单克隆抗体制备技术-09PPT课件
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单克隆抗体PPT课件
单克隆抗体具有高灵敏度，能够检测出微量的抗原，并且在很低的浓度下仍能保 持较高的亲和力。
详细描述
单克隆抗体的灵敏度极高，可以检测出纳克级别甚至皮克级别的抗原，这使得它 在生物检测、医学诊断和治疗中具有广泛的应用价值。此外，单克隆抗体的亲和 力较强，可以在低浓度下与抗原结合，提高了检测的准确性和可靠性。
免疫监测
通过检测患者体内单克隆抗体的存在和水平，评估免疫治疗效果和 疾病进展，指导治疗方案调整。
05
单克隆抗体的未来展望
新技术与新方法的开发
基因工程技术
利用基因工程技术对单克隆抗体的基因进行改造， 提高其特异性和亲和力，降低免疫原性。
细胞工程技术
通过细胞工程技术，实现单克隆抗体的体外扩增 和筛选，提高生产效率和纯度。
提高单克隆抗体的生产效率与质量
优化细胞培养条件
通过优化细胞培养条件，提高单克隆抗体的生产效率和纯度。
质量控制与监管
加强单克隆抗体的质量控制和监管，确保产品的安全性和有效性。
降低生产成本
通过降低生产成本，使单克隆抗体药物更加普及和可及。
THANK YOU
பைடு நூலகம்
细胞筛选与克隆化
在筛选过程中，通过抗原-抗体反应 检测杂交瘤细胞产生的抗体特异性。
通过有限稀释法或流式细胞术等方法 对阳性细胞进行克隆化培养，以获得 能稳定分泌所需抗体的杂交瘤细胞株 。
详细描述
单克隆抗体的灵敏度极高，可以检测出纳克级别甚至皮克级别的抗原，这使得它 在生物检测、医学诊断和治疗中具有广泛的应用价值。此外，单克隆抗体的亲和 力较强，可以在低浓度下与抗原结合，提高了检测的准确性和可靠性。
免疫监测
通过检测患者体内单克隆抗体的存在和水平，评估免疫治疗效果和 疾病进展，指导治疗方案调整。
05
单克隆抗体的未来展望
新技术与新方法的开发
基因工程技术
利用基因工程技术对单克隆抗体的基因进行改造， 提高其特异性和亲和力，降低免疫原性。
细胞工程技术
通过细胞工程技术，实现单克隆抗体的体外扩增 和筛选，提高生产效率和纯度。
提高单克隆抗体的生产效率与质量
优化细胞培养条件
通过优化细胞培养条件，提高单克隆抗体的生产效率和纯度。
质量控制与监管
加强单克隆抗体的质量控制和监管，确保产品的安全性和有效性。
降低生产成本
通过降低生产成本，使单克隆抗体药物更加普及和可及。
THANK YOU
பைடு நூலகம்
细胞筛选与克隆化
在筛选过程中，通过抗原-抗体反应 检测杂交瘤细胞产生的抗体特异性。
通过有限稀释法或流式细胞术等方法 对阳性细胞进行克隆化培养，以获得 能稳定分泌所需抗体的杂交瘤细胞株 。
单克隆抗体制备课件
单克隆抗体可以用于治疗疾病，如肿瘤、自身免疫性疾病等。
单克隆抗体可以用于生物标记，如免疫荧光、免疫组化等。
03
02
01
02
CHAPTER
单克隆抗体的制备流程
根据实验需求，选择适当的抗原作为免疫原，如蛋白质、多肽、细胞或组织等。
确定免疫原
对免疫原进行纯化，去除杂质，提高免疫效果。
免疫原的纯化
将免疫原与佐剂混合，增强免疫反应。
疾病发病机制研究
单克隆抗体可以用于研究疾病的发病机制，通过阻断或激活特定的信号通路，揭示疾病的发生和发展过程。
药物靶点筛选
单克隆抗体可以用于筛选药物靶点，通过与特定蛋白质结合，为新药研发提供潜在的靶点。
细胞信号转导研究
单克隆抗体可以用于研究细胞信号转导，通过阻断或激活特定的信号分子，研究细胞内信号转导的机制。
通过抗原表位鉴定技术，确定抗体识别的抗原表位，确保抗体的特异性。
抗体识别表位的鉴定
抗原特异性
热稳定性检测
将抗体加热至一定温度，观察其是否仍能保持与抗原的结合能力，评估抗体的热稳定性。
长期稳定性检测
将抗体储存一定时间后，观察其是否仍保持原有的生物学活性，评估抗体的长期稳定性。
05
CHAPTER
单克隆抗体的பைடு நூலகம்用前景
单克隆抗体制备课件
目录
单克隆抗体的基础知识单克隆抗体的制备流程单克隆抗体的生产技术单克隆抗体的质量控制单克隆抗体的应用前景
高中生物单克隆抗体制备(共38张PPT)
提示1：对B细胞进行细胞培养可行吗？ 提示2：所学哪种细胞可以无限增殖？
4、单克隆抗体的制备方案 （只一分个泌一效种应特B细异胞性抗体）+（一能个无骨限髓增瘤殖细）胞
单克隆 抗体
动物细胞 培养源自文库术
杂交瘤 细胞
动物细胞 融合技术
既能产生特异性抗体， 又能大量繁殖的细胞
1975年英国科学家米尔斯坦和柯勒的实验 制备单克隆抗体
淋巴细胞，说的也就是抗原决定簇刺
激B淋巴细胞，使其分裂分化出特异 性的浆细胞，分泌特异性抗体。
2、抗体的传统生产方法
从
抗 原
动 物 体 内
多 种 浆
多 种
细抗
胞体
血 清 中 分 离 抗
体
该法制备抗体的特点：
产量低、纯度低，且抗体 的特异性差、灵敏度低。
3、单克隆抗体的概念
