叶绿素、叶绿素铜钠盐的稳定性分析研究

绪论食品的色泽是人们对食品的第一感性接触，色泽美观的食品不仅可以提高食品的感观性质，给人以美的享受，激发人们的购买欲望，而且还能增进食欲。

因此，色泽是衡量食品质量的重要指标之一[1]。

为了保持或改善食品的色泽，在食品加工中往往需要对食品进行人工着色。

食用色素就是一种使食品着色和改善食品色泽的食品添加剂。

食品色素按其来源分为天然的及化合的两类。

化学合成色素一般色泽鲜艳，着色力强，坚牢度大，性质稳定，曾一度广泛应用。

但随着食品色素安全性试验技术的发展，发现有的合成色素有致癌作用和诱发染色体变异，因而许可使用的合成色素品种有所减少，产量降低。

近年来，国外在合成色素方面正在致力开发大分子聚合物合成色素。

天然色素色泽较差，但安全性高，有的还有一定的营养价值或药理作用，且来源丰富，因而日益受到人们的重视，增长趋势很快。

在天然色素的开发和应用方面，日本居世界前列。

在当前食用色素的使用方面，天然色素已占主导地位。

开发天然色素是世界食用色素发展的总趋势。

叶绿素及其衍生物作为天然食用色素的生产在我国已有30余年的历史，主要产品是糊状叶绿素和叶绿素铜钠盐。

生产叶绿素的原料很多，最早使用的是蚕沙，近年来有人试验用竹叶、芦苇、芭蕉叶、甜菜叶、菠菜叶等各种叶子作为生产叶绿素的原料．取得了令人满意的效果[2]。

就游离的叶绿素来说很不稳定，对光、热敏感，易氧化裂解而褪色，故用作食品添加剂有其局限性。

而将叶绿素用碱水解，除去甲基和叶绿醇基，并将中心离子镁用铜或锌取代生成叶绿素铜（锌）钠盐，其稳定性增加，可作为一种良好的食用色素[3]。

本研究以茶叶为原料提取叶绿素．并用铜代和锌代分别制得叶绿素铜钠盐和叶绿素锌钠盐。

通过研究其溶解性的强弱、PH值的影响、稳定性的差异、安全性的异同及着色能力的强弱，分析比较这三种茶绿色素作为食用色素的优劣性，探求影响其稳定性的条件及为三种色素的应用优劣性提供科学依据。

1. 叶绿素、叶绿素铜（锌）钠盐的形成机理及其性质研究1.1 叶绿素叶绿素(chlorophyll)属卟啉类化合物，和胡萝卜素、叶黄素等同时存在于绿色植物的叶子或微生物体内，在植物和微生物的光合反应中起重要作用。

对叶绿素的系统研究始于1818年，1913年Willstatter 确定了叶绿素a和b的分子式，本世纪30年代，Fischer[4.5]确定了叶绿素a和b的结构(图1-1):图1-1 叶绿素a和b的结构叶绿素a:R=CH3; 叶绿素b:R=CHO叶绿素a和b的分子中的镁离子易被铜、铁、锌等离子取代而成为叶绿素衍生物(chlorophyllin)[6]。

叶绿素作为绿色色素早已被开发利用，但叶绿素稳定性极差，遇光、热、酸和碱等作用瞬间变色，且不溶于水，故其应用不是很广泛。

1.2 叶绿素铜钠盐叶绿素铜钠盐(Sodium Copper Chlorophyllin) (图1-2)，是一类重要的药物，可治疗传染性肝炎、胃和十二指肠溃疡、慢性肾炎、胰腺炎、白血病等疾病[7，8]．已有研究报导利用浮萍、菠菜、苜蓿等为原料制备叶绿素及其衍生物[9,12]，但这些原料中叶绿素含量较低，制备成本高．国内蚕砂资源丰富，叶绿素含量高，作为制备叶绿素及其衍生物的原料，已投入工业化生产[13]．图1-2 叶绿素铜钠盐结构叶绿素铜钠，别名绿菲材．是墨绿色粉末，略带金属光泽，无臭或微有特殊的氨样气味，有吸湿性，对光和热较稳定。

