全长PTH(1-34)-HSA融合蛋白在毕赤酵母中的表达及其活性
人血清白蛋白-C肽融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达
人血清白蛋白-C肽融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达
人血清白蛋白-C肽融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达
目的构建重组表达人血清白蛋白(HSA)-C肽(CP)融合蛋白的毕赤酵母表达菌株.方法根据表达系统的.密码子偏好性优化CP基因,酶切连接pBlue-HSA质粒(HSA1 800bp)和CP(100bp)基因,将HSA-CP融合基因双酶切后插入分泌表达栽体pPIC9K中,重组质粒pPIC9K-HSA-CP经SalⅠ线性化后,电击转化毕赤酵母GS115,表型筛选Mut+转化子.PCR鉴定后,用甲醇诱导摇瓶分泌表达.结果融合基因约为1 900bp,序列测定正确.SDS-PAGE分析表明表达融合蛋白的相对分子量约为70kD,摇瓶培养表达量为140mg/L,Western blot鉴定显示表达的融合蛋白为HSA和CP的杂合分子.结论实现了HSA-CP融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达,细胞活性研究显示HSA-CP融合蛋白对人胚肾293细胞的生长具有一定的促进作用.
作者：周利苹张莲芬雷楗勇张文婷蔡燕飞金坚 Zhou Liping Zhang Lianfen Lei Jianyong Zhang Wenting Cai Yanfei Jin Jian 作者单位：江南大学医药学院分子药理研究室,江南大学工业生物技术教育部重点实验室,无锡,214122 刊名：生物技术通报 PKU 英文刊名：BIOTECHNOLOGY BULLETIN 年，卷(期)：2008 ""(3) 分类号：Q94 关键词： C肽人血清白蛋白融合蛋白毕赤酵母。
hBMP-4在毕赤酵母中的表达、纯化、活性鉴定及二聚体化研究的开题报告
hBMP-4在毕赤酵母中的表达、纯化、活性鉴定及二
聚体化研究的开题报告
毕赤酵母是一种单细胞真核生物，具有优异的表达异源蛋白的能力和强大的生物合成功能，在生命科学研究中具有广泛的应用前景。
而骨形态发生蛋白-4（BMP-4）作为一种重要的成骨细胞分化因子，与多种细胞生长、分化及组织修复等重要生物学过程密切相关，因此在生物医学领域具有重要的应用价值。
本课题将以毕赤酵母作为表达工具，通过基因克隆、重组表达、纯化等一系列技术手段，系统研究HBMP-4在毕赤酵母中的表达、纯化及活性鉴定，并进一步深入探究其在骨组织再生及修复中的作用机制。
具体实验流程包括以下几个方面：
1.基因克隆：通过PCR扩增获得HBMP-4基因，并构建表达载体。
2.重组表达：将载体转化至毕赤酵母中，利用酵母本身的合成机制表达重组蛋白。
通过Western blot等技术手段检测重组蛋白表达情况。
3.纯化：利用后续的柱层析工艺，对重组蛋白进行逐步的纯化，得到较为纯净的HBMP-4蛋白。
4.活性鉴定：利用生物学实验手段（如细胞培养、分子生物学法等），对HBMP-4蛋白的生物活性进行鉴定，确定其在细胞分化、骨组织再生等方面的作用。
5.二聚体化研究：通过分子生物学和蛋白质化学技术，研究HBMP-4蛋白的分子结构、功能性和动态的二聚体化/stim-ligation状态。
该课题的研究结果将有助于深入了解HBMP-4在生物学中的作用机制，为骨组织再生及修复的临床应用提供更加广阔的前景。
PTH融合蛋白研究进展
输系统。另有研究表明，门Ｈ（１—３４）的Ｎ一末端区域
比Ｃ．末端区域相对保守：Ｎ．末端许多位点还未发 现功能性的替换，如Ｖａｌ２、ｌｉｅ５、Ｍｅｔ８、Ｈｉｓ９等，有些 位点可以被替换掉，但是生物活性会大大下降．如 Ｓｅｒｌ、Ｓｅｒ３等。内部区域残基（１３—１６）和Ｃ．末端螺旋 （１７～３０）相对不保守。半数以上可以进行适当的侧 链化学修饰，如若将２７位正电荷去除有助于稳定 螺旋结构【Ⅻ。
Ｆｃ段融合蛋白、６ｘＨｉｓ Ｔａｇ融合蛋白、６一半乳糖苷酶 融合蛋白、ｔｒｐＥ融合蛋白、谷胱甘肽Ｓ一转移酶 （ＧＳＴ）融合蛋白以及硫氧还蛋白（Ｔｒｘ）融合蛋白等。 而人血清白蛋白（ＨＳＡ）则由于本身特殊的优点。更 适合于充当长效融合蛋白类药物的融合载体１１６１。 ＨＳＡ是包含５８５个氨基酸残基的单链无糖基化的 球形蛋白质。分子量６５ ｋＤ。它是人血浆中含量最 高的单一蛋白质（达４０ ｇ／Ｌ），在体内有维持血液渗 透压，运输营养和其它重要生物物质的作用。ＨＳＡ 本身是许多内源因子和外源药物的载体．药物和血 清白蛋白结合后．可以减少其生物利用度，增加在 体内的半衰期至１９ ｄ之久。 人血清白蛋白融合技术具有明显的优点，包括 ＨＳＡ与目标蛋白在胞内经蛋白翻泽系统通过肽键 连接．不需额外的体外处理；ＨＳＡ表达水平较高，与