读下面一段文字资料，找出单克隆抗体的概念
克隆单个杂交
符合要求的 杂交瘤细胞
瘤细胞，可制备
克隆
抗一种抗原决定
体外培养 小鼠腹腔内增殖 簇的特异单克隆
单克隆抗体
抗体。
6、原理：
细胞膜的流动性、细胞增殖
7、单克隆抗体的突出优点：
特异性强、灵敏度高、纯度高、 产量大、容易大规模生产
8、单克隆抗体的应用
诊断试剂——最广泛应用
准确、高效、简易、快速
4、单克隆抗体的制备方案 （只一分个泌一效种应特B细异胞性抗体）+（一能个无骨限髓增瘤殖细）胞
单克隆 抗体
动物细胞 培养源自文库术
杂交瘤 细胞
动物细胞 融合技术
既能产生特异性抗体， 又能大量繁殖的细胞
1975年英国科学家米尔斯坦和柯勒的实验 制备单克隆抗体
淋巴细胞，说的也就是抗原决定簇刺
激B淋巴细胞，使其分裂分化出特异 性的浆细胞，分泌特异性抗体。
2、抗体的传统生产方法
从
抗 原
动 物 体 内
多 种 浆
多 种
细抗
胞体
血 清 中 分 离 抗
体
该法制备抗体的特点：
产量低、纯度低，且抗体 的特异性差、灵敏度低。
3、单克隆抗体的概念
读下面一段文字资料，找出单克隆抗体的概念
克隆单个杂交
符合要求的 杂交瘤细胞
瘤细胞，可制备
克隆
抗一种抗原决定
体外培养 小鼠腹腔内增殖 簇的特异单克隆
单克隆抗体
抗体。
6、原理：
细胞膜的流动性、细胞增殖
7、单克隆抗体的突出优点：
特异性强、灵敏度高、纯度高、 产量大、容易大规模生产
8、单克隆抗体的应用
诊断试剂——最广泛应用
准确、高效、简易、快速
单克隆抗体的制备PPT课件
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单克隆抗体制备原理
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单克隆抗体杂交瘤技术基本流程
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在培养基中加入氨基嘌呤，收集增殖细胞！ 3种杂交细胞：①B-B融合细胞、②杂交瘤细胞
③瘤-瘤融合细胞 未融合的细胞：④单个的B细胞、⑤单个的骨髓瘤细胞
如果含有与待测物相似结构或部分相同结构的物质存在交叉反应,将测定 结果升高,导致假阳性,一般以交叉反应率表示,交叉反应率越小,说明抗体 特异性越好。
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7.单克隆抗体的亚类鉴定和腹水效价测 定
将单抗腹水与Sigma公司的标准抗BALB/C 小鼠IgA, IgG1,IgG2a, IgG2b、IgG3,IgM抗体，作双向琼脂扩散试
取出腹水,立即离心,去除 上层的腹腔脂肪,下层有 时会出现细胞,除去。 离心后马上进行纯化。
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单克隆抗体的制备步骤
九：单克隆抗体的纯化
饱和硫酸铵一DEAE离子交换柱法 离子交换是指液相中的离子与固定相上可解离基团的可逆交换反应。
利用这个反应先将要分离的混合物在一定pH的溶液中解离,而后流经 固定相,使之与固定相上的可解离基团进行离子交换,吸附于固定相上, 凡不能进行交换吸附的成分,则流出层析柱外。当pH一7.4时,IgG所带 电荷为零,最先流出柱子。过柱前先用饱和硫酸铵法初步提纯。蛋白 质在不同浓度的盐溶液中相对溶解度不同,血清丫球蛋白在一定浓度 盐溶液中易于沉淀,而白蛋白则不易沉淀,据此可将二者分离 辛酸一饱和硫酸铵法 _在酸性条件不(pH4.5),非lgG的蛋白成份(包括白蛋白,部分免疫球蛋 白),能被辛酸等短链脂肪酸沉淀,上清中剩余的蛋白主要为IgG,再用硫 酸钱沉淀上清,即可获得纯度较高的IgG。
单克隆抗体制备原理
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单克隆抗体杂交瘤技术基本流程
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在培养基中加入氨基嘌呤，收集增殖细胞！ 3种杂交细胞：①B-B融合细胞、②杂交瘤细胞
③瘤-瘤融合细胞 未融合的细胞：④单个的B细胞、⑤单个的骨髓瘤细胞
如果含有与待测物相似结构或部分相同结构的物质存在交叉反应,将测定 结果升高,导致假阳性,一般以交叉反应率表示,交叉反应率越小,说明抗体 特异性越好。
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7.单克隆抗体的亚类鉴定和腹水效价测 定
将单抗腹水与Sigma公司的标准抗BALB/C 小鼠IgA, IgG1,IgG2a, IgG2b、IgG3,IgM抗体，作双向琼脂扩散试
取出腹水,立即离心,去除 上层的腹腔脂肪,下层有 时会出现细胞,除去。 离心后马上进行纯化。