易溶于水，稍溶于乙醇和氯仿，微溶于乙醚和石油醚。

水溶液呈蓝绿色澄清透明液，钙离子存在时则有沉淀析出[14,15]，是我国规定的九种天然色素之一，是我国食品工业中唯一允许使用的绿色色素。

广泛用作化妆品、食品和医药上的着色剂 [16]。

目前，美国每年从1.45多万吨苜蓿中抽提出36t多的叶绿素铜钠盐，很大一部分是用于医药，包括除臭剂、各种口服保健用品。

据报道，美国Lake Worth生产的叶绿素有90%用于制备叶绿素铜钠盐。

1.3 叶绿素锌钠盐叶绿素锌钠是一种墨绿色细小晶状物质，带金属光泽，它是叶绿素锌钠a(R＝CH3)与叶绿素锌钠b(R＝CHO)的混合物，叶绿素锌钠水溶性好，水溶液在中、碱性条件下呈现亮绿色，在较强酸性条件下（PH＜4＝溶液呈现绿色，但略带浑浊。

溶液微溶于乙醇、甲醇、氯仿，不溶于石油醚、丙酮、正己烷。

叶绿素锌钠盐的耐光、耐热的稳定性要强于叶绿素，但叶绿素锌钠盐的耐光性较差，进一步加强其耐光性还有待于研究。

叶绿素锌钠盐具有很好的抗氧化性和抗还原性。

蔗糖、葡萄糖、食盐、Vc、柠檬酸几种常见食品添加剂对叶绿素锌钠盐的影响不大。

2. 三种茶绿色素的研究方法及其应用前景叶绿素铜钠盐和叶绿素锌钠盐的研究方法很多，不过其基本原理是一样的。

制备叶绿素铜（锌）钠，首先必须提取叶绿素。

叶绿素主要存在于绿色植物中，现已有报道以竹叶、地椒草、三叶草、苜蓿叶、芝麻叶、羊蹄甲树叶，蚕砂等为原料，用溶剂萃取，经皂化与铜（锌）代来制备叶绿素铜（锌）钠盐。

对叶绿素铜（锌）钠盐的研究首先从其制备着手，以叶绿素作为参考，研究其稳定性。

在不同的PH值、不同的温度、不同的光照时间和不同的金属离子等条件下研究其稳定性。

通过与叶绿素的对照实验，可直观地研究叶绿素铜钠盐和叶绿素锌钠盐的稳定性。

现以茶叶为原料，提取叶绿素并制成脂溶性茶绿素粉末。

再由叶绿素粉末经皂化和铜（锌）代制取叶绿素铜钠盐和叶绿素锌钠盐。

制备脂溶性茶绿色素粉末的实验步骤如下：将新鲜的茶老叶去除大叶脉并剪碎，混合玻璃碎渣碾碎，然后用90%的酒精按1：10的固液比混合，在常温下浸提10小时，过滤，滤液置于500ml的圆底烧瓶中进行减压浓缩，然后经冷冻干燥，得脂溶性茶绿色素粉末。

叶绿素铜钠盐与叶绿素锌钠盐的制备工艺如下：叶绿素粉末→0.1%溶于90%乙醇溶液→以4：1体积比加入5%NaOH乙醇溶液→60℃-70℃水浴皂化1h→减压蒸馏回收乙醇至1/3处→分液漏斗中→等体积石油醚震荡萃取未皂化液→静置分层→取下层水相（墨绿色）→6N盐酸调酸（PH为2.0～3.0）→再加入10%CuSO4溶液（4：1体积比混合）→水浴60℃-70℃加热1h铜代→过滤→水洗→铜代产物→90%乙醇溶解→5%的NaOH溶液成盐→过滤→干燥→成品。

*注：叶绿素锌钠盐的制备与叶绿素铜钠盐的制备一致，只是在锌代时加20%的ZnSO4叶绿素铜钠盐是叶绿素的衍生物，它“来自植物”，是一种“绿色产品”，它在食品、化妆品及医学等方面的应用日益广阔。

我国绿色植物资源丰富，又是产桑大国，我们可以根据不同原料，不同的技术要求采用不同的方法生产。

因原料价格低廉，提取制造工艺简单，设备投资少。

故它必会有很好的开发应用前景。

如今叶绿素铜钠盐得到广泛应用，但人体需要的铜量很少，且一般食物中普遍含铜，如果摄取过量的铜，会造成铜中毒。

而叶绿素锌钠盐具有补锌和色素的双重作用可以被广泛应用于医药、食品、日用化工等行业，具有很大的开发潜力。

天然绿色素叶绿素锌钠盐作为新型食用色素越来越受到人们的青睐。

3.实验方法与研究内容3.1 叶绿素、叶绿素铜（锌）钠盐的光谱特性取一定量的叶绿素粉末及叶绿素铜（锌）钠盐制品配成0.4%的水溶液（叶绿素用90%的乙醇作为溶剂），在可见光下370～700nm波长下每隔10nm测一次吸光值。

