单克隆抗体制备技术-09PPT课件
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单克隆抗体PPT课件
单克隆抗体的应用领域
01
02
03
04
基础研究
用于研究生物分子结构和功能 ，探索生命现象的本质。
诊断
用于检测生物样本中的抗原、 抗体、激素等生物分子，用于
疾病的诊断和监测。
治疗
用于治疗肿瘤、自身免疫性疾 病、感染性疾病等，通过与靶 分子结合，发挥治疗作用。
免疫学检测
用于检测食品、环境、生物武 器等中的有害物质和病原微生
高特异性
总结词
单克隆抗体具有极高的特异性，能够精确地识别和结合特定的抗原，几乎不会 与其它物质发生交叉反应。
详细描述
单克隆抗体的特异性表现在它能够精确地识别和结合细胞、蛋白质、病毒等抗 原的特定表位，这种结合具有高度的选择性，避免了与其他物质的交叉反应， 提高了检测和治疗的准确性。
高灵敏度
总结词
单克隆抗体可以用于鉴别血型、 检测血红蛋白病和白细胞表面抗 原，有助于血液疾病的诊断和治 疗。
生物标记与示踪研究
1 2
细胞分型
利用单克隆抗体标记不同细胞表面抗原，对细胞 进行分型和鉴定，有助于研究细胞发育、分化及 功能。
示踪研究
将单克隆抗体与荧光、放射性同位素等标记物结 合，追踪生物体内的物质分布、代谢和排泄过程。
良好的重复性
总结词
单克隆抗体的生产和制备具有高度的一致性和重复性，保证了产品质量和实验结果的可靠性。
详细描述
通过采用适当的细胞培养技术，可以在实验室条件下实现单克隆抗体的规模化生产和制备。由于单克 隆抗体的克隆来源单一，其生产和制备过程具有高度的一致性和重复性，这使得单克隆抗体的质量稳 定可靠，实验结果的可重复性强。
提高单克隆抗体的生产效率与质量
优化细胞培养条件
《单克隆抗体技术》课件
单克隆抗体的制备与纯化
单克隆抗体是通过杂交瘤细胞在体外培养或注射到动物体内进行体内培养产生的，经过一系列的分离 和纯化过程，最终获得高纯度、高特异性的单克隆抗体。
制备过程中通常采用各种层析技术、沉淀技术等对抗体进行分离和纯化，以确保获得高质量的单克隆 抗体。
单克隆抗体的鉴定与质量控制
鉴定是通过对单克隆抗体的免疫学特 性、生物学活性和分子结构等方面进 行检测和评估，以确定其特异性和质 量。
总结实验过程和结果，分析存在的问题和改 进方向，为后续实验提供参考和依据。
感谢您的观看
THANKS
生物标记物
用于研究细胞生物学、分子生物学 等领域。
03
02
生物药物
用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病等 。
免疫分析
用于检测生物样品中的抗原、抗体 等。
04
02 单克隆抗体技术的原理
杂交瘤细胞系的建立
杂交瘤细胞系的建立是单克隆抗体技 术的核心步骤之一，通过将免疫脾细 胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细 胞。
通过抗原-抗体反应检测杂交瘤细胞产生的 抗体特异性。
克隆筛选
通过选择性培养基筛选出能够产生所需抗体 的杂交瘤细胞克隆。
细胞培养与抗体纯化
将筛选出的杂交瘤细胞进行培养，并采用蛋 白质纯化技术获得单克隆抗体。
实验结果分析与总结
结果分析
对实验结果进行统计分析，评估杂交瘤细胞 的抗体产生能力和特异性。
总结
这些杂交瘤细胞既具有脾细胞无限增 殖的能力，又具有产生特异性抗体的 能力，从而为单克隆抗体的制备提供 了稳定的细胞源。
杂交瘤细胞的筛选与克隆化
在筛选过程中，通过抗原-抗体反应检 测杂交瘤细胞产生的抗体，筛选出能 够产生所需特异性抗体的杂交瘤细胞 。
《单克隆抗体》课件
05
单克隆抗体的未来发展
新型单克隆抗体的研发
总结词
随着生物技术的不断发展，新型单克 隆抗体的研发将更加活跃，以满足更 多治疗需求。
详细描述
新型单克隆抗体将通过基因工程技术 、蛋白质工程技术等手段进行设计和 优化，以改善其疗效、降低副作用和 降低生产成本。
单克隆抗体与其他技术的结合应用
总结词
单克隆抗体将与其他治疗手段和技术相结合，以实现更有效的疾病治疗和诊断 。
03
类型
IgG、IgM、IgA等。
单克隆抗体的发现和发展历程
1901年
Ehrlich提出“侧链学说”，认为抗体是 由细胞产生的化学物质。
1986年
FDA批准第一个单克隆抗体药物上市， 用于治疗非霍奇金淋巴瘤。
1975年
Kohler和Milstein首次成功制备出单克隆 抗体。
2014年
FDA批准第一个全人源单克隆抗体药物 上市，用于治疗类风湿性关节炎。
生物治疗
总结词
单克隆抗体在生物治疗中具有显著疗效 ，可用于治疗癌症、自身免疫病等多种 疾病。
VS
详细描述
通过靶向肿瘤细胞表面抗原或免疫系统中 的特定分子，单克隆抗体能够发挥抗癌作 用。例如，针对某些癌症的单克隆抗体药 物能够抑制肿瘤生长、扩散和转移，提高 患者生存率和生活质量。此外，在自身免 疫病治疗中，单克隆抗体也具有良好疗效 ，能够调节免疫系统，缓解单克隆抗体的概述 • 单克隆抗体的制备 • 单克隆抗体的特性 • 单克隆抗体的应用实例 • 单克隆抗体的未来发展
01
单克隆抗体的概述
单克隆抗体的定义
01
单克隆抗体
由单一B细胞克隆产生的具有 高度特异性识别抗原表位的抗
单克隆抗体技术医学PPT
