HPLC法测定心脑联通分散片中野黄芩苷的含量

HPLC法测定心脑联通分散片中野黄芩苷的含量
严亚锋1，马文龙2
（1.陕西中医学院2009级研究生，陕西，咸阳712046；2.杨凌示范区医院，陕西，杨凌712100）
摘要：目的建立用HPLC法测定心脑联通分散片中野黄芩苷的含量。

方法采用
色谱柱（5μm，4.6×250mm ）；柱温: 40℃；流动相为甲醇-0.1% HPLC法，Kromasil C
18
磷酸溶液（40:60）；检测波长335nm。

以野黄芩苷为对照品，外标法定量。

结果野黄芩苷在21.60～108.00ug/ml范围内线性关系良好（r=0.9999），平均加样回收率为98.25%，RSD=1.04%。

结论本法操作简便、准确，重现性好，可用于该制剂的质量控制。

关键词：心脑联通分散片；野黄芩苷；HPLC；含量测定
心脑联通分散片是由SFDA《国家中成药标准汇编》心系分册“心脑联通胶囊”[WS-10031(ZD-0031)-2002]改变剂型而来，处方由灯盏细辛、虎杖、野山楂等七味中药组成，具有活血化瘀，通络止痛的功效。

用于瘀血闭阻引起的胸痹，眩晕，症见胸闷，胸痛，心悸，头晕，头痛耳鸣等，以及冠心病心绞痛，脑动脉硬化及高脂血症见上述证候者[1]。

本试验采用HPLC法对方中灯盏细辛所含野黄芩苷进行含量测定[2-4]，该法分离度良好、定量准确、重现性好，可作为心脑联通分散片的质量控制指标之一。

1仪器与试药
1.1 仪器：LC-10ATvp液相色谱仪（日本岛津）；SPD-10Avp紫外检测器（日本岛津）；CS-Light中文色谱软件。

1.2 试药：野黄芩苷对照品（中国药品生物制品检定所提供，批号为110842-200605）；甲醇为色谱纯；水为重蒸馏水；心脑联通分散片自制(批号：100201、100202、100203)；其他试剂均为分析纯。

2方法与结果
2.1 色谱条件色谱柱：Kromasil C18柱（5μm，4.6×250mm）；流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液（40:60）；检测波长：335nm；流速:1.0ml/min；柱温: 40℃；理论板数按野黄芩苷峰计算应不低于4500。

2.2 供试品溶液的制备取本品10片，研细，取0.5g，精密称定，加三氯甲烷适量，置索氏提取器中提取2小时，弃去三氯甲烷液，药渣挥尽三氯甲烷，连同滤纸筒移入具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称重，水浴加热回流1小时，放冷，再称重，
用甲醇补足缺失的重量，蒸干甲醇，残渣加水30ml ，用乙酸乙酯洗涤3次，每次20ml ，弃去乙酸乙酯层，水层用稀盐酸调P H 至1，再用乙酸乙酯提取5次，每次15ml ，合并乙酸乙酯层，蒸干，加甲醇定容至10ml 容量瓶中，用微孔滤膜（0.45μm ）滤过，取续滤液，即得。

2.3 对照品溶液的配制 取经五氧化二磷干燥12小时的野黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇使溶解，制成每1ml 含60μg 的溶液，摇匀，即得。

2.4 标准曲线和线性范围考察 精密称取经五氧化二磷减压干燥24小时的野黄芩苷
2.16 mg ，置于10ml 容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为储备液待用。

精密吸取上述储备液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml ，分别置于5ml 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，在上述色谱条件下测得峰面积。

以峰面积为纵坐标，野黄芩苷浓度为横坐标绘制标准曲线，得线性方程为：Y=0.3899X +0.1945，r=0.9999。

结果表明：野黄芩苷在21.60～108.00μg/ml 浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 干扰试验 照处方比例制备不含灯盏细辛的空白样品，按供试品溶液制备方法制备成阴性对照溶液。