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单克隆抗体的制备步骤
九：单克隆抗体的纯化
饱和硫酸铵一DEAE离子交换柱法 离子交换是指液相中的离子与固定相上可解离基团的可逆交换反应。
利用这个反应先将要分离的混合物在一定pH的溶液中解离,而后流经 固定相,使之与固定相上的可解离基团进行离子交换,吸附于固定相上, 凡不能进行交换吸附的成分,则流出层析柱外。当pH一7.4时,IgG所带 电荷为零,最先流出柱子。过柱前先用饱和硫酸铵法初步提纯。蛋白 质在不同浓度的盐溶液中相对溶解度不同,血清丫球蛋白在一定浓度 盐溶液中易于沉淀,而白蛋白则不易沉淀,据此可将二者分离 辛酸一饱和硫酸铵法 _在酸性条件不(pH4.5),非lgG的蛋白成份(包括白蛋白,部分免疫球蛋 白),能被辛酸等短链脂肪酸沉淀,上清中剩余的蛋白主要为IgG,再用硫 酸钱沉淀上清,即可获得纯度较高的IgG。
单克隆抗体技术医学PPT
可溶性抗原：多糖、药物、激素、肽类等分子量小于 5000 Da 物质。
注意：可溶性抗原需与BSA、OA等载体交联后成颗粒性抗 原才能刺激动物产生可应用的高效价的抗体。
Fra Baidu bibliotek
2、免疫动物
• （1）动物选择：一般采用与骨髓瘤细胞供体来源同一品 系的动物进行免疫（如：小鼠）。由于免疫动物品系与所 采用的骨髓瘤细胞差异较远，产生的杂交瘤细胞稳定性越 差。
• （2）抗原与载体：抗原分为可溶性和颗粒性抗原，载体 分膜体和珠体。
• （3）免疫途径：较为常用 的途径有腹腔，皮下淋巴器官 或静脉等，较为常用的途径是腹腔注射。
2、免疫动物
• 可溶性抗原（蛋白质）：
• 以1mg/ml～5mg／ml的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化，分多 点小鼠皮下注射，总量为0.3ml～0.6ml，间隔３～５周再同样注射一 次，10天后，断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠做融合试 验。一个月后可以经静脉（尾静脉）给予无佐剂抗原0.2ml～0.4ml， ３～４天后，杀死小鼠取脾做融合用。
单克隆抗体技术
提纲
• 单克隆抗体的概念 • 单克隆抗体的制备 • 单克隆抗体的应用
莱克多巴胺单克隆抗体
• 1975年英国科学家Milstein和Kohler将产生抗体的淋巴细 胞同肿瘤细胞融合，成功建立了单克隆抗体技术，而获得 1984年诺贝尔医学和生理学奖。
注意：可溶性抗原需与BSA、OA等载体交联后成颗粒性抗 原才能刺激动物产生可应用的高效价的抗体。
Fra Baidu bibliotek
2、免疫动物
• （1）动物选择：一般采用与骨髓瘤细胞供体来源同一品 系的动物进行免疫（如：小鼠）。由于免疫动物品系与所 采用的骨髓瘤细胞差异较远，产生的杂交瘤细胞稳定性越 差。
• （2）抗原与载体：抗原分为可溶性和颗粒性抗原，载体 分膜体和珠体。
• （3）免疫途径：较为常用 的途径有腹腔，皮下淋巴器官 或静脉等，较为常用的途径是腹腔注射。
2、免疫动物
• 可溶性抗原（蛋白质）：
• 以1mg/ml～5mg／ml的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化，分多 点小鼠皮下注射，总量为0.3ml～0.6ml，间隔３～５周再同样注射一 次，10天后，断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠做融合试 验。一个月后可以经静脉（尾静脉）给予无佐剂抗原0.2ml～0.4ml， ３～４天后，杀死小鼠取脾做融合用。
单克隆抗体技术
提纲
• 单克隆抗体的概念 • 单克隆抗体的制备 • 单克隆抗体的应用
莱克多巴胺单克隆抗体
• 1975年英国科学家Milstein和Kohler将产生抗体的淋巴细 胞同肿瘤细胞融合，成功建立了单克隆抗体技术，而获得 1984年诺贝尔医学和生理学奖。
单克隆抗体制备ppt课件
.
（7）杂交瘤细胞克隆化
将分泌单克隆抗体阳性的杂交瘤细胞克隆按有限稀 释法稀释细胞（用HAT培养液稀释细胞），于96孔培 养板中加入0.1ml/孔，培养2周，利用间接ELISA法挑 选单个阳性杂交瘤细胞克隆孔并再次进行亚克隆，直至 亚克隆时全部克隆孔细胞培养上清中抗体检出阳性率为 100%为止。
.
.
（5）细胞融合
1）将骨髓瘤细胞与脾脏细胞按1：10或1：5的比例混
合，在50ml离心管中用无血清培养液洗1次，离心
弃上清； 2）1min内加入37℃预温的1ml 50％PEG溶液，边加边
摇37℃水浴1min； 3）加37℃预温的不完全培养液以终止PEG作用，每隔
2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml； 4）离心，弃上清，用含20％小牛血清HAT选择培养液
.