在光谱波峰波谷（拐点）处加测数次测吸光值，制作并分析比较这三种茶绿色素的特征吸收光谱图。

3.2稳定性研究3.2.1 三种色素的热稳定性研究分别取配好的0.4%的这三种茶绿色素水溶液10ml于4支25ml的具塞试管中，分别在不同的温度下（20℃，40℃，60℃，80℃）水浴加热1h，冷至室温后，与加热前的比较，观察它们的颜色变化，并于370～700nm波长下测吸光值，分析比较这三种茶绿色素在不同温度下的特征吸收光谱图。

3.2.2 PH值对色素稳定性的影响将这三种色素配成0.4%的色素溶液，分别取10ml于11支25ml的具塞试管中，分别用2N的HCl 和2N的NaOH溶液调酸碱度，使PH值分别为1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，11.0，13.0，充分振荡均匀后静置，并观察其颜色，每个PH值于370～700nm测吸光值，并制作特征吸收光谱图。

3.2.3 光照对色素稳定性的影响将不同PH值的系列溶液，分别在室内自然光照下放置12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h，观察其颜色变化，并于370～700nm测吸光值，制作并分析其特征吸收光谱曲线。

3.2.4 金属离子对色素稳定性的影响分别取0.4%的叶绿素、叶绿素铜钠盐和叶绿素锌钠盐溶液5ml，分别加入5ml0.05%的Al2(SO4)3，NaCl，KCl，CaCl2，FeSO4，MgSO4，CuSO4，FeCl3和ZnSO4溶液，充分混合后，观察其颜色变化，并于370～700nm测吸光值，制作并分析比较这三种茶绿色素在不同金属离子条件下的特征吸收光谱图。

3.2.5常见食品添加剂对色素稳定性的影响3.2.5.1维生素C 对色素稳定性的影响取5ml0.4%的叶绿素、叶绿素铜钠盐及叶绿素锌钠盐溶液，分别加入不同浓度的维生素C（浓度分别为0%，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%）溶液定溶至10ml，并在100℃的水浴锅中加热30min，取出冷却至室温后观察其颜色变化，并在370～700nm测吸光值，制作并分析比较这三种茶绿色素在不同维生素C浓度条件下的特征吸收光谱曲线。

3.2.5.2 苯甲酸钠对色素稳定性的影响取5ml0.4%的叶绿素、叶绿素铜钠盐及叶绿素锌钠盐溶液，分别加入不同浓度的苯甲酸钠（浓度分别为0%，0.1%，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%）溶液定溶至10ml，室温下观察其颜色变化，并在370～700nm测吸光值，制作并分析比较这三种茶绿色素在不同苯甲酸钠浓度条件下的特征吸收光谱曲线。

3.2.5.3 食盐对色素稳定性的影响取5ml0.4%的叶绿素、叶绿素铜钠盐及叶绿素锌钠盐溶液，分别加入不同浓度的食盐（浓度分别为0%，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%）溶液定溶至10ml，室温下观察其颜色变化，并在370～700nm测吸光值，制作并分析比较这三种茶绿色素在不同食盐浓度条件下的特征吸收光谱曲线。

3.2.5.4 葡萄糖对色素稳定性的影响取5ml0.4%的叶绿素、叶绿素铜钠盐及叶绿素锌钠盐溶液，分别加入不同浓度的葡萄糖（浓度分别为0%，2.0%，4.0%，6.0%，8.0%，10.0%）溶液定溶至10ml，室温下观察其颜色变化，并在370～700nm测吸光值，制作并分析比较这三种茶绿色素在不同葡萄糖浓度条件下的特征吸收光谱曲线。

3.2.6常用氧化剂、还原剂对色素稳定性的影响3.2.6.1 双氧水（H2O2）对色素稳定性的影响取5ml0.4%的叶绿素、叶绿素铜钠盐及叶绿素锌钠盐溶液，分别等体积比加入不同浓度的H2O2（浓度分别为0%，0.2%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%）溶液，室温下静置1小时后观察其颜色变化，并在370～700nm测吸光值，制作并分析比较这三种茶绿色素在不同H2O2浓度条件下的特征吸收光谱曲线。