可溶性抗原：多糖、药物、激素、肽类等分子量小于 5000 Da 物质。
注意：可溶性抗原需与BSA、OA等载体交联后成颗粒性抗 原才能刺激动物产生可应用的高效价的抗体。
2、免疫动物
• （1）动物选择：一般采用与骨髓瘤细胞供体来源同一品 系的动物进行免疫（如：小鼠）。由于免疫动物品系与所 采用的骨髓瘤细胞差异较远，产生的杂交瘤细胞稳定性越 差。
（2）融合技术 一种是加入融合剂后直接离心使两种细胞紧密接触
（R<3000r/min），另一种是加入融合剂后轻轻搅动融 合。
• （3）提高融合频率的可能途径
•
融合过程中由于细胞特性、操作过程、PEG毒性等
多种因素都可能影响融合而减少融合频率。
•
方法：对亲本细胞预处理，改进融合技术，加入饲养
层细胞促进杂交瘤生长。
（1）体外制备
• 体外使用旋转培养瓶大量培养杂交瘤细胞，从上清 中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一般培养液含量为 10～60μg／ ml。如果大量生产，费用较高。
• 随着大规模的生产，需大量血清而使成本增加，同 时血清会影响单抗的纯度，大量血清的存在干扰抗体活性。 1978年iscove用补充大豆类脂，牛血清蛋白，转铁蛋白等 添加成分的无血清培养基培养杂交瘤细胞成功。
• HAT选择性培养基： 培养基中加次黄嘌呤HyPoxanthine H，氨基喋呤
Aminoopterin A及胸腺嘧啶核苷Thymidine T。
单克隆抗体制备原理
• HAT培养基的选择原理：
• （1）氨基蝶呤(A)是叶酸拮抗剂，可阻断细胞利用正常途 径合成DNA，细胞在含有氨甲蝶呤的培养基中不能通过正 常途径合成DNA。
3. 骨髓瘤细胞的准备
• 细胞株处于良好的生长状态，本身不能分泌任何抗体或免疫 球蛋白； • 瘤细胞的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系，以便两者组 织相容性抗原一致； • 细胞株保持HGPRT缺陷状态或TK缺陷状态。
注意：可溶性抗原需与BSA、OA等载体交联后成颗粒性抗 原才能刺激动物产生可应用的高效价的抗体。
2、免疫动物
• （1）动物选择：一般采用与骨髓瘤细胞供体来源同一品 系的动物进行免疫（如：小鼠）。由于免疫动物品系与所 采用的骨髓瘤细胞差异较远，产生的杂交瘤细胞稳定性越 差。
（2）融合技术 一种是加入融合剂后直接离心使两种细胞紧密接触
（R<3000r/min），另一种是加入融合剂后轻轻搅动融 合。
• （3）提高融合频率的可能途径
•
融合过程中由于细胞特性、操作过程、PEG毒性等
多种因素都可能影响融合而减少融合频率。
•
方法：对亲本细胞预处理，改进融合技术，加入饲养
层细胞促进杂交瘤生长。
（1）体外制备
• 体外使用旋转培养瓶大量培养杂交瘤细胞，从上清 中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一般培养液含量为 10～60μg／ ml。如果大量生产，费用较高。
• 随着大规模的生产，需大量血清而使成本增加，同 时血清会影响单抗的纯度，大量血清的存在干扰抗体活性。 1978年iscove用补充大豆类脂，牛血清蛋白，转铁蛋白等 添加成分的无血清培养基培养杂交瘤细胞成功。
• HAT选择性培养基： 培养基中加次黄嘌呤HyPoxanthine H，氨基喋呤
Aminoopterin A及胸腺嘧啶核苷Thymidine T。
单克隆抗体制备原理
• HAT培养基的选择原理：
• （1）氨基蝶呤(A)是叶酸拮抗剂，可阻断细胞利用正常途 径合成DNA，细胞在含有氨甲蝶呤的培养基中不能通过正 常途径合成DNA。
3. 骨髓瘤细胞的准备
• 细胞株处于良好的生长状态，本身不能分泌任何抗体或免疫 球蛋白； • 瘤细胞的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系，以便两者组 织相容性抗原一致； • 细胞株保持HGPRT缺陷状态或TK缺陷状态。
单克隆抗体制备 ppt课件
实验研究的目的性 — 功能、形态、数量 实验设计的科学性 — 全面、动态、鲜明、对应、对照 实验方法的合理性 — 确切、先进 实验原理的内涵性 — 意义、要点 实验操作的规范性 — 准备、严格、准确、重复
单克隆抗体制备
1
免疫血清和单克隆抗体的制备
单克隆抗体制备
2
一、免疫血清的制备
1. 原理： 机体具有多种B细胞克隆，将适当的抗原物质注入人
单克隆抗体制备
4
4. 抗原的处理
1）颗粒性抗原：红细胞、菌体等制成悬液，不需佐 剂，直接免疫。菌体数1×1010个/ml 为宜。
2）可溶性蛋白质抗原（如人IgG）、病毒抗原、细菌 可溶性抗原组分等，可以直接与弗氏完全佐剂
（1：1 V/V）混合、乳化。 3）半抗原（多糖、多肽、激素、化学药品）需与载
2. 种类
1）卡介苗（BCG）、短小棒状杆菌（CP）、脂
多糖（LPS）、细胞因子；
2）氢氧化铝、明矾；
3）双链多聚肌苷酸：胞苷酸（poly I：C）和双
链多聚腺苷酸：鸟苷酸（poly A：U）；
4）矿物油、脂质体、免疫刺激复合物
（ISCOMs）、CPG单克寡隆抗核体制备苷酸。
6
3. 弗氏完全佐剂
1）成分：羊毛脂、液体石蜡和灭活卡介苗。 2）配方：羊毛脂：液体石蜡 为1：2，也可1：1。