4. 抗原的处理
1）颗粒性抗原：红细胞、菌体等制成悬液，不需佐 剂，直接免疫。菌体数1×1010个/ml 为宜。
2）可溶性蛋白质抗原（如人IgG）、病毒抗原、细菌 可溶性抗原组分等，可以直接与弗氏完全佐剂 （1：1 V/V）混合、乳化。
3）半抗原（多糖、多肽、激素、化学药品）需与载 体偶联。常用载体有牛血清白蛋白（BSA）、钥 孔嘁血蓝素(KLH)、鸡血清蛋白（OA）；偶联剂 有过碘酸钠、戊二醛和碳化二亚胺等。KLH是最 常用的载体蛋白，碳化二亚胺是最常用的偶联 剂。
（7）杂交瘤细胞克隆化
将分泌单克隆抗体阳性的杂交瘤细胞克隆按有限稀 释法稀释细胞（用HAT培养液稀释细胞），于96孔培 养板中加入0.1ml/孔，培养2周，利用间接ELISA法挑 选单个阳性杂交瘤细胞克隆孔并再次进行亚克隆，直至 亚克隆时全部克隆孔细胞培养上清中抗体检出阳性率为 100%为止。
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（5）细胞融合
1）将骨髓瘤细胞与脾脏细胞按1：10或1：5的比例混
合，在50ml离心管中用无血清培养液洗1次，离心
弃上清； 2）1min内加入37℃预温的1ml 50％PEG溶液，边加边
摇37℃水浴1min； 3）加37℃预温的不完全培养液以终止PEG作用，每隔
2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml； 4）离心，弃上清，用含20％小牛血清HAT选择培养液
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4. 抗原的处理
1）颗粒性抗原：红细胞、菌体等制成悬液，不需佐 剂，直接免疫。菌体数1×1010个/ml 为宜。
2）可溶性蛋白质抗原（如人IgG）、病毒抗原、细菌 可溶性抗原组分等，可以直接与弗氏完全佐剂 （1：1 V/V）混合、乳化。
3）半抗原（多糖、多肽、激素、化学药品）需与载 体偶联。常用载体有牛血清白蛋白（BSA）、钥 孔嘁血蓝素(KLH)、鸡血清蛋白（OA）；偶联剂 有过碘酸钠、戊二醛和碳化二亚胺等。KLH是最 常用的载体蛋白，碳化二亚胺是最常用的偶联 剂。
单克隆抗体制备PPT教案学习
8-氮鸟嘌呤
－－
P3/NSI-1-Ag4-1(NS-1)
P3/X63-Ag8.Ul(P3Ul)
SP2/0-Ag14(SP2/0)
F0 S194/5.XXO.BU.1 MPC11-45.6TG1.7 210.RCY3.Ag1.2.3 GM15006TG-A12
U-266AR
P3/X63-Ag8 （X63×BALB/C脾细胞）杂交
氨基碟呤 （A）
HAT
核苷Fra Baidu bibliotek补救合成途 径
次黄嘌呤 （H）
胸腺嘧啶核苷 （T）
核苷 酸
DNA
第14页/共26页
第15页/共26页
6. 特异性抗体的检测
检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的 筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。
常用的方法有：（1）放射免疫测定（RIA）可用于可溶性抗原、 细胞McAb的检测。（2）酶联免疫吸附试验（ELISA）可用于可溶 性抗原、细胞和病毒等McAb的检测。（3）免疫荧光试验适合于 细胞表面抗原的McAb的检测。（4）其它如间接血凝试验、细胞 毒性试验、旋转粘附双层吸附试验等。
瘤
（X63×BALB/C脾细胞）杂交 瘤
BALB/C骨髓瘤
P3/X63-Ag8 BALB/C骨髓瘤MPC-11 LOU大鼠骨髓瘤R210
高中生物单克隆抗体制备(共38张PPT)
单克隆 抗体
注射抗原
效应B细胞
骨髓瘤细胞
融合
3.若细胞两两融合后， 有几种融合情况？
选择性培养基 筛选1 克隆化
多种杂 交细胞
抗原-抗体 杂交法
筛选2（有限稀释）
单克隆 抗体
注射抗原
效应B细胞
骨髓瘤细胞
融合
4.第一次筛选出的杂交瘤
细胞为何需进行克隆化培
选择性培养基 筛选1
养和专一抗体检测？
多种杂
克隆单个杂交
符合要求的 杂交瘤细胞
瘤细胞，可制备
克隆
抗一种抗原决定
体外培养 小鼠腹腔内增殖 簇的特异单克隆
单克隆抗体
抗体。
6、原理：
细胞膜的流动性、细胞增殖
7、单克隆抗体的突出优点：
特异性强、灵敏度高、纯度高、 产量大、容易大规模生产
8、单克隆抗体的应用
诊断试剂——最广泛应用
准确、高效、简易、快速
