安琪卤醇脱卤酶

2.2.1环氧化物的叠氮化
最早生物法催化环氧化物叠氮化反应是由红球菌Rhodococcussp的酶粗提液参与完成的[22]，其终产物叠氮化醇具有很低的e.e.值，并且人们对粗提液中真正起催化作用的酶了解甚少。此外，可以接受N3-作为亲核试剂的生物酶种类也很少。卤醇脱卤酶可以接受N3−作为亲核试剂，而且反应表现出极高的立体选择性[13]。如HheC在催化对-硝基氧化苯乙烯进行叠氮化反应，其终产物（R）-1-对-硝基苯基-2-叠氮化乙醇的e.e.值为96%，同时没有反应的（S）型环氧化物的e.e.值高于99%。除了对-硝基氧化苯乙烯外，HheC对对-氯环氧苯乙烯也显示出极高的立体选择性（E>200）。对氧化苯乙烯的选择性却一般，主要是由于后者化学性环氧化物叠氮化反应很快。通常，化学性环氧化物叠氮化反应是α位的区域选择，而酶催化的反应显示出了很高的β区域选择性。因此，化学性环氧化物叠氮化反应的存在，在某种程度上降低了该反应的立体选择性。
2.2.2环氧化物的亚硝酸化
HheC催化的以NO2−作为亲核试剂的环氧化物开环反应较上述的叠氮化反应复杂，主要是由于NO2−的兼性离子特性，即氧原子和氮原子都可以对环氧化物环上的C原子进行亲核攻击。虽然NO2−介导的环氧化物开环反应同叠氮化反应一样具有较高的区域选择性（β位进攻为主)，仍然可以产生两种取决于亲核试剂的N/O选择性攻击而得到的异构体产物。其中产物之一亚硝酸酯在水溶液中尤其在低pH值情况下极不稳定，很容易水解成相应的二醇，它由亚硝酸根上氧原子攻击环氧化物环上β碳原子所得；当氮原子攻击环氧化物环上β碳原子时，产物为硝基醇（图2）。研究结果显示，野生态HheC在催化环氧化物亚硝酸化反应中，以氧原子攻击环氧化物环上β碳为主，因此终产物大部分是二醇[24]。同叠氮化反应一样，卤醇脱卤酶在催化环氧化物的亚硝酸化反应中仍然显示出对（R）型环氧化物的立体偏好性。其对映体选择性的高低主要取决于环氧化物的结构，当环氧化物为芳香族或具有α,α-双取代的环氧化物时，卤醇脱卤酶显示出极高的对映体选择性；当底物为一般的端位脂肪族环氧化物时，卤醇脱卤酶通常具有较低的对映体选择性。此外，当以对硝基氧化苯乙烯（p-nitro styreneoxide, PNSO）为反应底物时，通过动力学拆分不但可以得到对-硝基苯基-1,2乙二醇（e.e.=91%），而且得到具有99% e.e.值的（S）-环氧化物，其产量为48%。因此，从某种意义上讲，卤醇脱卤酶可以替代环氧化物水解酶进行环氧化物的制备。
上述研究结果为该酶的改造奠定了良好的理论基础。我们可以应用定点突变技术对酶的底物结合口袋进行改造，来调控HheC的对映体选择性[17]。通过将该区域的139位酪氨酸突变为较小残基，突变体HheC完全失去了野生态酶对（R）型对映体的高选择性。稳态动力学研究表明，这主要是由于突变体对（S）型底物的亲和力大大提高，而对（R）型底物的亲和力有所降低的缘故。另外，通过对酶催化反应的限速步进行改造可以大大提高酶的催化活性。突变体HheC如Y187F和W249F在催化对-硝基-2-溴-1-苯基乙醇（p-nitro-2-bromo-1-phenyl-ethanol）和1,3-二氯丙醇的转化过程中其活性得以提高。主要是因为增加了卤离子的释放速度，该步骤为这些底物转化的限速步骤[18]。这些研究表明定点突变在调控卤醇脱卤酶的活性与对映体选择性方面是一种值得推广的好方法。
卤醇脱卤酶，也叫卤醇-卤化氢裂解酶，通过分子内亲核取代机制催化邻卤醇转化为环氧化物和卤化氢，是微生物降解此类化合物的关键酶之一。大部分已知的卤醇脱卤酶都已经被克隆并在大肠杆菌中进行重组表达。相关的研究表明，卤醇脱卤酶与依赖NAD(P)H的短链脱氢酶/还原酶家族(SDR)具有一定的序列相似性，同时蛋白质三级结构的研究进一步揭示卤醇脱卤酶与SDR家族成员有一定的进化相关性[9]。SDR是一类依赖于NAD(H)或NADP(H)并在功能上具有多样性的一组酶类，主要催化醇、糖类、类固醇和一些异生质的氧化还原反应[10,11]。由于辅酶结合位点在卤醇脱卤酶中被卤离子结合位点取代，因而卤醇脱卤酶是一类不需要辅酶参与的脱卤酶。着关键作用。其催化机制为(图1)：保守的丝氨酸通过与底物羟基氧原子之间形成氢键,稳定了底物的结合；精氨酸可能用以降低酪氨酸的pKa值；酪氨酸从底物的羟基中夺取一个质子，然后以底物上的氧原子作为亲核试剂，进攻邻位卤素取代的碳原子，进而释放卤离子，形成环氧化物[9,12]。
图1卤醇脱卤酶的催化机制
Fig.1Catalytic mechanism of haloalcoholdehalogenases
The hydroxyl function of a haloalcohol substrate is bound by a serine and a tyrosine. The tyrosine functions as the catalytic base, which activates the hydroxyl group adjacent to the halogen atom for nucleophilic attack on the halogen-bearing carbon atom. The abstracted proton is released to the solvent via the arginine, the water molecules, and Asp80 at the surface of both enzymes.