３．２．１
月ＦＤＡ向开发者ＮＰＳ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ发出该药物可 以被批准的意见书；２００６年４月２４日，欧盟已批 准该药物上市，用于治疗妇女绝经后骨质疏松症。 这种重组体与天然甲状旁腺素的氨基酸组成和生 物活性均一致，具有硅著的骨同化作用，不仅增加 骨量，且可增加骨机械应力，有效预防骨折发生。它 与人体内发挥生理作用的ＰＴＨ氨基酸序列完全一 致，因此副作用小于ｒｈＰＴＨ（１．３４），拓展应用范围 的空间较大，在国外所进行的临床前研究中发现
IL1Ra-HSA基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达的开题报告
IL1Ra-HSA基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达的
开题报告
一、研究背景及意义
癌症、自炎症和感染等都会引发炎症反应，而炎症反应的过度也会导致一系列的疾病。
因此，控制炎症反应就成为相关疾病治疗的关键。
白细胞介素1受体拮抗剂（IL-1Ra）作为人体的天然抗炎因子，具有多种抗炎和抗癌作用，而且没有明显的副作用，被广泛应用于临床治疗。
因此，对其进行研究有利于新型治疗药物的开发。
在本研究中，旨在将IL-1Ra与人血清白蛋白（HSA）融合，并在毕赤酵母中高效表达，以便更好地应用于各种疾病的治疗。
二、研究内容及方法
1.基因克隆：采用PCR方法以人源IL-1Ra和HSA为模板，通过引物设计扩增出IL1Ra-HSA融合基因，并进行双酶切后，将其连接到表达载体pPICZαA中。
2.毕赤酵母转化：将连接成功的重组质粒转化到毕赤酵母中，通过蓝白斑筛选和PCR鉴定，筛选出高效表达的毕赤酵母菌株。
3.表达条件优化：通过对毕赤酵母菌株的不同发酵条件的比较，寻找最适合的表达条件，从而提高表达效率。
4.纯化和鉴定：采用亲和层析等方法对表达的IL1Ra-HSA进行纯化和鉴定，测定其生物活性和纯度。
三、预期成果及意义
1.成功将IL-1Ra与HSA融合，并通过PCR克隆到毕赤酵母中。
2.筛选出高效表达的毕赤酵母菌株，并通过表达条件优化提高其表达效率。
3.成功对表达的IL1Ra-HSA进行纯化和鉴定，并测定其生物活性和纯度。
4.为进一步研究IL-1Ra在临床应用中的新型治疗策略提供了基础研究支持。
重组人Hepassocin在毕赤酵母中的分泌型表达、纯化与活性鉴定
2.1 材 料 ............................................................................................................................................. 11
摘 要......................................................................................................................................................3
2.1.1 菌株和质粒 .............................................................................................................................. 11 2.1.2 引物 .......................................................................................................................................... 11 2.1.3 工具酶及相关试剂 .................................................................................................................. 11 2.1.4 主要仪器设备 .......................................................................................................................... 11 2.1.5 层析柱及填料 ..........................................................................................................................12 2.1.6 常用试剂的配制 ......................................................................................................................13