5、单克隆 抗体制备 过程步骤
注射抗原
效应B细胞
融合
骨髓瘤细胞
1.注射抗原的目的
选择性培养基 筛选1
是什么？
多种杂
克隆化
交细胞
抗原-抗体 杂交法
筛选2（有限稀释）
单克隆 抗体
注射抗原
效应B细胞
融合
骨髓瘤细胞
2.诱导细胞融合的
《单克隆抗体的制备》课件
2
免疫动物注射
将免疫原注射到小鼠或兔子等动物体内，激发免疫反应。
3
细胞融合
从免疫动物体内取出脾细胞和骨髓细胞，与癌细胞融合，形成杂交瘤细胞。
4
单克隆抗体筛选
通过筛选，选择具有特异性并高亲和力的单克隆抗体。
单克隆抗体制备中常见问题及解决方法
1 低抗体产量
优化免疫动物的免疫方 案和细胞培养条件。
2 杂交瘤细胞稳定性 3 克隆混杂
单克隆抗体的市场前景
市场规模
预计未来几年内，单克隆抗体市场将继续增长。
新兴应用பைடு நூலகம்
单克隆抗体在精准医疗和个性化治疗领域有着广阔的市场前景。
技术进步
随着技术的不断进步，单克隆抗体的制备和应用将变得更加高效和便捷。
单克隆抗体的未来发展趋势
未来，单克隆抗体的发展将趋向于更精准、个性化和多功能化。通过基因工 程和纳米技术的应用，单克隆抗体的研究和应用领域将进一步拓展。
《单克隆抗体的制备》
单克隆抗体是生物医学研究和临床应用中的重要工具，能够精确靶向病理标 志物，具有巨大的应用潜力。
单克隆抗体的定义和作用
单克隆抗体是由一种特定的细胞克隆产生的抗体，能够与特定抗原高度特异性地结合。它在疾病诊断、 治疗和研究中发挥着重要作用。
制备单克隆抗体的步骤
1
免疫原制备
选择合适的免疫原，如蛋白质或多肽，制备免疫原样品。
单克隆抗体的制备PPT
答案： (1)动物细胞培养(微生物培养)
(2)选择
(3)特异性强，灵敏度高
(4)灭活的病毒
(5)在体外大量增殖 (6)骨髓 造血干 分泌特异性抗体
(7)主动运输(主动吸收)
考一考：
1.下图是单克隆抗体制备过程示意图，其中1过 程注射的物质和A细胞的名称分别为( )
A.抗体、T淋巴细胞 C.抗体、B淋巴细胞
青岛市首届中小学“翻转课堂”微视频参赛作品
单克隆抗体的制备
莱西一中北校
吕慧卿
学习目标：
1、单克隆抗体的优点
2、单克隆抗体的制备过程
一、单克隆抗体的优点：
特异性强 灵敏度高
可大量制备
二、单克隆抗体生产过程： 免疫小鼠
注射特定 的抗原蛋白
相应的B淋巴细胞 （效应B细胞）
骨骼瘤细胞 物理法 人工诱导融合 化学法 多种细胞 生物法
现代生物技术手段越来越多的应 用在我们的生活和生产当中，关 注生物技术，关注前沿科技，让 我们用现代生物技术手段更多的
造福人类，创造充满希望的明天！
B.抗原、T淋巴细胞 D.抗原、B淋巴细胞
2、用动物细胞工程获得单克隆抗体，下列实验步
骤错误的是( )
A、将抗原注入小鼠体内，获得能产生抗体的B淋
巴细胞 B、用纤维素酶处理B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞 C、用聚乙二醇作诱导剂，使能产生抗体的B淋巴 细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合 D、筛选杂交瘤细胞，并从中选出能产生所需抗体 的细胞群，培养后提取单克隆抗体
单克隆抗体的制备及应用ppt课件
现在学习的是第18页，共39页
XXXXXXXXXXXXXXXXXX
克隆化：指将抗体阳性孔进行克隆化。目的是将抗体分泌细胞 、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体分泌细 胞分开。
克隆化的原则：尽早进行，反复4-5次 克隆化方法：有限稀释法、软琼脂平板法、显微克隆法 阳性杂交瘤细胞应及时冻存，防染色体丢失、变异及污染
常见抗肿瘤细胞毒剂：化疗药物、细菌毒素、植
物毒素或放射性同位素等。
这不仅提高了抗体的疗效，也可降低细胞毒剂对 正常细胞的毒性反应。
31
现在学习的是第31页，共39页
XXXXXXXXXXXXXXXXX
作为免疫抑制剂
抗人T淋巴细胞单抗（McAb）作为一种新型免疫抑制剂，已广泛应用 于临床治疗自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反应，其作用机理有 赖于McAb的种类及其免疫学特性。
例子：对于同种骨髓移植的供体骨髓，在体外经抗T细胞单抗加 补体处理，能够减轻移植物抗宿主病的发生。
32
现在学习的是第32页，共39页
XXXXXXXXXXXXXXXXX
作为研究工作中的探针