体偶联。常用载体有牛血清白蛋白（BSA）、钥 孔嘁血蓝素(KLH)、鸡血清蛋白（OA）；偶联剂 有过碘酸钠、戊二醛和碳化二亚胺等。KLH是最 常用的载体蛋白，碳化二亚胺是最常用的偶联
剂。
单克隆抗体制备
5
佐剂
1. 概念
佐剂属非特异性免疫增强剂，与抗原一起注射或
预先注入机体时，可增强机体免疫应答或改变免疫应 答的类型。
单克隆抗体制备
1
免疫血清和单克隆抗体的制备
单克隆抗体制备
2
一、免疫血清的制备
1. 原理： 机体具有多种B细胞克隆，将适当的抗原物质注入人
单克隆抗体制备
4
4. 抗原的处理
1）颗粒性抗原：红细胞、菌体等制成悬液，不需佐 剂，直接免疫。菌体数1×1010个/ml 为宜。
2）可溶性蛋白质抗原（如人IgG）、病毒抗原、细菌 可溶性抗原组分等，可以直接与弗氏完全佐剂
（1：1 V/V）混合、乳化。 3）半抗原（多糖、多肽、激素、化学药品）需与载
2. 种类
1）卡介苗（BCG）、短小棒状杆菌（CP）、脂
多糖（LPS）、细胞因子；
2）氢氧化铝、明矾；
3）双链多聚肌苷酸：胞苷酸（poly I：C）和双
链多聚腺苷酸：鸟苷酸（poly A：U）；
4）矿物油、脂质体、免疫刺激复合物
（ISCOMs）、CPG单克寡隆抗核体制备苷酸。
6
3. 弗氏完全佐剂
1）成分：羊毛脂、液体石蜡和灭活卡介苗。 2）配方：羊毛脂：液体石蜡 为1：2，也可1：1。
体偶联。常用载体有牛血清白蛋白（BSA）、钥 孔嘁血蓝素(KLH)、鸡血清蛋白（OA）；偶联剂 有过碘酸钠、戊二醛和碳化二亚胺等。KLH是最 常用的载体蛋白，碳化二亚胺是最常用的偶联
剂。
单克隆抗体制备
5
佐剂
1. 概念
佐剂属非特异性免疫增强剂，与抗原一起注射或
预先注入机体时，可增强机体免疫应答或改变免疫应 答的类型。
单克隆抗体的制备
⑷离心，800rpm,6min；⑸弃上清，用含 20％小牛血清HAT选择培养液重悬；⑹ 将上述细胞加入已有饲养细胞的96孔培 养板内，每孔100ul ，放入37℃ 5％CO2 培养箱培养
（三）选择杂交瘤细胞及抗体 的检测
HAT培养液：次黄嘌呤（H)、氨基蝶呤（A）、 胸腺嘧啶（T)，氨基蝶呤可阻断DNA的合成。 胸腺嘧啶激酶（TK）、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸 核糖转移酶（HGPRT）。如细胞含有此两种 酶则可启动补救途径。 在HAT培养液中，骨髓瘤细胞缺乏TK或 HGPRT而不能生长，而脾细胞能生长但不能 长期增殖而死亡，只有杂交瘤细胞具有以上两 种酶故能生长。 抗体的检测：RIA、ELISA等。
项目
McAb和常规免疫血清抗体的比较
常规免疫血清抗 体 多克隆性 特异性识别多种 抗原决定簇 不均一性，质地 混杂 批与批之间不同 低 McAb 单克隆性 特异性识别单一 抗原决定簇 同一类属，质地 纯一 特异性高，抗体 均一 高
抗体产生细胞 抗体的结合力 免疫球蛋白类别 及亚类 特异性与亲和力 有效抗体含量
原理
酵母菌可通过旁路途径激活补体，产生 C3b，酵母菌与C3b结合形成了Y- C3b复 合物。若将此复合物与巨噬细胞共育， 因巨噬细胞表面有C3b受体，则此复合 物可结合到巨噬细胞表面形成Y-C花环。
操作方法
取小白鼠一只，于腹腔内注射1640培养基10ml， 5—10分钟内处死小白鼠抽取腹腔液。 吸0.5ml腹腔液滴于洁净玻片上，然后置于湿 盒内，放置37℃水浴箱半小时。 半小时后取出，用清水冲去玻片上多余的腹腔 液（巨噬细胞黏附于玻片上），然后加0.5ml Y-C复合物，置于4℃冰箱20分钟（这个温度 巨噬细胞的吞噬作用最弱，而不影响其结合能 力）。20分钟后取出染色（瑞姬氏染色），油 镜下观察Y-C花环。
详细介绍抗体的生产制备 PPT
良好的佐剂应当具备以下条件：
• 增加抗原的表面积，并改变抗原的活性基团构型，从而增强抗原的免疫原性； • 佐剂与抗原混合能延长抗原在局部组织的存留时间，降低抗原的分解速度，使
抗原缓慢释放至淋巴系统中，持续刺激机体产生高滴度的抗体； • 佐剂可以直接或间接激活免疫活性细胞并细胞破碎：提取细胞可溶性抗原，需将细胞破碎，常用方法有冷热交替 法、超声破碎法，反复冻融法、自溶法和酶处理法等。
（3）蛋白提纯
① 超速离心法：常用密度梯度介质有蔗糖、甘油；
② 选择性沉淀法（盐析沉淀法）：其原理是根据蛋白质理化特 性的差异，采用各种沉淀剂或改变某些条件促使蛋白质抗原 成分沉淀，从而达到纯化的目的。如选用33～50％饱和度的 硫酸胺收集沉淀物；
大家应该也有点累了，稍作休息
大家有疑问的，可以询问和交流
1）细胞性抗原或颗粒性抗原
细胞性抗原：主要包括人、动物的细胞，还有细菌、螺旋体及寄生虫等。 如菌体（O）抗原的制备：选择标准菌株，接种于斜面或平板培养基表面；置 温箱37℃ 培养24h，用适量的无菌生理盐水刮下菌苔，移入无菌含有玻璃珠的 三角瓶中，充分摇匀菌体；100 ℃ 水浴2～2.5h杀菌并破坏鞭毛抗原。取处理 过的菌液，检测有无活菌的存在，合格后用无菌生理盐水稀释成每毫升8亿～ 10亿个细菌，加入苯酚（石炭酸）至最终浓度为5％，即为O抗原。
▪ 单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）:由一个识别一种抗原表位的B细 胞克隆产生的同源抗体。高度均一、特异性强、效价高、少或无交叉反应 性。