甲状旁腺激素-人血清白蛋白融合蛋白在CHO细胞中的表达
第 2 卷 第 5 期2016 年 10 月生物化工Biological Chemical EngineeringVol.2 No.5Oct. 2016甲状旁腺激素-人血清白蛋白融合蛋白在CHO细胞中的表达张焕，徐栋生，蔡燕飞，陈蕴，金坚（江南大学药学院，江苏无锡214122）摘 要：人甲状旁腺激素是由人甲状腺旁腺主细胞分泌合成的一种单链多肽激素，成熟的甲状旁腺激素含84个氨基酸残基，其活性区域为N-末端1-34氨基酸片段，目前已上市的PTH药物也以34个氨基酸残基的多肽为主，主要用于治疗老年骨质疏松以及绝经后妇女骨质疏松。
但是PTH的稳定性较差，导致体内半衰期短，难以形成有治疗作用的稳态血药浓度，从而限制了其临床应用。
因此，设计稳定并能保持原有生物活性的PTH药物分子至关重要。
构建含有融合蛋白基因PTH-HSA的pMH3质粒，并通过电转染的方法转入中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary cell，CHO细胞）中，利用pMH3质粒所携带的NEO基因进行筛选，最终得到能稳定表达目的蛋白的重组细胞，并在5L发酵罐中进行表达，融合蛋白PTH-HSA表达量达到155mg/L。
Western blot检测显示，该融合蛋白同时具有HSA和PTH双重免疫原性。
关键词：甲状旁腺激素-人血清白蛋白；融合蛋白；中国仓鼠卵巢细胞中图分类号：Q786 文献标识码：AExpression of Parathyroid Hormone - Human Serum Albumin Fusion Protein in CHO CellsZhang Huan, Xu Dong-sheng, Cai Yan-fei, Chen Yun, Jin JianAbstract: Human parathyroid hormone is synthesized as a single polypeptide hormone secreted by the thyroid parathyroid chief cells, the mature PTH containing 84 amino acid residues, the active region for N-terminal 1-34 amino acid fragment, the PTH drugs already on the market also to 34 amino acid residues of the polypeptide based, mainly for treatment of the old osteoporosis and postmenopausal women with osteoporosis. But the stability of PTH is poor, which leads to a short half-life in vivo, and it is difficult to form a stable blood drug concentration with therapeutic action, thus limiting its clinical application. Therefore, it is very important to design a PTH drug molecule which is stable and can maintain the original biological activity. PMH3 plasmid containing fusion protein gene PTH-HSA was constructed in this paper. And by electroporation method into Chinese hamster ovary (CHO cell, Chinese hamster ovary cell) cell in, use pMH3 plasmids carrying the neo gene was screened and eventually get stable expression of aim protein of recombinant cells, and its expression in 5L fermentor, the fusion protein PTH-HSA expression