利用单克隆抗体的特性可把它作为研究工作中的探针。此时，可以 从分子、细胞和器官的不同水平上，研究抗原物质的结构与功能关 系，进而可以从理论上阐明其机理。 例子：用荧光物质标记单抗作为探针，能快速地确定与其结合的相 应生物大分子在细胞中的位置和分布。
《单克隆抗体制备》课件
单克隆抗体制备流程
1
免疫原选择
选择合适的免疫原，如细胞、蛋白或多肽。
2
免疫动物免疫
将免疫原注射到小鼠或其他动物中，激发其产生抗体。
3
融合细胞制备
将免疫细胞与癌细胞融合，形成杂交瘤细胞。
单克隆抗体制备的方法
杂交瘤法
将免疫细胞与癌细胞融合， 形成杂交瘤细胞，从而制备 出单克隆抗体。
重链变异法
通过重链基因的变异和筛选， 获得带有特定抗原亲和性的 单克隆抗体。
单克隆抗体制备
欢迎来到《单克隆抗体制备》的PPT课件！本课程将介绍单克隆抗体的概念、 制备流程、方法、应用、与疾病治疗的关系，以及制备过程中的挑战。让我 们一起开始探索这个令人兴奋的领域吧！
什么是单克隆抗体
单克隆抗体是由一种单一的抗体细胞克隆所产生的抗体，具有高度专一性和 亲和性。它们被广泛应用于疾病的诊断和治疗领域。
单克隆抗体制备的挑战
• 免疫原选择的挑战 • 克隆纯化的困难 • 制备时间和成本的考虑
结论和总结
单克隆抗体制备是一项复杂而重要的技术，它为研究和治疗领域提供了丰富 的工具和机会。通过深入了解单克隆抗体的制备流程和应用，我们能够更好 地应对疾病挑战，为人类的健康保驾护航。
转基因动物法
通过将人类抗体基因转入小 鼠等动物，使其产生人类单 克隆抗体。
单克隆抗体制备的应用
单克隆抗体的制备PPT课件
单克隆抗体的制备
广州医学院第一附属医院检验科 廖伟娇
一、单克隆抗体概念：
每一克隆B细胞所产生的理 化性状高度均一、组成均一、只 与同一种抗原决定族反应的抗体， 称为单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）。
二、杂交瘤技术制备单克隆抗体流程
动物免疫 分离脾细胞 制备骨髓瘤细胞
ELISA测血清 细胞融合 HAT培养基选择杂交瘤细胞 阳性孔克隆化并扩大培养 再次克隆
克隆扩大培养
扩大培养收集上清液
动物接种收集腹水
单克隆抗体纯化保存
三、单克隆抗体的基本技术 1.抗原提纯与动物免疫： 抗原纯度高：电泳纯 与骨髓瘤细胞同源的BALB/c小鼠 2.细胞的选择：
A 经过抗原免疫的B细胞（脾细胞）。 B 肿瘤细胞(多发性骨髓瘤细胞:Sp2/0）。 3.细胞融合： 融合剂：聚乙二醇 (PEG,常用聚合度1000~2000浓度w/v：40%) 细胞比例： 1:2~1:10，常用1:4。 反应时间：2~4min。
4.培养基的选择：HAT培养基。含有三种关键成 分 ： 次 黄 嘌 呤 (hypoxanthine,H) 氨 甲 蝶 呤 (aminopterin,A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine,T).
5.细胞的DNA合成一般有两条途径：
A：由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA， 叶酸作为重要的辅酶参与反应。
广州医学院第一附属医院检验科 廖伟娇
一、单克隆抗体概念：
每一克隆B细胞所产生的理 化性状高度均一、组成均一、只 与同一种抗原决定族反应的抗体， 称为单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）。
二、杂交瘤技术制备单克隆抗体流程
动物免疫 分离脾细胞 制备骨髓瘤细胞
ELISA测血清 细胞融合 HAT培养基选择杂交瘤细胞 阳性孔克隆化并扩大培养 再次克隆
克隆扩大培养
扩大培养收集上清液
动物接种收集腹水
单克隆抗体纯化保存
三、单克隆抗体的基本技术 1.抗原提纯与动物免疫： 抗原纯度高：电泳纯 与骨髓瘤细胞同源的BALB/c小鼠 2.细胞的选择：
A 经过抗原免疫的B细胞（脾细胞）。 B 肿瘤细胞(多发性骨髓瘤细胞:Sp2/0）。 3.细胞融合： 融合剂：聚乙二醇 (PEG,常用聚合度1000~2000浓度w/v：40%) 细胞比例： 1:2~1:10，常用1:4。 反应时间：2~4min。
4.培养基的选择：HAT培养基。含有三种关键成 分 ： 次 黄 嘌 呤 (hypoxanthine,H) 氨 甲 蝶 呤 (aminopterin,A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine,T).
