为统计结果。
酚红在低pH值时呈现黄色， 在高pH值时呈现红色，但在 pH6.6至8.0间会呈现橙色。
酚酞在pH 8.2-10.0， 颜色由无色至红色。
酚红反应灵，只要pH有升高就可以检测的到， 酚酞不行。所以，在此实验中使用酚红。
4、活菌计数的应用：
①土壤含菌量的测定； ②食品卫生； ③水源污染度。
课题背景
尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接 被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之 后才能被植物利用。
CO(NH2)2 + H2O
脲酶
2NH3 + CO2
常见的分解尿素的微生物：
①细菌：芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆
菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌；
②某些真菌和放线菌也能分解尿素。
课题2 土壤中分解尿素的细菌 的分离与计数
土壤取样 制备培养基 样品的稀释 涂布到选择培养基 微生物的培养与观察
（1）土壤取样
①从富含有机质，PH接近中性且潮湿的土壤中取样。 先铲去表层土，在距地表约3-8cm的土壤层取样， 然后将样品装入事先准备好的信封中。 ②取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都 要灭菌。
“微生物的天然培养基”
注：分离不同的微生物采用不同的稀释度。
细菌：一般选用104、105、106倍的稀释液进行平板培养。 放线菌：一般选用103、104、105倍的稀释液进行平板培养。 真菌：一般选用102、103、104倍的稀释液进行平板培养。
原因： 不同微生物在土壤中含量不同。 目的： 保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板。
一、研究思路
（一）筛选菌株
1 、 实 例 ：DNA多聚酶链式反应（PCR）是一种在体
外将少量DNA大量复制的技术，此项技术 要求使用耐高温（93 ℃）的DNA聚合酶。
耐高温的酶 寻找
耐高温生物体 寻找
高温环境（热泉、火山口）
启示： 寻找目的菌种时要根据它对_生__存__环__境__的__要__求__，
（4）涂布到选择培养基
为避免混淆： ①用记号笔在各培养皿背面标注：培养基种类、培 养日期以及平板上培养样品的稀释度等。 ②把培养基按浓度分别捆成一摞。
（5）微生物的培养与观察 ①培养： 不同的微生物往往需要不同培养 温度和培养时间。
细菌：30～37℃培养1～2d； 放线菌：25～28℃培养5～7d； 霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。
数量最大、种类最多
大约70%—90%是细菌
（2）制备培养基
①制备选择培养基（尿素为唯一氮源）
浓度1 浓度2 浓度3
实验组
（尿素为唯 一氮源）
对照组
牛肉膏蛋白胨
②制备牛肉膏蛋白胨培养基 （对照作用）
（3）样品的稀释
①应在火焰旁称取土壤10g。然后在火焰附近将称好的土 样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。 ②在稀释土壤溶液的过程中每一步都要在火焰旁进行。 ③为避免试管混淆，事先将试管按101-106编号。
4、计算：
每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M C：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数； V：代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)； M：代表稀释倍数。
思考1：
某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数
的平均数为234，那么每克样品中的菌落数是（涂布平
板时所用稀释液的体积为0.1ml）
碳源：葡萄糖、尿素。
氮源：尿素。
2、此配方能否筛选出产生脲酶 的细菌？为什么？
KH2PO4 Na2HPO4 MgSO4 ．7H2O 葡萄糖
尿素
琼脂
1.4g 2.1g 0.2g 10.0g 1.0g 15.0g
选择培养基
选择培养基：
在微生物学中，将允许___特__定__种__类__的__微__生__物__生__长_， 同时_抑__制__或__阻__止__其__他__种__类__微__生__物__生长的培养基。
以上只是对分解尿素的细菌进行了初步筛选，所得菌 种不一定都能分解尿素，因此还需作进一步鉴定！
尿素分解菌的鉴定：
1、原理：
脲酶
导致
尿素
氨
PH升高
加酚红
变红
2、方法：
在以尿素为唯一氮源的培养 基中加入酚红指示剂，然后 分别接种筛选出的菌落，观 察指示剂是否变红。
3、结论：该细菌能够分解尿素。
酚红
酚酞
②观察：
微生物的培养与观察菌落的形状、 Nhomakorabea 小、隆起程度和
颜色等方面。
③计数：
方法1：稀释涂布平板法（间接计数）
方法2：显微镜直接计数
利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里 样品中微生物的数量。
方法3：滤膜法
测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积 的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到伊红美蓝培 养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过计算得 出水样中大肠杆菌的数量。
以上两位同学的结果谁更接近真实值？他们 的实验需要改进吗？如何改进？
（三）设置对照
目的： 排除实验组中非测试因素
对实验结果的影响，提高实 验结果的可信度。
①判断培养基是否有杂菌污染： 需将未接种的选择培养基同时进行培养。
②判断选择培养基是否有筛选作用： 需设置牛肉膏蛋白胨培养基进行接种培养。
二、实验设计
尿素培养基筛选出的尿素分解菌
（二）统计菌落数目
1、原理： 一个菌落代表原先的一个活菌。
2、方法： 稀释涂布平板法
3、注意事项： ①每一稀释度的菌液涂布三个或三个以上的平板。 ②当各平板上菌落数稳定时进行计数。 ③选择菌落数在30～300的平板（相同稀释度的平板 均符合该特点）进行计数，然后取平均值。
到相应的环境中去寻找。
原因： 因为热泉70～80 ℃的
高温条件淘汰了绝大多数 微生物，使耐热的Taq细菌 被保留下来。
2、实验室中微生物的筛选原理：
人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、 温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。
思考： 1、该培养基的配方中，为微生 物的生长提供碳源和氮源的分别 是什么物质？