多克隆抗体（抗血清）的制备流程
抗原
半抗原+载体
佐剂 免疫动物（3-5次）
测效价 动物采血，分离血清
抗血清纯化、鉴定、保存
• 增加抗原的表面积，并改变抗原的活性基团构型，从而增强抗原的免疫原性； • 佐剂与抗原混合能延长抗原在局部组织的存留时间，降低抗原的分解速度，使
抗原缓慢释放至淋巴系统中，持续刺激机体产生高滴度的抗体； • 佐剂可以直接或间接激活免疫活性细胞并细胞破碎：提取细胞可溶性抗原，需将细胞破碎，常用方法有冷热交替 法、超声破碎法，反复冻融法、自溶法和酶处理法等。
（3）蛋白提纯
① 超速离心法：常用密度梯度介质有蔗糖、甘油；
② 选择性沉淀法（盐析沉淀法）：其原理是根据蛋白质理化特 性的差异，采用各种沉淀剂或改变某些条件促使蛋白质抗原 成分沉淀，从而达到纯化的目的。如选用33～50％饱和度的 硫酸胺收集沉淀物；
大家应该也有点累了，稍作休息
大家有疑问的，可以询问和交流
1）细胞性抗原或颗粒性抗原
细胞性抗原：主要包括人、动物的细胞，还有细菌、螺旋体及寄生虫等。 如菌体（O）抗原的制备：选择标准菌株，接种于斜面或平板培养基表面；置 温箱37℃ 培养24h，用适量的无菌生理盐水刮下菌苔，移入无菌含有玻璃珠的 三角瓶中，充分摇匀菌体；100 ℃ 水浴2～2.5h杀菌并破坏鞭毛抗原。取处理 过的菌液，检测有无活菌的存在，合格后用无菌生理盐水稀释成每毫升8亿～ 10亿个细菌，加入苯酚（石炭酸）至最终浓度为5％，即为O抗原。
▪ 单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）:由一个识别一种抗原表位的B细 胞克隆产生的同源抗体。高度均一、特异性强、效价高、少或无交叉反应 性。
多克隆抗体（抗血清）的制备流程
抗原
半抗原+载体
佐剂 免疫动物（3-5次）
测效价 动物采血，分离血清
抗血清纯化、鉴定、保存
高中生物单克隆抗体制备(共38张PPT)
2、它相当于植物体细胞杂交过 程的哪一步？ 3、它们的过程、基本原理、诱 导融合方法和意义是否相同？
1.1动物细胞融合的概念
鼠B淋巴细胞 鼠骨髓瘤细胞
人工诱导
动物细胞融合（细胞杂交）
是指（在一定的条件下）两
个或多个细胞结合形成一个
细胞（该单核细胞称为杂交
细胞）的过程。
杂交瘤细胞
问题：1、它相当于植物体细胞杂交过 程的哪一步？ 2、它们的过程、基本原理、诱 导融合方法和意义是否相同？
单克隆 抗体
注射抗原
效应B细胞
骨髓瘤细胞
融合
3.若细胞两两融合后， 有几种融合情况？
选择性培养基 筛选1 克隆化
多种杂 交细胞
抗原-抗体 杂交法
筛选2（有限稀释）
单克隆 抗体
注射抗原
效应B细胞
骨髓瘤细胞
融合
4.第一次筛选出的杂交瘤
细胞为何需进行克隆化培
选择性培养基 筛选1
养和专一抗体检测？
多种杂
（ 特异性强、灵敏度高，可大量制备）
（4）选出的杂交瘤细胞既具备骨髓瘤细胞的 迅速（ 大量增殖 ）特点，又具备淋巴细胞 的（ 分泌专一抗体）特点，经过选择性培养 的杂交瘤细胞，还需进行（ 克隆化培养 ） 和（ 抗体检测 ），经多次筛选，就可获得足
够数量的能分泌所需抗体的细胞。最后将杂 交瘤细胞在体外条件下做大规模培养，或小 鼠腹腔内增殖，从（ 细胞培养液 ）或 （ 小鼠的腹水 ）中，就可以提取出大量 的单克隆抗体了。
一个效应bb细胞只分泌一种特异性抗体杂交瘤细胞动物细胞培养技术44单克隆抗体的制备方案动物细胞融合技术单克隆抗体既能产生特异性抗体又能大量繁殖的细胞一个骨髓瘤细胞能无限增殖制备单克隆抗体1975年英国科学家米尔斯坦和柯勒的实验5单克隆抗体制备过程步骤注射抗原效应bb细胞骨髓瘤细胞融合多种杂交细胞选择性培养基筛选11抗原抗体杂交法克隆化单克隆抗体筛选22有限稀释1
1.1动物细胞融合的概念
鼠B淋巴细胞 鼠骨髓瘤细胞
人工诱导
动物细胞融合（细胞杂交）
是指（在一定的条件下）两
个或多个细胞结合形成一个
细胞（该单核细胞称为杂交
细胞）的过程。
杂交瘤细胞
问题：1、它相当于植物体细胞杂交过 程的哪一步？ 2、它们的过程、基本原理、诱 导融合方法和意义是否相同？
单克隆 抗体
注射抗原
效应B细胞
骨髓瘤细胞
融合
3.若细胞两两融合后， 有几种融合情况？
选择性培养基 筛选1 克隆化
多种杂 交细胞
抗原-抗体 杂交法
筛选2（有限稀释）
单克隆 抗体
注射抗原
效应B细胞
骨髓瘤细胞
融合
4.第一次筛选出的杂交瘤
细胞为何需进行克隆化培
选择性培养基 筛选1
养和专一抗体检测？
多种杂
（ 特异性强、灵敏度高，可大量制备）
（4）选出的杂交瘤细胞既具备骨髓瘤细胞的 迅速（ 大量增殖 ）特点，又具备淋巴细胞 的（ 分泌专一抗体）特点，经过选择性培养 的杂交瘤细胞，还需进行（ 克隆化培养 ） 和（ 抗体检测 ），经多次筛选，就可获得足
够数量的能分泌所需抗体的细胞。最后将杂 交瘤细胞在体外条件下做大规模培养，或小 鼠腹腔内增殖，从（ 细胞培养液 ）或 （ 小鼠的腹水 ）中，就可以提取出大量 的单克隆抗体了。
一个效应bb细胞只分泌一种特异性抗体杂交瘤细胞动物细胞培养技术44单克隆抗体的制备方案动物细胞融合技术单克隆抗体既能产生特异性抗体又能大量繁殖的细胞一个骨髓瘤细胞能无限增殖制备单克隆抗体1975年英国科学家米尔斯坦和柯勒的实验5单克隆抗体制备过程步骤注射抗原效应bb细胞骨髓瘤细胞融合多种杂交细胞选择性培养基筛选11抗原抗体杂交法克隆化单克隆抗体筛选22有限稀释1