5.细胞的DNA合成一般有两条途径：
A：由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA， 叶酸作为重要的辅酶参与反应。
单克隆抗体技术讲解PPT课件
加入HAT培养液悬 浮细胞，置于培养 孔内
13
4. HAT选择性培养
HAT是用于筛选具有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)或胸苷激酶
(TK)活性缺陷细胞的培养基。含有次黄嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)、胸
苷(T)和甘氨酸。在氨基蝶呤(二氢叶酸类似物)存在下，这种酶缺陷 的细胞不能通过核苷酸合成旁路合成次黄嘌呤和胸苷。HPRT和TK缺
单克隆抗体的特点1理化性状高度均一结构氨基酸顺序特异性等一致2生物活性单一灵敏度高3与抗原结合的特异性强适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法4便于人为处理和质量控制来源容易可以在体外永久地存活并传代5可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗2反应强度不如多克隆抗体3制备技术复杂费时费工价格较高三单克隆抗体技术的应用1
2.骨髓瘤细胞的准备
细胞株处于良好的生长状态 细胞株保持HGPRT缺陷状态
HGPRT：次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶
12
3. 细胞融合
致敏淋巴细胞
骨髓瘤细胞 50%PEG 1 mL 培养液 10 mL
离心 1000rpm 10 min
37 °C摇动、由慢 渐快1min、静止 1.5min
离心 1000rpm 7min
17
思考：
1、如何大量生产单克隆抗体？
2、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？
18
谢谢
单克隆抗体制备(共44张PPT)
8-氮鸟嘌呤(8-AG)处理
亲本细胞的选择与制备
免疫脾细胞：是经过抗原诱导活化的免疫细胞，具有
分泌抗体的能力
8-12周龄BALB/c小鼠 先以 目标抗原(如菌体) 免疫，抗原需加 佐剂(adjuvant）注入小鼠体内慢慢释出，诱使 B 细胞成熟增殖并 生产抗体。 试采血 确定有抗体产生后，即可取出 脾脏以收集脾脏 细胞(大多为B 细胞) 与骨髓瘤细胞进行 细胞融合。
有限稀释法
计数
103/ml 102/ml 10/ml
孔
将阳性孔细胞பைடு நூலகம்稀释，
重新平分到 96 孔细
单克隆抗体的制备流程和应用 最常用的骨髓瘤细胞是NS-1和SP2/0细胞株
胞培养板中，以计
传统抗血清对相似抗原会有交叉反应性 一个抗原分子可能含有许多抗原表位
算使得每孔中只含
有一个细胞（例如 杂交瘤细胞经过筛选、克隆化培养后成为单个细胞克隆，分泌的抗体即为单克隆抗体。
本章内容
单克隆抗体概念、特性、与多克隆抗体的 异同点？
杂交瘤技术的基本原理 杂交瘤细胞的克隆方法 单克隆抗体的制备流程和应用
概念
多克隆抗体（PcAb）：针对抗原不同表位 的多个B淋巴细胞克隆产生的混合抗体
单克隆抗体（McAb）：只针对抗原单一表 位的B淋巴细胞克隆产生的同源抗体
为何要使用单克隆抗体？
同时又由于免疫动物的个体差异，对抗原的反应也有相当的差异，以致无法准确控制所得到每批抗血清 效价的高低
抗体制备过程PPT课件
+ 大量生产单克隆抗体的方法主要有两种：
+
1. 体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从上清中获取单克隆抗
体。但此方法产量低，一般培养液含量为10～60μg／ml，如果大量生产，费
用较高。
+
2. 体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。
+
① 实体瘤法 对数生长期的杂交瘤细胞按1～3×107／ml接种于小鼠
背部皮下，每处注射0.2 ml, 共2～4点。待肿瘤到达一定大小后(一般10～20天
)那么可采血，从血清中获得单克隆抗体含量可到达1-10mg／ml。但采血量有
限。
+
② 腹水的制备 常规是先腹腔注射0.5mlPristane(降植烷)或液体石腊于
BaLb／c鼠，1～2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可
+
↓
+
参加96孔板，100μl／孔
+
↓
+
放入37℃ CO2孵箱培养
+ 一般饲养细胞在融合前一天制备，一只小 鼠可获得5～8×106腹腔巨噬细胞，假设用 小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时，细胞浓度 为5×106／ml，小鼠脾细胞为1×106／ml ，小鼠的成纤维细胞(3T3)1×105／ml，均 为100μl／孔。
轻轻吹打即可悬起细胞。
+ 一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨 髓瘤细胞，为确保该细胞对HAT的敏感性， 每3～6月应用8～AG(8氮杂鸟嘌呤)筛选一次 ，以防止细胞的突变。
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大量制备抗体
腹腔内培养
44
实验流程 体外细胞培养
45
实验流程
注意： 阳性细胞克隆的冻存与复苏
46
问题四:
单克隆抗体的优缺点
47
单克隆与多克隆比较
POLYCLONAL.
Derived from different B Lymphocytes cell lines
Batch to Batch variation affecting Ab reactivity &
➢ 单克隆抗体具有均一性，推动商品化试 剂盒出现和发展；
➢ 单克隆抗体出现推动T细胞亚群研究； ➢ 单克隆抗体推动生物制药领域的发展；
3
问题一:
制备单克隆抗体的理论基础
4
克隆选择学说
➢ 1857年，FM Burnet 提出克隆选择学说。 指出：每个B淋巴细 胞表面的抗原受体只 识别一种抗原表位， 并产生针对该决定簇 的抗体。
并分泌免疫球蛋白； ➢ 骨髓瘤细胞本身不分泌免疫球蛋白； ➢ 具有较高融合效率；
15
亲本细胞之二：骨髓瘤细胞
SP2/0细胞
➢ 容易培养传代， 一般培养基即 可，无特殊要 求。
NS1细胞
16
亲本细胞之二：骨髓瘤细胞
Sp2/0为悬浮型细胞
17
细胞融合
18
细胞融合 ➢ 化学法 ➢ 物理法 ➢ 生物法
度与毒性有所不同； ➢ 应用浓度为50%；
37
挑选阳性克隆 ➢ 细胞生长至一定数量后便可进行； ➢ 方法应敏感、简单、重复性好； ➢ 方法：
➢ RIA、 ELISA、FIA；
38
挑选阳性克隆 ELISA是常用技术之一
39
克隆化 ➢ 将阳性克隆与其它克隆分开的过程。 ➢ 克隆化应及早进行，以防止阳性克隆丢
SPLEEN CELLS
PEG FUSION
MYELOMA CELLS
Feeder Cells Growth Medium
1.