reached 155mg/L. Western Blot assay showed that the fusion protein had both HSA and PTH double immunogenicity.Key words: Parathyroid hormone - human serum albumin; Fusion protein; Chinese hamster ovary cell人甲状旁腺激素（Human parathyroid hormone，hPTH）是由人甲状腺旁腺主细胞分泌合成的一种单链多肽激素，成熟的PTH含84个氨基酸残基，其活性区域为N-末端1-34氨基酸片段，目前已上市的基金项目：国家重大新药创制项目（2013zx09102033）；国家高技术863计划（2014aa021003，2015aa020802）；国家自然科学基金（81273437）。
重组人甲状旁腺素1-34在毕赤酵母克隆及表达的研究
定 了基 础 。
１ 材料 与方 法 Leabharlann １１ 主要 材料 和 仪器 ．
基因和引物 由上海生工生物工程技术服务有 限公司合成 ；克隆载体ｐ Ｄ ８Ｔ 自日本Ｔ Ｋ Ｒ 公司 ； Ｍ １一 购 ＡＡＡ 表达载体ｐ ＩＺ 为本实验室改造过的载体 ；大肠杆菌Ｘ １Ｂｕ 为本实验室保存菌种 ；毕赤酵母ｘ ３ 购 白 ＰＣ Ｌ一 ｌ ｅ 一３
相关研 究表 明毕赤酵母 表达 系统能够稳 定 的表 达整合 入 酵母 基 因组 的外 源基 因蛋 白，使表 达 的外 源 蛋 白
进行糖基化等蛋 白修饰 ，有利于保持其生物稳定 ｌ和免疫学活性 。毕赤酵母采用胞外分泌的方式 ， 生 有利于对 分泌的外源蛋白进行纯化 ， 避免了破碎细胞等操作步骤。毕赤酵母发酵方法易于大规模制备 目的蛋 白［ ６ １ 。本
人 甲状旁腺激素 （ ｍ ｎ ａ ｔ ｒ ｄ ｏ ｏｅｈ Ｔ ）是 由人 甲状旁腺主细胞分泌的碱性单链多肽类激 ｈ ａ ｒ ｈ ｏ ｒ ｎ， Ｐ Ｈ ｕ ｐ ａ ｙ ｉｈ ｍ 素。含有８ 个氨基酸 ，分子质量为９ ０ ａ ４ ５ ０ 。编码Ｐ Ｈ １ ８ 的基因片段在３９ ６ ｂ处 ；氨基端Ｐ Ｈ １ ３ Ｄ Ｔ ～ ４ ０ ５ ３ｐ Ｔ ～ ４ 片段在３ ９ ４ ０ｐ ０ ～ １ｂ 处。ｈＴ Ｐ Ｈ的氨基端为活性端 ，与靶组织受体结合产生生物效应 ，而羧基端不具有生物活 性… ｒ ｅｒ ２ 明 Ｈ 。Ｔｅ ａ等［ 发挥生理 活性作用仅需 氨基酸 １ ３ 位。Ｐ Ｈ １３ 作为 甲状旁腺素Ｐ Ｈ ｇ １ 证 ～４ Ｔ —４ Ｔ 的活性片 段 ，具有全部 Ｈ 的生理活性和受体结合能力。应用Ｐ Ｈ １ ３进行人体血钙和血磷 的调节 ，可以治疗骨质 ｒ —４ ｒ 疏松 症等疾 病 ，具 有广 阔 的临床应 用前 景［］ ３。 － ５
phyA基因在毕赤酵母中的表达以及表达产物的检测
ｐｈｙＡ基因在毕赤酵母中的表达以及表达产物的检测摘要对获得的植酸酶基因PhyA进行TA克隆，获质粒pTA-phyA，酶切后，使其在连接体系中连接到酵母表达载体pPIC9K-InS片段上，随后将重组质粒转化给大肠杆菌，验证其成功后，再将重组质粒转化给毕赤酵母，诱导其表达，通过测定植酸酶活性，得出其表达量。
关键词phyA基因；克隆；毕赤酵母；表达；检测植酸酶是一类能将植酸(六磷酸肌醇)降解为肌醇和无机磷酸的磷酸酶。
在饲料中添加植酸酶，不但能促进动物对饲料中磷的利用，使植物性饲料中磷的利用率提高60％，粪便中磷的排出量减少40％，同时还能降低植酸的抗营养作用，对提高畜牧生产效益和降低环境中的磷污染有重要意义。
因此，植酸酶引起了研究领域和饲料行业的普遍关注。
基因表达真核系统，利用较多的是巴氏毕赤酵母表达系统。
我们将植酸酶基因与pPIC9K连接构建成为酵母表达载体pPIC9K-phyA，导入酵母细胞，获得了表达，测定植酸酶酶活的结果显示表达处于较高水平。
1 材料与方法1．1 材料1．1．1 菌株与质粒。
含有植酸酶基因的pT-phyA质粒，EcoliDH5α，毕赤酵母GS115，pPIC9K。
1．1．2 试剂。
EcoRI、NotI内切酶，胶回收试剂盒(V-Gene)，T4-DNALigase。
1．1．3 主要培养基。
LB培养基(蛋白胨／酵母粉培养基)、YEPD培养基(YeastExtractPeptoneDextroseMedium)，酵母浸出粉／胰蛋白胨／右旋葡萄糖培养基。
选择培养基：在上述相应培养基中加入抗生素，用于转化子的筛选或重组菌株的培养。
各抗生素使用浓度分别为氨苄青霉素100μg／mL、红毒素25μg／mL、新霉素5μg／mL。
1．2 方法1．2．1 植酸酶phyA基因的pPIC9K表达载体的构建。
挑取含有植酸酶基因的pT-phyA质粒的大肠杆菌种DH5α，接种于2mL的LB培养基中，37℃摇床培养过夜，碱裂解法抽提质粒。