单克隆抗体技术讲解PPT课件
8
局限性 ： （1）固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范 围 （2）反应强度不如多克隆抗体 （3）制备技术复杂、费时费工、价格较高
9
三、单克隆抗体技术的应用
1.检验医学诊断
（1）病原微生物抗原抗体的检测：乙肝表面抗原试纸
（2）肿瘤抗原的检测
（3）免疫细胞及其亚群的检测 （4）激素测定：早孕检测试纸、女性排卵检测试纸 （5）细胞因子的测定 （6）其他：吗啡类毒品检测试纸等
抗体工程制药
单克隆抗体的制备
1
掌握：单克隆抗体的概念和特点、制备原理， 制备方法及基本过程 熟悉：单克隆抗体技术的应用 了解：单克隆抗体的发展
2
主要内容
1.单克隆抗体的发展 2.单克隆抗体的概念和特点 3.单克隆抗体技术的应用
4.单克隆抗体的制备过程
3
没有单克隆抗体前人类所遇见的问题
银屑病
手口足病
陷细胞可以在此培养基中生存。是常用的骨髓杂交瘤细胞选择性培
养对筛选方法的要求： 多——大量样品一次检测； 快——迅速取得检测结果； 准——检测结果可靠性高； 灵——检测方法灵敏度高。 常用筛选方法： ELISA、IFA等
15
6. 克隆化过程
方法：有限稀释法 克隆建立的标准：连续两次以上100%阳性孔 饲养细胞：同品系小鼠腹腔、胸腺、脾细胞
2.蛋白质的提纯
3.肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术
10
四、单克隆抗体制备过程
致敏淋巴细胞的准备
骨髓瘤细胞的准备
细胞融合 选择性培养 抗体分泌细胞的筛选 克隆化过程
单克隆抗体的制取
11
1.致敏淋巴细胞的准备
动物选择：品系、年龄、性别、健康状态 抗原接种：方式—体内、体外 剂量—0.5-100g 次数—视抗原而定 间隔—视抗原而定 佐剂—视抗原而定 收集时间：末次接种后72 h
单克隆抗体的制备.ppt
单克隆抗体制备
总结
单克隆抗体是由单一B淋巴细胞克隆所产生 的、只作用于一个特定抗原表位的均一抗体。
动物免疫 细胞融合 HAT选择性培养
阳性杂交瘤细胞的筛选
克隆化培养
建系与冻存
单克隆抗体的大量制备
谢 谢！
Balb/c 6-8周龄
3天
免疫脾细胞
单克隆抗体制备
制备流程 细胞融合
免疫脾细胞
+
PEG
SP2/0
骨髓瘤细胞（HGPRT-/TK-）
几种细胞类型？ ？
单克隆抗体制备
制备流程 选择性培养：HAT培养基
HGPRT－/ TK－ 不能生长
死亡
HGPRT+, TK+ 能够长期生长
生长繁殖
单克隆抗体制备
制备流程
单克隆抗体制备
单克隆抗体
(monoclonal antibody, McAb)
由单一B淋巴细胞克隆所产生的、只作 用于一个特定抗原表位的均一抗体。
三个“一”
单克隆抗体制备
制备原理
致敏的B淋巴细胞 骨髓瘤细胞
杂交瘤
杂交瘤技术
单克隆抗体制备
制备流程
动物免疫
1 23
采用与骨髓瘤细胞系来源相同的品系动物。
单克隆抗体制备
制备流程 杂交瘤细胞的建系与冻存
1、连续两次克隆化阳性率达100%； 2、体外连续传代三个月以上仍能稳定分泌抗体。
单克隆抗体制备
制备流程 单克隆抗体的大量制备
体外培养法（产量10-100μg/ml）
单克隆抗体制备
制备流程
单克隆抗体的大量制备 动物体内诱生法 （产量3-10mg/ml）
临床免疫学检验技术
单克隆抗体的制备 PPT课件
单克隆抗体的制备
五、应用
这项新技术从根本上解决了在抗体制备中长期存在的特异性和可重复性 问题，可用于探讨
用于疾病诊断方面
用于疾病的治疗
用作研究工具
单克隆抗体的制备
可用以检测淋巴细胞表面分子, 以区分不同分化阶段的淋巴细胞, 用于 鉴别淋巴细胞。
可用于鉴定病原体, 准确诊断感染性疾病。 可以用于肿瘤的诊断和分型。
1946年--1995年
米尔斯坦 César Milstein（英国） 英国医学研究委员会 分子生物实验室 1927年--
单克隆抗体的制备
1994年Winter等创建了以噬菌体抗体库技术为代表的基因工程 抗体，是单克隆抗体技术的又一重要进步，该技术是按人工设 计所重新组装的新型抗体分了，使不经免疫既可获得任何一种 动物(包括人)的特异性抗体成为可能，目前基因工程抗体在疾 病的预防、诊断、及治疗方面已获得广泛应用。
三、分类：
非人源抗体
人-鼠嵌合抗体
人源化抗体
全人源抗体 抗体的应用经历了非人源抗体、人鼠嵌合抗体、人源化抗体，最
终同的阶 段。
单克隆抗体的制备
四、优缺点：
1、优点
具有特异性高、效价高、纯度高、 理化性状均一、重复性强且来源稳 定可大量生产等优点。
单克隆抗体的制备
二、制备原理
1. 致敏淋巴细胞 2. 骨髓瘤细胞 3. 饲养层细胞 4. 细胞融合 5. 选择性培养 6. 特异性抗体的检测 7. 杂交瘤细胞的克隆化 8. 杂交瘤的冻存和复苏 9. 单克隆抗体的大量制取 10.单克隆抗体的纯化
单克隆抗体的制备
单克隆抗体的制备
B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针
单克隆抗体制备(共44张PPT)
单克隆抗体制备流程图
亲本细胞的选择与制备