卤醇脱卤酶备受关注的另一个原因是其在生物催化领域的应用，可以用来合成具有光学纯的高价值中间体。这些化合物在手性药物、手性农药以及各类手性合成的合成领域中具有传统化学合成法所无法比拟的优越性。其中光学纯的环氧化物以及用来合成该类化合物的前体邻卤醇在有机合成中具有特别重要的应用价值。因为环氧化物环具有非常活泼的化学特性，易与亲核试剂发生反应生成一类重要的手性合成单元-不对称醇类。因此，多种合成光学纯环氧化物的生物学方法已被广泛研究，其中包括人们熟知的脂肪酶、环氧化物水解酶等。卤醇脱卤酶催化邻卤醇生成环氧化物将成为一种高效的合成光学纯的环氧化物的主要方法之一。本文将重点介绍卤醇脱卤酶在催化合成环氧化物、短链β-取代醇以及叔醇类化合物方面的研究进展。
卤醇脱卤酶在选择性催化邻卤醇转化为环氧化物反应中，由于反应热动力学平衡的存在，使得反应难以完全进行。闭环反应是否完全进行，主要取决于底物中卤素取代的类型。对于氯取代的邻卤醇，平衡更倾向于形成卤醇，并遵循以下顺序Cl−>Br−>I−。为了避免由此而造成较低的对映体过剩值（e.e.），Lutje Spelberg研究组通过加入过量的环氧化物水解酶来提高产物的光学纯度[19]，并获得光学纯S型2,3-二氯-1-丙醇和2-氯-1,3-苯基乙醇（e.e.值均大于99%），且E值分别为>100和73。
2.2亲核试剂介导的环氧化物开环反应
卤醇脱卤酶的多功能性主要体现在亲核试剂所介导的环氧化物开环反应中。Lutje等人以对硝基苯乙烯氧化物为底物的反应中测验了卤醇脱卤酶与一系列的离子和非离子亲核试剂参与反应的能力，发现酶可以接受Br−，Cl−，N3−，NO2−和CN−等阴离子作为亲核试剂，并且具有较高的区域与对映体选择性[14]。新近研究表明，除了上述亲核试剂，卤醇脱卤酶还可以接受其余4种阴离子亲核试剂，I−，SCN−，OCN−和HCOO−[20,21]。在环氧化物开环反应中，卤醇脱卤酶可以高选择性地催化9种不同的亲核试剂所介导的反应。因此，可以通过动力学拆分手段制备多种具有光学纯的β-取代醇和环氧化物，充分显示出卤醇脱卤酶的广阔应用前景。
2卤醇脱卤酶的应用研究
卤醇脱卤酶的催化特性显示这是一类具有广阔应用前景的多功能生物催化剂。主要体现在催化邻卤醇与环氧化物之间的转化反应不依赖于辅助因子；卤醇脱卤酶不但可以催化碳-卤键的断裂进行脱卤反应，而且可以高选择性地催化接受除了卤离子以外的一系列非自然亲核试剂，如N3−，NO2−，CN−等所介导的环氧化物开环反应，用以生成一系列光学纯的β-取代醇[13,14]。尤其在催化CN−介导的环氧化物开环反应中，不但可以合成一类具有光学纯的高价值中间体β-羟基腈，而且生成了新的C-C键。因此，除了已知的转醛酶、转酮酶和羟基腈裂解酶外，卤醇脱卤酶也可以作为化学合成中的一种工具酶用于C-C键的合成中。
来源于放射形土壤杆菌（A. radiobacter）菌株AD1的卤醇脱卤酶HheC可以高选择性地催化不同的芳香族邻卤醇的转化，生成相应的R型环氧化物和S型邻卤醇。动力学分析显示HheC的高对映体选择性主要取决于酶对不同对映体的绑定和化学反应步骤。卤醇脱卤酶的这一催化特性也在相关的X射线的晶体学研究中得到了解释[16]。三级结构数据显示，对映体(R/S-PNSO)在活性位点的空间结合位置存在着明显的区别。主要体现在环氧化物环上的氧原子及β碳原子的位置不同。其中S对映体以非产物形式结合于其上,即环氧化物上的氧原子取向错误，以至于无法与催化氨基酸残基酪氨酸Tyr145形成氢键，亲核试剂无法对β碳原子进行亲核攻击。因此,只有R构型的对映体才能转化为相应的β取代的醇。自由能的计算显示二者之间只有很小的差异，这同R构型结合有两个氢键而S构型的结合只有一个氢键相一致。
多功能生物催化剂–卤醇脱卤酶
1卤醇脱卤酶研究概述
有机卤化合物已成为当今重要环境污染物之一，主要是由于工业排废以及人工合成卤化物在化工合成以及农业上的广泛应用造成的。在自然界中，大部分异生质卤化物自降解能力很差，同时许多化合物被疑是致癌或高诱变物质。因此，应用微生物降解有机卤化物已引起人们广泛的关注。从1968年Castro首次发现以2,3-二溴丙醇作为唯一碳源而生存的黄杆菌（Flavobateriumsp.）菌株至今[1]，人们相继筛选到多种可以降解邻卤醇的微生物[2-8]。其中包括从淡水沉淀物中分离的放射形土壤杆菌（Agrobacterium radiobacter）菌株AD1和节杆菌（Arthrobactersp.）菌株AD2以及从土壤中获得的棒状杆菌（Corynebacteriumsp.）菌株N-1074等。它们降解有机卤化物的途径虽然存在明显差异，但是卤醇脱卤酶作为关键酶之一，催化碳卤键的断裂存在于所有的代谢途径中。