新型集成干扰素-人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达和纯化
１ 材料与方法
１ ． １ 材 料
＋ 酵母菌种 ｐ ａ ｓ ｔ ｏ ｒ ｉ ｓ Ｇ Ｓ １ １ ５ （ ｈ ｉ ｓ ４Ｍ ｕ ｔ ） 和表达质粒
是第一个用于临床的基因重组细胞因子， 已经被美国 Ｆ Ｄ Ａ批准应用于病毒性肝炎、 恶性肿瘤等多种疾病的 治疗。但是干扰素分子量大约 １ ９ ｋ Ｄ ａ ， 易被肾小球滤 过， 血浆半衰期短而治疗周期长， 需要频繁注射给药， 患者依从性较低。 利用基因工程手段研制长效蛋白药物越来越受到 人们的关注， 方法之一是人血清白蛋白（ Ｈ Ｓ Ａ ） 融合技 术。Ｈ Ｓ Ａ是人体血液中天然的物质输送载体， 血清中 含量最高， 其相对分子量约为 ６ ５ ｋ Ｄ ａ ， 是由 ５ ８ ５个氨基 酸组成的单链球型蛋白质， 无酶学及免疫学活性， 体内 半衰期长达 １ ９天， 是理想的改善药物半衰期的生 物
２ ］ 载体 ［ 。
ｐ Ｐ Ｉ Ｃ ３ ． ５购自 Ｉ ｎ ｖ ｉ ｔ ｒ ｏ ｇ ｅ ｎ公司； Ｎ Ｆ Ｉ Ｎ Ｈ Ｓ Ａ基因由上海生 工 合 成；Ｂ ａ ｍ Ｈ Ｉ 、Ｅ ｃ ｏ Ｒ Ｉ 、Ｐ ｙ ｒ ｏ ｂ ｅ ｓ ｔＤ Ｎ Ａ Ｐ ｏ ｌ ｙ ｍ ｅ ｒ ａ ｓ ｅ 、 Ｔ ４ Ｄ Ｎ Ａ连接酶， 均购自 Ｔ ａ Ｋ ａ Ｒ ａ 公司。 Ｄ Ｅ Ａ ＥＳ ｅ ｐ ｈ ａ ｒ ｏ ｓ ｅ Ｆ Ｆ 、 Ｃ ＭＳ ｅ ｐ ｈ ａ ｒ ｏ ｓ ｅＦ Ｆ购 自 Ａ ｍ ｅ ｒ ｓ ｈ ａ ｍＰ ｈ ａ ｒ ｍ ａ ｃ ｉ ａ公 司。 Ｓ Ａ单 克 隆 抗 体 购 自 Ｓ ｉ ｇ ｍ ａ 。人 羊 膜 细 胞 小鼠抗 人 Ｈ （ ＷＩ Ｓ Ｈ ） 、 水泡性口炎病毒（ Ｖ Ｓ Ｖ ） 均为北京三元基因工 程有限公司保存。 １ ． ２ 方 法 １ ． ２ ． １ 表达载体的构建 将全基因合成的 ｐ Ｂ ｌ ｕ ｅ ｓ ｃ ｒ ｉ ｐ ｔ Ｉ Ｉ Ｋ Ｓ （＋ ） Ｈ Ｓ Ａ Ｎ Ｉ Ｆ Ｎ质粒以 Ｂ ａ ｍ Ｈ Ｉ 、 Ｅ ｃ ｏ Ｒ Ｉ 双酶切， 酶 切产物回收后与毕赤酵母表达载体 ｐ Ｐ Ｉ Ｃ ３ ． ５连接， 构 建出 ｐ Ｐ Ｉ Ｃ ３ ． ５ Ｈ Ｓ Ａ Ｎ Ｉ Ｆ Ｎ重组质粒。 １ ． ２ ． ２ 毕赤酵母 Ｇ Ｓ １ １ ５的电击转化及筛选 将 ２～ ４ ｇＳ ａ ｌ Ｉ 线性化处理的重组质粒 ｐ Ｐ Ｉ Ｃ ３ ． ５ Ｈ Ｓ Ａ Ｎ Ｉ Ｆ Ｎ电 μ 击转化感受态毕赤酵母 Ｇ Ｓ １ １ ５ 。电击结束后立即加入 １ ｍ ｌ １ ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ山梨醇， 混匀后取 ２ ０ ０ ｌ 涂布于 Ｍ Ｄ 平板 μ
人血清白蛋白与PTH(1—34)融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达及鉴定
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人血清 白蛋 白与 Ｐ Ｈ（—４ 融合蛋 白在 Ｔ １３ ） 毕 赤酵母 中的分泌 表达及鉴定
陈 静 ， 红 颖 ， 孙 杨 颖 ， 学 芬 ， 王 陈枢 青
（ 江大 学 药学院 生化 药学研 究 室， 浙 浙江 杭 州 ３ ０ ５ ） １ ０ ８
化 酶产 生ｃ ＡＭＰ， 活 性低 于 Ｐ 但 ＴＨ（— ４ 。 结论 ： 毕 赤酵母 中成 功表 达 了具 有 生物 学活性 的人 血 １３ ） 在
清 白蛋 白 与 Ｐ ＴＨ（— ４ 融 合 蛋 白 。 １３ ）
［ 键词 ］ 毕 赤酵母 ；甲状 旁腺 激 素肽 （ —４ ；血 清 白蛋 白 ； 粒 ；重组 ， 传 ；人 甲状 旁腺 激 素 关 １３ ） 质 遗
（—４ ；融合 蛋 白 ； 泌表 达 １３ ） 分
［ 中图分 类号］ Ｑ ６ ７８
［ 文献标 识码 ］ Ａ
［ 文章 编号 ］ １０—２ ２２ ０ ）２０２ —８ ０ ８９ ９ （０８ ０—１６０
Ｃｏ ｔ ｕ ｔｏ ｎｓ ｒ ｃ ｉ ｎ，ｅ ｐｒ ｓ ｉ ｎ ｎｄ ｈ ｒ ｃ ｅ ｉ ａ ｉ ｎ ｆ ｅ ｏ ｂ ｎａ ｆ ｓ ｏ ｘ ｅ ｓ ｏ ａ ｃ ａ ａ ｔ ｒ ｚ ｔｏ ｏ ｒ ｃ ｍ ｉ ｎｔ ｕ ｉ ｎ
过敏原肌质钙结合蛋白在毕赤酵母中的表达、优化及免疫反应性研究
过敏原肌质钙结合蛋白在毕赤酵母中的表达、优化及免疫反应性研究赵明玉;李妍;朱文烨;陈媛;王晓楠;林洪;李振兴【期刊名称】《食品安全质量检测学报》【年(卷),期】2024(15)5【摘要】目的利用毕赤酵母(Pichia pastoris, P. pastoris)高效表达三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)重要过敏原肌质钙结合蛋白(sarcoplasmic calcium binding protein, SCP),并检验其免疫反应性。