骨髓瘤细胞 (NS-1)
骨髓瘤细胞需定期用
细胞株稳定，易传代培养；
细胞株本身不产生Ig
是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖 转换酶 缺陷株
(hypoxanthine-guanine phos phoribosyl transferase ,HGPRT)
最常用的骨髓瘤细胞是NS-1 和SP2/0细胞株
PEG可导致细胞膜上 脂类物质的物理结构 重排，使细胞膜容易 打开而有助于细胞融 合。
常见的几种融合形式
细胞DNA合成途经
HAT选择培养基
三种关键成分：
次黄嘌呤（hypoxanthine,H）
氨基蝶呤（aminopterin,A）
胸腺嘧啶（thymidine ，T）
◆是根据细胞内嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的 生物合成途径设计的用于筛选杂交瘤细胞
因此在传统抗血清中，都含有许多种不同的抗体，分别针对这些不同的eptope。
每 mL 含有100 个 但除非抗原来源困难或有其它目的，我们仍采用传统方法，因免疫反应的启动机制非常复杂，生物整体的免疫反应是最可靠的。
单克隆抗体的制备流程和应用
细胞，若只要取一个 试采血 确定有抗体产生后，即可取出 脾脏以收集脾脏细胞(大多为B 细胞) 与骨髓瘤细胞进行 细胞融合。
2)体外增量培养法： 把杂交瘤细胞在大型培养槽 中培养，收集培养液上清即得抗体，但每 mL 只得 约数 mg，浓度较腹水稀约一千倍。最近有一种细 胞培养瓶，可产生如腹水般浓度的上清，但价格极 为昂贵 (IBS Integra Bioscience: Integra Celline)。
单克隆抗体的性质鉴定
种抗体；因此在传统抗血清中， 都含有许多种不同的抗体，分
《单克隆抗体制备》课件
02
单克隆抗体制备的流程
免疫动物
免疫动物选择
选择适合的动物作为免疫原注 射的宿主，如小鼠、大鼠等。
免疫方案设计
根据免疫原的性质和目的，设 计合适的免疫方案，包括免疫 途径、免疫次数、免疫剂量等 。
免疫原注射
将免疫原物质注射到选定的动 物体内，激发免疫反应。
杂交瘤细胞的培养
脾细胞与骨髓瘤细胞融合
免疫学研究
细胞生物学研究
单克隆抗体可以用于标记、分离和鉴定细胞，研究 细胞的生长、分化和凋亡等过程。
单克隆抗体是免疫学研究的重要工具，可用 于研究抗原、抗体和免疫反应的机制。
蛋白质组学研究
单克隆抗体可以用于蛋白质的检测、纯化和 相互作用研究，推动蛋白质组学的发展。
单克隆抗体的未来发展与挑战
技术创新
单克隆抗体的应用
01
02
03
04
生物研究
用于免疫学、细胞生物学和分 子生物学等领域的基础研究， 如检测、分离和纯化等。
医学诊断
用于疾病诊断和治疗监测，如 免疫组织化学、酶联免疫吸附 试验和放射免疫分析等。
生物制药
用于药物研发和生产，如治疗 性抗体、诊断试剂和疫苗等。
生物安全
用于检测和预防生物恐怖袭击 和传染病爆发，如检测生物武 器和病原微生物等。
特点
单克隆抗体在结构和功能上均具有高 度一致性，使其在生物研究和医学诊 断治疗中具有广泛应用。
单克隆抗体的特性
80%
高度特异性
单克隆抗体能够特异性识别和结 合抗原，具有极高的选择性。
100%
高纯度
单克隆抗体由单一B细胞克隆产 生，纯度高，避免了多克隆抗体 中不同抗体的交叉反应。
80%
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度与毒性有所不同； ➢ 应用浓度为50%；
37
挑选阳性克隆 ➢ 细胞生长至一定数量后便可进行； ➢ 方法应敏感、简单、重复性好； ➢ 方法：
➢ RIA、 ELISA、FIA；
38
挑选阳性克隆 ELISA是常用技术之一
39
克隆化 ➢ 将阳性克隆与其它克隆分开的过程。 ➢ 克隆化应及早进行，以防止阳性克隆丢
实验流程
27
实验流程
细胞融合
克隆筛选
制备免疫脾细胞 培养骨髓瘤细胞
克隆化 细胞鉴定 大量制备
28
技术要点 ➢ 免疫脾细胞的制备 ➢ 骨髓瘤细胞的培养与筛选 ➢ 细胞融合 ➢ 阳性克隆的筛选 ➢ 克隆化 ➢ 大量抗体的制备
29
制备脾细胞 ➢ 选择合适的免疫方案是获得高质量的抗
体的前提； ➢ 一般要在融合前两个月左右确立免疫方
12
亲本细胞之一：免疫脾细胞 ➢ 被抗原致敏的B淋巴细胞，可分化为浆
细胞并分泌免疫球蛋白；
➢ 单一B细胞克隆表达一种抗原受体，识 别并结合一种抗原表位，分泌单一特异 性抗体；
13பைடு நூலகம்
亲本细胞之一：免疫脾细胞
采用BALB/c小鼠
14
亲本细胞之二：骨髓瘤细胞 ➢ 选择有HGPRT或TK缺陷的细胞株； ➢ 能与B细胞杂交形成稳定的杂交瘤细胞，
失。方法有： ➢ 显微操作法 ➢ 有限稀释法 ➢ 软琼脂法
40
应用有限稀释法进行克隆化
➢ 不需任何特殊设备 ➢ 克隆出现效率高 ➢ 实验室常用方法
41
细胞鉴定 ➢ 特异性 ➢ Ig类与亚类 ➢ 中和活性 ➢ 染色体核型 ➢ 识别抗原表位 ➢ 亲和力
42
大量制备抗体 体外细胞培养 腹腔内培养
43
大量制备抗体
腹腔内培养
44
实验流程 体外细胞培养
45
实验流程
注意： 阳性细胞克隆的冻存与复苏
46
问题四:
单克隆抗体的优缺点
47
单克隆与多克隆比较
POLYCLONAL.