精密吸取阴性对照溶液、对照品溶液及供试品溶液各10μl ，按上述色谱条件测定，结果阴性对照在野黄芩苷峰部位无干扰。

见图1。

A B C
图1 心脑联通分散片HPLC 图
A ．对照品
B ．样品
C ．阴性
2.6 精密度考察 精密吸取同一份供试品（批号：100201）溶液10μl ，重复进样6次，测定峰面积积分值，野黄芩苷含量的RSD=0.58%（n=6）。

结果表明，本法精密度良好。

2.7 稳定性考察 取同一批号的供试品（批号：100201）溶液，分别于0、2、4、8、12h 精密吸取10μl ，按上述色谱条件测定峰面积积分值，野黄芩苷含量的RSD=0.92%（n=5），表明在12h 内具有良好稳定性。

0 5 10 15
0 5 10 15 0 5 10 15
2.8 重复性考察 取同一批号供试品（批号：100201）6份，按2.2项下方法制备供试品溶液，测定野黄芩苷峰面积积分值，并计算得平均含量为 1.1770mg/g ，其含量的RSD=1.44%（n=6）。

2.9 加样回收率考察 精密称取已知含量样品（1.1770mg/g ）6份，分别精密加入野黄芩苷对照品溶液（0.106mg/ml ）2、2、3、3、4和4ml ，按2.2项下方法制得供试品溶液，并按上述色谱条件测定，计算回收率，结果平均回收率为98.25%，RSD=1.04%（n=6）。

见表1。

表1 加样回收率试验结果（n=6）
取样量（g ） 野黄芩苷量(mg) 加入野黄芩苷量(mg)
测得野黄芩苷量 (mg) 回收率(%) 均值(%) RSD(%)
0.2520
0.2966 0.212 0.5045 98.07 98.25 1.04 0.2513
0.2958 0.212 0.5027 97.59 0.2496
0.2938 0.318 0.6108 99.69 0.2557
0.3009 0.318 0.6136 98.33 0.2543
0.2993 0.424 07191 99.01 0.2536 0.2985 0.424 0.7089 96.79
2.10 样品含量测定 取3批样品，依2.2项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl ，并按上述色谱条件测定，结果见表2。

表2 样品含量测定结果
批号
含量（mg/片） 100201 0.7083 100202
0.6866 100203 0.7250
根据三批样品测定结果，暂定本品每片含灯盏细辛以野黄芩苷（C 21H 18O 12）计，不得
少于0.60mg 。

3 讨论：
3.1本文曾对供试品溶液制备方法分别直接采用超声提取法和回流提取法，结果杂质均较多，分离难度较大。

后改用本法经多步除杂后，样品分离较好。

3.2 对供试品溶液制备方法中的加甲醇加热回流时间、提取液的pH 值、乙酸乙酯提取次数进行了正交试验考察，结果以加甲醇加热回流1小时、提取液的pH 值调至1、乙酸乙酯提取5次为最佳。

3.3野黄芩苷的含量测定试验中曾以乙腈：水：冰醋酸多种比例为流动相进行试验，结果分离效果均不理想，后改用甲醇-0.1%磷酸溶液多种比例试验，发现甲醇和0.1%磷酸溶液的比例为40∶60时，野黄芩苷分离效果良好，出峰时间较短。

参考文献：
[1] WS-10031(ZD-0031)-2002,国家中成药标准汇编[S].
[2] 孙平川,邓亚利,郭慧琴等. HPLC法测定心脑联通片中野黄芩苷的含量[J].西北药学杂志, 2008, 23(5)：290～291.
[3] 栾爽,王冬梅,赵怀清等.HPLC同时测定心脑联通胶囊中葛根素、虎杖苷和野黄芩苷的含量[J]. 中国药学杂志,2008,43(19): 1510～1512.
[4] 程雪梅,罗俊芳,李颜等. HPLC法测定灯盏生脉片中野黄芩苷的含量[J].上海中医药杂志, 2008, 42(7)：86～88.。