方法根据毕赤酵母的密码子偏好性优化SCP基因并构建重组质粒。
将其热激转化至P. pastorisGS115菌株后经遗传霉素(geneticin,G418)筛选获得阳性高拷贝子。
最后通过甲醇诱导表达重组SCP 并结合免疫印记(western blotting,WB)和间接酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)验证其免疫反应性。
结果在摇瓶水平下,重组SCP 在毕赤酵母中最佳的表达条件为:诱导温度为28℃,甲醇添加量为每24h添加1.0%甲醇,诱导pH为6.0,诱导时间为144 h。
在此条件下, SCP(纯度为91.6%)的得率为1.5 mg/100 mL菌液,实现了可溶性高效表达。
WB和间接ELISA结果表明,重组SCP具有免疫球蛋白G结合能力。
结论毕赤酵母表达系统可以得到纯度较高且免疫反应性良好的重组SCP。
本研究可为SCP的理化研究及过敏原标准物质的应用奠定基础,并有望促进特异性甲壳类过敏原检测的发展。
【总页数】11页(P51-61)【作者】赵明玉;李妍;朱文烨;陈媛;王晓楠;林洪;李振兴【作者单位】中国海洋大学食品科学与工程学院【正文语种】中文【中图分类】TS2【相关文献】1.白假丝酵母脂肪酶CaLIP5在毕赤酵母X33中的优化重组表达2.鸡α－干扰素在毕赤酵母中的表达及其表达条件优化3.旋毛虫抗原基因Ts87在毕赤酵母系统中优化表达的研究4.人源性抗角蛋白抗体Fab段在巴氏毕赤酵母菌中的表达及表达条件的优化5.重组毕赤酵母表达棘孢木霉几丁质酶Tachi1的酶学性质研究及表达条件优化因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
核心蛋白聚糖在毕赤酵母中的表达及活性检测
核心蛋白聚糖在毕赤酵母中的表达及活性检测郝小夏;王桂琴;王艳红;李凌霞;郭松佳;兰晶【期刊名称】《中国生物制品学杂志》【年(卷),期】2008(21)3【摘要】目的利用巴氏毕赤酵母真核表达系统表达人核心蛋白聚糖DCN,并检测其抗肿瘤活性。
方法利用DCN的特异引物,通过RT-PCR扩增人DCN基因,与载体pPIC9K连接,将序列正确的重组体扩增后,酶切线性化,通过醋酸锂法转化酵母菌HIS-/GS115,G418筛选阳性克隆,用含1%甲醇的BMMY培养基诱导表达,并观察纯化的表达产物对人肝母细胞瘤细胞(HepG2)增殖的影响。
结果表达产物作用于HepG2细胞后,与对照组相比,细胞增殖数量及速度均显著降低。
随着表达产物浓度的升高及作用时间的延长,抑制作用也增强,并表现出浓度和时间依赖性关系。
细胞形态学观察表明DCN对HepG2生长有明显抑制作用。
结论已成功构建了pPIC9K-DCN真核表达载体,并表达了有活性的蛋白产物。
【总页数】4页(P190-193)【关键词】核心蛋白聚糖;巴氏毕赤酵母;表达;活性【作者】郝小夏;王桂琴;王艳红;李凌霞;郭松佳;兰晶【作者单位】山西医科大学微生物学与免疫学教研室【正文语种】中文【中图分类】Q786【相关文献】1.黄粉虫纤溶活性基因的克隆及在毕赤酵母中的表达及活性检测 [J], 韩雅莉;林非凡;林泽飞;段雪娟;朱晓琳2.乙型肝炎病毒核心基因在毕赤酵母中的表达及表达产物在乙型肝炎病毒核心抗体检测中的应用评价 [J], 梁敏坚;洪国强;李朝霞;胡波;许珏;李林3.泥鳅抗菌肽在毕赤酵母SMD1168中的高效表达及活性检测 [J], 马萍;李婷;薛林贵;尚海;何小燕;谢长庚;王霞;范桃桃;陈熙明;姜金融4.家蝇抗菌肽Domesticin在毕赤酵母中的表达及抑菌活性检测 [J], 刘进兰;杨雪;李双双;张玉明;柳峰松;唐婷;李红权5.人微小纤溶酶原cDNA在毕赤酵母中的高效表达及活性检测 [J], 王娜; 何成霞; 邹强; 苟兴华; 陈松; 吴昊俣; 蔡心析; 许天恒因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
毕赤酵母中表达的鲑鱼降钙素与骨生长肽融合蛋白的活性检测
毕赤酵母中表达的鲑鱼降钙素与骨生长肽融合蛋白的活性检测钟辉;彭英芳;李平;袁志刚;杨晓丽;马清钧【期刊名称】《中国生物工程杂志》【年(卷),期】2002(22)4【摘要】通过体外和体内活性实验 ,检测在毕赤酵母中的表达、纯化后的鲑鱼降钙素与骨生长肽融合蛋白是否具有抑制破骨细胞和促进成骨细胞活性的作用 ,期望通过这两个方面同时进行骨质疏松症的治疗。
利用MTT法检测此融合蛋白在体外对成骨细胞和成纤维细胞增殖的刺激作用 ,利用碱性磷酸酶检测试剂盒与血清钙检测试剂盒检测此融合蛋白在体内对成骨细胞和破骨细胞活性的影响。
细胞实验 (体外 )和动物实验 (体内 )其结果都证明表达的融合蛋白既可以抑制破骨细胞的活性。