Derived from different B Lymphocytes cell lines
Batch to Batch variation affecting Ab reactivity &
并分泌免疫球蛋白； ➢ 骨髓瘤细胞本身不分泌免疫球蛋白； ➢ 具有较高融合效率；
15
亲本细胞之二：骨髓瘤细胞
SP2/0细胞
➢ 容易培养传代， 一般培养基即 可，无特殊要 求。
NS1细胞
16
亲本细胞之二：骨髓瘤细胞
Sp2/0为悬浮型细胞
17
细胞融合
18
细胞融合 ➢ 化学法 ➢ 物理法 ➢ 生物法
SPLEEN CELLS
PEG FUSION
MYELOMA CELLS
Feeder Cells Growth Medium
1.
HYBRIDOMA CELLS ELISA PLATE 2. HAT Medium
Plating of Cells in HAT selective Medium
Scanning of Viable Hybridomas
5
克隆选择学说
6
克隆选择学说
淋巴细胞不能在体外长期存活
7
杂交瘤技术
杂交瘤细胞继承两个亲本细胞特性
8
杂交瘤技术的创始人
9
杂交瘤技术 1984 荣获诺贝尔生理医学奖
杂交瘤技术是制备抗体的技术革命
10
问题二:
杂交瘤技术的基本原理
11
两个基本问题 选择亲本细胞与细胞融合
应用选择培基与杂交瘤细胞筛选
Enable the development of secure immunoassay systems.
案开始初次免疫； ➢ 免疫方案应根据抗原的特性不同而定；
30
制备脾细胞
31
培养筛选骨髓瘤细胞 ➢ SP2/0细胞为肿瘤细胞，易发生突变丧
失酶的缺陷； ➢ 为确保SP2/0细胞对HAT的敏感性，每
3～6月应用8-AG(8氮鸟嘌呤)筛选一次， 以防止细胞的突变；
32
培养筛选骨髓瘤细胞
Myeloma Cells
➢ 单克隆抗体具有均一性，推动商品化试 剂盒出现和发展；
➢ 单克隆抗体出现推动T细胞亚群研究； ➢ 单克隆抗体推动生物制药领域的发展；
3
问题一:
制备单克隆抗体的理论基础
4
克隆选择学说
➢ 1857年，FM Burnet 提出克隆选择学说。 指出：每个B淋巴细 胞表面的抗原受体只 识别一种抗原表位， 并产生针对该决定簇 的抗体。
titre
NOT Powerful tools for clinical diagnostic tests
MONOCLONAL.
Derived from a single B cell clone
mAb offer Reproducible, Predictable & Potentially inexhaustible supply of Ab with exquisite specificity
PEG （聚乙二醇）为最常用的融合法
19
细胞融合
20
选择培养基 ➢ 基本成分
➢ 次黄嘌呤（H） ➢ 氨基蝶吟（A） ➢ 胸腺嘧啶（T）
HAT选择培养基
21
选择培养基作用原理 为何使用选择培养基？
22
选择培养基作用原理
23
选择培养基作用原理
24
问题三:
杂交瘤技术的实验流程
25
实验流程
26
35
细胞融合 ➢ 杂交瘤技术中最为关键一步； ➢ 融合前亲本细胞需经预处理；
➢ 融合37℃水浴中进行；
➢ 注意两种亲本细胞的比例； ➢ 选择高质量细胞融合剂； ➢ 缓慢终止融合作用；
36
关于“PEG” ➢ 分子量1500-3000 道尔顿； ➢ 诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细
胞膜易打开而有助于细胞融合； ➢ 不同厂商、批号、分子量的PEG，其纯
+ 8 - Azaguanine
Myeloma Cells
HGPRT-
33
培养筛选骨髓瘤细胞 ➢ 使用对数生长期细胞，融合前进行换液，
确保细胞处于最佳状态。 ➢ 培基：RPMI1640，DMEM培养基。小
牛血清的浓度一般在10～20％ 。 ➢ 一般在准备融合前的两周就应开始复苏
骨髓瘤细胞 。
34
细胞融合
单克隆抗体制备技术
李会强 教授
1
何谓单克隆抗体？ ➢ 单克隆抗体（ monoclonal antibody，
McAb）是指由单个杂交瘤细胞增殖而 成的细胞克隆产生的，针对某一抗原表 位的、完全均一的、单一特异性的抗体。
2
单克隆抗体的出现对医学发展的影响
➢ 单克隆抗体具有很高特异性，增加检测 方法的特异性；
37
挑选阳性克隆 ➢ 细胞生长至一定数量后便可进行； ➢ 方法应敏感、简单、重复性好； ➢ 方法：
➢ RIA、 ELISA、FIA；
38
挑选阳性克隆 ELISA是常用技术之一
39
克隆化 ➢ 将阳性克隆与其它克隆分开的过程。 ➢ 克隆化应及早进行，以防止阳性克隆丢
实验流程
27
实验流程
细胞融合
克隆筛选
制备免疫脾细胞 培养骨髓瘤细胞
克隆化 细胞鉴定 大量制备
28
技术要点 ➢ 免疫脾细胞的制备 ➢ 骨髓瘤细胞的培养与筛选 ➢ 细胞融合 ➢ 阳性克隆的筛选 ➢ 克隆化 ➢ 大量抗体的制备
29
制备脾细胞 ➢ 选择合适的免疫方案是获得高质量的抗
体的前提； ➢ 一般要在融合前两个月左右确立免疫方
12
亲本细胞之一：免疫脾细胞 ➢ 被抗原致敏的B淋巴细胞，可分化为浆
细胞并分泌免疫球蛋白；
➢ 单一B细胞克隆表达一种抗原受体，识 别并结合一种抗原表位，分泌单一特异 性抗体；
13பைடு நூலகம்
亲本细胞之一：免疫脾细胞
采用BALB/c小鼠
14
亲本细胞之二：骨髓瘤细胞 ➢ 选择有HGPRT或TK缺陷的细胞株； ➢ 能与B细胞杂交形成稳定的杂交瘤细胞，
失。方法有： ➢ 显微操作法 ➢ 有限稀释法 ➢ 软琼脂法
40
应用有限稀释法进行克隆化
➢ 不需任何特殊设备 ➢ 克隆出现效率高 ➢ 实验室常用方法
41
细胞鉴定 ➢ 特异性 ➢ Ig类与亚类 ➢ 中和活性 ➢ 染色体核型 ➢ 识别抗原表位 ➢ 亲和力
42
大量制备抗体 体外细胞培养 腹腔内培养
43
大量制备抗体
腹腔内培养
44
实验流程 体外细胞培养
45
实验流程
注意： 阳性细胞克隆的冻存与复苏
46
问题四:
单克隆抗体的优缺点
47
单克隆与多克隆比较
POLYCLONAL.