HYBRIDOMA CELLS ELISA PLATE 2. HAT Medium
Plating of Cells in HAT selective Medium
Scanning of Viable Hybridomas
Enable the development of secure immunoassay systems.
PEG （聚乙二醇）为最常用的融合法
19
细胞融合
20
选择培养基 ➢ 基本成分
➢ 次黄嘌呤（H） ➢ 氨基蝶吟（A） ➢ 胸腺嘧啶（T）
HAT选择培养基
21
选择培养基作用原理 为何使用选择培养基？
22
选择培养基作用原理
23
选择培养基作用原理
24
问题三:
杂交瘤技术的实验流程
25
实验流程
26
35
细胞融合 ➢ 杂交瘤技术中最为关键一步； ➢ 融合前亲本细胞需经预处理；
➢ 融合37℃水浴中进行；
➢ 注意两种亲本细胞的比例； ➢ 选择高质量细胞融合剂； ➢ 缓慢终止融合作用；
36
关于“PEG” ➢ 分子量1500-3000 道尔顿； ➢ 诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细
胞膜易打开而有助于细胞融合； ➢ 不同厂商、批号、分子量的PEG，其纯
失。方法有： ➢ 显微操作法 ➢ 有限稀释法 ➢ 软琼脂法
40
应用有限稀释法进行克隆化
➢ 不需任何特殊设备 ➢ 克隆出现效率高 ➢ 实验室常用方法
41
细胞鉴定 ➢ 特异性 ➢ Ig类与亚类 ➢ 中和活性 ➢ 染色体核型 ➢ 识别抗原表位 ➢ 亲和力
42
大量制备抗体 体外细胞培养 腹腔内培养
43
+ 8 - Azaguanine
Myeloma Cells
HGPRT-
33
培养筛选骨髓瘤细胞 ➢ 使用对数生长期细胞，融合前进行换液，
确保细胞处于最佳状态。 ➢ 培基：RPMI1640，DMEM培养基。小
牛血清的浓度一般在10～20％ 。 ➢ 一般在准备融合前的两周就应开始复苏
骨髓瘤细胞 。
34
细胞融合
titre
NOT Powerful tools for clinical diagnostic tests
MONOCLONAL.
Derived from a single B cell clone
mAb offer Reproducible, Predictable & Potentially inexhaustible supply of Ab with exquisite specificity
12
亲本细胞之一：免疫脾细胞 ➢ 被抗原致敏的B淋巴细胞，可分化为浆
细胞并分泌免疫球蛋白；
➢ 单一B细胞克隆表达一种抗原受体，识 别并结合一种抗原表位，分泌单一特异 性抗体；
13
亲本细胞之一：免疫脾细胞
采用BALB/c小鼠
14
亲本细胞之二：骨髓瘤细胞 ➢ 选择有HGPRT或TK缺陷的细胞株； ➢ 能与B细胞杂交形成稳定的杂交瘤细胞，
实验流程
27
实验流程
细胞融合
克隆筛选
制备免疫脾细胞 培养骨髓瘤细胞
克隆化 细胞鉴定 大量制备
28
技术要点 ➢ 免疫脾细胞的制备 ➢ 骨髓瘤细胞的培养与筛选 ➢ 细胞融合 ➢ 阳性克隆的筛选 ➢ 克隆化 ➢ 大量抗体的制备
29
制备脾细胞 ➢ 选择合适的免疫方案是获得高质量的抗
体的前提； ➢ 一般要在融合前两个月左右确立免疫方
案开始初次免疫； ➢ 免疫方案应根据抗原的特性不同而定；
30
制备脾细胞
31
培养筛选骨髓瘤细胞 ➢ SP2/0细胞为肿瘤细胞，易发生突变丧
失酶的缺陷； ➢ 为确保SP2/0细胞对HAT的敏感性，每
3～6月应用8-AG(8氮鸟嘌呤)筛选一次， 以防止细胞的突变；
32
培养筛选骨髓瘤细胞
Myeloma Cells
单克隆抗体制备技术
李会强 教授
1
何谓单克隆抗体？ ➢ 单克隆抗体（ monoclonal antibody，
McAb）是指由单个杂交瘤细胞增殖而 成的细胞克隆产生的，针对某一抗原表 位的、完全均一的、单一特异性的抗体。
2
单克隆抗体的出现对医学发展的影响
➢ 单克隆抗体具有很高特异性，增加检测 方法的特异性；
5
克隆选择学说
6
克隆选择学说
淋巴细胞不能在体外长期存活
7
杂交瘤技术
杂交瘤细胞继承两个亲本细胞特性
8Байду номын сангаас
杂交瘤技术的创始人
9
杂交瘤技术 1984 荣获诺贝尔生理医学奖
杂交瘤技术是制备抗体的技术革命
10
问题二:
杂交瘤技术的基本原理
11
两个基本问题 选择亲本细胞与细胞融合
应用选择培基与杂交瘤细胞筛选