【总页数】5页(P84-88)【关键词】毕赤酵母;表达;鲑鱼降钙素;融合蛋白;活性检测;骨质疏松症;骨生长肽【作者】钟辉;彭英芳;李平;袁志刚;杨晓丽;马清钧【作者单位】军事医学科学院生物工程研究所;武警总医院检验科【正文语种】中文【中图分类】R977;TQ460.38【相关文献】1.猪乳铁蛋白肽LFcinP基因在巴斯德毕赤酵母中组成型表达及其抑菌活性检测[J], 唐丽杰;邢婧珉;李杰;李一经2.TPO模拟肽与人IgG1Fc融合蛋白在毕赤酵母中的表达及活性鉴定 [J], 叶祥忠;郭强;李朝;刘凤云;程度胜3.抗菌肽牛乳铁蛋白肽衍生肽在毕赤酵母中的表达及活性鉴定 [J], 李忠清;王亮4.鲑鱼降钙素与骨生长肽融合基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达 [J], 钟辉;彭英芳;李平;袁志刚;杨晓莉;马清钧5.抗菌肽和人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白在毕赤酵母中的表达及其活性鉴定[J], 苏志坚;吴晓萍;郑青;黄亚东;庞实锋;冯雅;李校堃因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
毕赤酵母GS115表达HSA-GCSFm的诱导工艺研究
毕赤酵母GS115表达HSA-GCSFm的诱导工艺研究李清亮;周月涵;丁健;段作营;金坚;李华钟【期刊名称】《工业微生物》【年(卷),期】2016(046)002【摘要】本文探讨了甲醇流加控制、添加胰蛋白胨和甲醇/山梨醇共混诱导对重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-HSA-GCSFm表达HSA-GCSFm的影响.结果显示:甲醇供应充足条件下HSA-GCSFm表达水平仅为37 mg·L-1,而甲醇添加受限条件下HSA-GCSFm表达水平可达到239mg·L-1;甲醇添加受限并添加胰蛋白胨条件下,HSA-GCSFm表达水平可以提高到266 mg·L-1;在此基础上,流加山梨醇作为辅助碳源,表达水平可大幅提高至424 mg·L-1.通过对各诱导条件下OUR、胞外蛋白酶及碳流分配进行分析后发现,将甲醇限制在低浓度同时添加胰蛋白胨与山梨醇,可以改善细胞代谢活性,增加细胞用于HSA-GCSFm合成的碳流分配量,降低胞外蛋白酶活性,从而提高了HSA-GCSFm的表达水平并缓解了HSA-GCSFm的降解.因此,该诱导工艺适于毕赤酵母高效表达HSA-GCSFm.【总页数】6页(P8-13)【作者】李清亮;周月涵;丁健;段作营;金坚;李华钟【作者单位】江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122;江南大学药学院,江苏无锡 214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122【正文语种】中文【相关文献】1.“低甲醇浓度-高溶解氧浓度”策略诱导毕赤酵母高效表达HSA-GCSFm及其转录组学机理分析 [J], 涂庭勇;贾禄强;孙佼文;陈珊珊;史仲平2.犬干扰素α1和胸腺肽α1融合蛋白在毕赤酵母GS115中的表达 [J], 田春玲;马玉忠;秦建华;汪恩强3.阿魏酸酯酶 O42807在毕赤酵母 GS115中的表达 [J], 陈云华;李慧;张光亚;葛慧华;李夏兰4.毕赤酵母GS115中N-乙酰转移酶在大肠杆菌中的克隆表达与性质研究 [J], 朱海峰;吴丹;吴敬5.毕赤酵母GS115/phyA产植酸酶诱导条件研究 [J], 康立新;马立新;张桂敏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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ｌｂ ａ ｕ ｍ ｎ ， Ｈ Ｓ Ａ） 的融 合 蛋 白 Ｐ Ｔ Ｈ（ １ － ３ ４ ） ． ＨＳ Ａ， 并 检 测 其 活 性 。方 法 在质粒 ｐ Ｐ Ｉ Ｃ ９ Ｋ — Ｐ Ｔ Ｈ（ １ － ３ ４ ） ． Ｈ Ｓ Ａ的基 础上 设 计 引 物， 引入 ６ Ｈｉ ｓ 标签 及 肠 激 酶 酶 切 位 点 ， 从 该质粒中扩增 ６ Ｈ ｉ ｓ ． Ｅ Ｋ 一 Ｈ（ １ － ３ ４ ） 一 ＨＳ Ａ基 因 ， 插入 ｐ Ｐ Ｉ Ｃ ９ Ｋ 载体 中 ， 构 建 重
Ｌ Ｉ Ｊ ｕ ｎ — ｙ ｉ ， Ｐ ＥＮＧ Ｌ ｉ ｎ ， Ｔ ＡＮＧ Ｃ ｕ ｎ — ｄ ｕ ｏ ， ＷＵ Ｍｉ ｎ — ｃ ｈ ｅ ｎ ， Ｊ Ｉ Ｎ Ｊ ｉ ａ ｎ
Ｓ ｃ ｈ ｏ ｏ ｌ ｏ ｆＰ ｈ ａ ｒ ｍ ａ ｃ ｅ ｕ ｔ ｉ ｃ ｓ ， ￣ ａ ｎ ｇ ｎ ａ ｎ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， Ｗｕ ｘ ｉ ２ １ ４ １ ２ ２ ， Ｊ ｉ ａ ｎ ｇ ｓ ｕ Ｐ ｒ ｏ ｖ ｉ ｎ ｃ ｅ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ
ｏ ｎ ｐ ｌ ａ ｓ ｍ ｉ ｄ ｐ Ｐ Ｉ Ｃ ９ Ｋ 一 Ｈ（ １ － ３ ４ ） ２ 一 Ｈ Ｓ Ａ ， ｉ ｎ ｗ ｈ ｉ ｃ ｈ ａ ｔ ａ ｇ ｏ ｆ ６ Ｈｉ ｓ ａ ｎ ｄ ａ ｒ ｅ ｓ ｔ ｉ ｒ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ｉ ｔ ｅ ｏ ｆ ｅ ｎ ｔ ｅ ｒ ｏ ｋ ｉ ｎ ａ ｓ ｅ ｗ ｅ ｒ ｅ ｉ ｎ ｔ ｒ ｏ ｄ ｕ ｃ ｅ ｄ ．６ Ｈｉ ｓ —
ｂ ｕ ｍｉ ｎ（ ＨＳ Ａ）ｉ ｎ Ｐ ｉ ｃ ｈ ｉ ａ ｐ ａ ｓ ｔ ｏ ｒ ｉ ｓ ａ ｎ ｄ ｄ ｅ ｔ ｅ ｍｉ ｒ ｎ ｅ ｔ ｈ ｅ ａ ｃ ｔ ｉ ｖ ｉ ｔ ｙ ｏ ｆ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｅ ｄ ｐ ｒ ｏ ｄ ｕ ｃ ｔ ．Ｍ ｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｓ Ｐ ｉ ｒ ｍｅ ｒ ｓ ｗ ｅ ｒ ｅ ｄ ｅ ｓ ｉ ｇ ｎ ｅ ｄ ｂ ａ ｓ ｅ ｄ
李俊毅 ， 彭林 ， 唐 存 多， 邬敏 辰 ， 金 坚
江南大学药学院 ， 江苏 无锡 ２ １ ４ １ ２ ２ 摘要： 目的 在毕赤酵母中表达全长甲状旁腺激素 （ Ｐ ａ ｒ ａ ｔ ｈ ｙ ｒ ｏ ｉ ｄ ｈ ｏ ｒ ｍｏ ｎ ｅ ， Ｐ ， ｒ Ｈ） （ １ － ３ ４ ） 与人血清 白蛋 白（ Ｈｕ ｍａ ｎ ｓ ｅ ｒ ｕ ｍ
组表达质粒 ｐ Ｐ Ｉ Ｃ ９ Ｋ 一 ６ Ｈ ｉ ｓ — Ｅ Ｋ ． Ｈ （ １ － ３ ４ ） 一 ＨＳ Ａ， 转化毕赤酵母 Ｇ Ｓ １ １ ５ ， 甲醇诱导表达 ； 表达的 ６ Ｈ ｉ ｓ 一 Ｈ （ １ — ３ ４ ） 一 Ｈ Ｓ Ａ融 合蛋 白通过两步亲和层析纯化和肠激酶酶切 ， 获得全长的 Ｐ Ｔ Ｈ（ １ － ３ ４ ） 一 ＨＳ Ａ融合蛋 白； 检测融合 蛋 白对 Ｕ Ａ ＭＳ ． ３ ２ Ｐ成 骨细胞增殖活力 、 碱性磷酸酶活性 以及 Ｒ Ａ Ｎ Ｋ Ｌ和 Ｏ Ｐ Ｇ基 因转录水平 的影响。结果 重组表达质粒 经测序证实构建
Ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｉ ｎ ｔ ａ ｃ ｔ Ｐ Ｔ Ｈ （ １ － ３ ４） － ＨＳ Ａ ｆ ｕ ｓ ｉ ｏ ｎ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ｉ ｎ
Ｐｉ ｃ ｈｉ ａ ｐａ ｓ ｔ ｏ ｒ ｉ ｓ ａ ｎｄ ａ ｃ ｔ ｉ ｖ ｉ ｔ ｙ ｏ ｆ ｅ ｘ ｐｒ ｅ ｓ ｓ ｅ ｄ ｐｒ ｏ ｄｕｃ ｔ
正确 ； 表达的 ６ Ｈｉ ｓ ． Ｈ（ １ ． ３ ４ ） ． Ｈ Ｓ Ａ融合蛋 白相对分子质量约 ７ ０ ０ ０ ０ ， 可与 Ｐ Ｔ Ｈ抗体和 ＨＳ Ａ抗体 特异性结合 ， 发酵 获得 的融合蛋 白的浓度为 ２ ０ ０ ｍ ｇ ／Ｌ ； 纯化 的融合 蛋 白可与抗 Ｐ Ｔ Ｈ、 Ｈ Ｓ Ａ和 ６ Ｈｉ ｓ 标签抗体特异性 结合 ， 经肠 激酶酶
中国生物制品学杂志 ２ ０ １ ３ 年４ 月第 ２ ６ 卷第 ４ 期 Ｃ ｈ ｉ ｎ Ｊ Ｂ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｉ ｃ ａ ｌ ｓ Ａ ｐ ｒ ｉ ｌ ２ ０ １ ３ ， Ｖ ｏ １ ． ２ ６ Ｎ ｏ ． ４
・ ５ １ ５ ・
治 疗 性： 制齐 Ｕ
全长 Ｐ Ｔ Ｈ（ １ － ３ ４ ） 一 Ｈ Ｓ Ａ融合蛋 白 在毕赤酵母 中的表达及 其活性
切后 ， 该蛋 白失去 了与 ６ Ｈｉ ｓ 抗体反 应的能力 ， 保持 了与 Ｈ和 Ｈ Ｓ Ａ抗体 结合一 Ｈ Ｓ Ａ融合蛋 白保持 了 Ｐ Ｔ Ｈ的生物活性 ， 能促进 Ｕ Ａ ＭＳ ． ３ ２ Ｐ成骨细胞 的增殖活力 ， 提高细胞的碱性磷酸酶的活性 ， 上 调细胞 Ｒ Ａ Ｎ Ｋ Ｌ 基 因的转 录水平 以及抑制 Ｏ Ｐ Ｇ基因的转 录水平 。结论 Ｈ Ｓ Ａ融合蛋 白， 有望提高 Ｐ Ｔ Ｈ的成药性。 关键 词 ：甲状旁腺激素 ； 人血清 白蛋 白； 融合蛋 白； 组氨酸标签 ； 肠激酶 ； 生物活性 中图分类号 ： Ｑ ７ ８ ６ Ｒ ３ ９ ２ — ３ ３ 文献标识码 ：Ａ 文章编号 ：１ ０ ０ ４ － ５ ５ ０ ３ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ４ ． ０ ５ １ ５ ． ０ ６ 成功在毕赤酵母 中表达 了全长 Ｐ Ｔ Ｈ（ １ － ３ ４ ） ．