Derived from different B Lymphocytes cell lines
Batch to Batch variation affecting Ab reactivity &
并分泌免疫球蛋白； ➢ 骨髓瘤细胞本身不分泌免疫球蛋白； ➢ 具有较高融合效率；
15
亲本细胞之二：骨髓瘤细胞
SP2/0细胞
➢ 容易培养传代， 一般培养基即 可，无特殊要 求。
NS1细胞
16
亲本细胞之二：骨髓瘤细胞
Sp2/0为悬浮型细胞
17
细胞融合
18
细胞融合 ➢ 化学法 ➢ 物理法 ➢ 生物法
SPLEEN CELLS
PEG FUSION
MYELOMA CELLS
Feeder Cells Growth Medium
1.
HYBRIDOMA CELLS ELISA PLATE 2. HAT Medium
Plating of Cells in HAT selective Medium
Scanning of Viable Hybridomas
5
克隆选择学说
6
克隆选择学说
淋巴细胞不能在体外长期存活
7
杂交瘤技术
杂交瘤细胞继承两个亲本细胞特性
8
杂交瘤技术的创始人
9
杂交瘤技术 1984 荣获诺贝尔生理医学奖
杂交瘤技术是制备抗体的技术革命
10
问题二:
杂交瘤技术的基本原理
11
两个基本问题 选择亲本细胞与细胞融合
应用选择培基与杂交瘤细胞筛选
Enable the development of secure immunoassay systems.
案开始初次免疫； ➢ 免疫方案应根据抗原的特性不同而定；
30
制备脾细胞
31
培养筛选骨髓瘤细胞 ➢ SP2/0细胞为肿瘤细胞，易发生突变丧
失酶的缺陷； ➢ 为确保SP2/0细胞对HAT的敏感性，每
3～6月应用8-AG(8氮鸟嘌呤)筛选一次， 以防止细胞的突变；
32
培养筛选骨髓瘤细胞
Myeloma Cells
➢ 单克隆抗体具有均一性，推动商品化试 剂盒出现和发展；
➢ 单克隆抗体出现推动T细胞亚群研究； ➢ 单克隆抗体推动生物制药领域的发展；
3
问题一:
制备单克隆抗体的理论基础
4
克隆选择学说
➢ 1857年，FM Burnet 提出克隆选择学说。 指出：每个B淋巴细 胞表面的抗原受体只 识别一种抗原表位， 并产生针对该决定簇 的抗体。
titre
NOT Powerful tools for clinical diagnostic tests
MONOCLONAL.
Derived from a single B cell clone
mAb offer Reproducible, Predictable & Potentially inexhaustible supply of Ab with exquisite specificity
PEG （聚乙二醇）为最常用的融合法
19
细胞融合
20
选择培养基 ➢ 基本成分
➢ 次黄嘌呤（H） ➢ 氨基蝶吟（A） ➢ 胸腺嘧啶（T）
HAT选择培养基
21
选择培养基作用原理 为何使用选择培养基？
22
选择培养基作用原理
23
选择培养基作用原理
24
问题三:
杂交瘤技术的实验流程
25
实验流程
26
35
细胞融合 ➢ 杂交瘤技术中最为关键一步； ➢ 融合前亲本细胞需经预处理；
➢ 融合37℃水浴中进行；
➢ 注意两种亲本细胞的比例； ➢ 选择高质量细胞融合剂； ➢ 缓慢终止融合作用；
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关于“PEG” ➢ 分子量1500-3000 道尔顿； ➢ 诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细
胞膜易打开而有助于细胞融合； ➢ 不同厂商、批号、分子量的PEG，其纯
+ 8 - Azaguanine
Myeloma Cells
HGPRT-
33
培养筛选骨髓瘤细胞 ➢ 使用对数生长期细胞，融合前进行换液，
确保细胞处于最佳状态。 ➢ 培基：RPMI1640，DMEM培养基。小
牛血清的浓度一般在10～20％ 。 ➢ 一般在准备融合前的两周就应开始复苏
骨髓瘤细胞 。
34
细胞融合
单克隆抗体制备技术
李会强 教授
1
何谓单克隆抗体？ ➢ 单克隆抗体（ monoclonal antibody，
McAb）是指由单个杂交瘤细胞增殖而 成的细胞克隆产生的，针对某一抗原表 位的、完全均一的、单一特异性的抗体。
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单克隆抗体的出现对医学发展的影响
➢ 单克隆抗体具有很高特异性，增加检测 方法的特异性；