考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量
考马斯亮蓝G250
考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量定二、原理考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm 波长下有最大光吸收。
其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h 内保持稳定。
该法是1976年Bradford 建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry 法还高4 倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
二、材料、主要仪器和试剂1．实验材料香椿种子2．主要仪器（1）（2）刻度吸管（3）具塞试管、试管架（4）研钵（5）离心机、离心管（6）烧杯、量筒（7）微量取样器（8）分光光度计3．试剂（1）牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取100mg 牛血清白蛋白，溶于100mL 蒸馏水中，即为1 000μg／mL 的原液。
（2）蛋白试剂考马斯亮蓝G-250的配制：称取100mg 考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1 000mL。
此溶液在常温下可放置一个月。
（3）乙醇（4）磷酸（85％）四、操作步骤1．标准曲线制作（1）0~100μg／mL 标准曲线的制作：取6 支10mL 干净的具塞试管，按表1 取样。
盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转混合，放置2min 后用1cm 光经的比色杯在595nm 波长下比色，记录各管测定的光密度OD595nm，并做标准曲线。
表1 低浓度标准曲线制作（2）0~1 000μg／mL 标准曲线的制作：另取6 支10mL 具塞试管，按表2 取样。
考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量
实验7 考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化，从而改变这些染料的光吸收。
在些基础上发展了蛋白质染色测定方法。
涉及的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫。
目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝。
考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过范德华键结合后，变为蓝色，且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律，可在595nm处比色测定。
2—5分钟即呈最大光吸收，至少稳定1小时。
在0.01—1.0 mg蛋白质/ml范围内均可。
该法操作简便迅速，消耗样品量少，但不同蛋白质之间差异大，且标准曲线线性差。
高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂时测定有干扰。
缓冲液浓度过高时，改变测定液pH值会影响显色。
考马斯亮蓝染色能力强，比色杯不洗干净会影响光吸收值，不可用石英杯测定。
三、材料、试剂与器具（一）试剂1、染色液：取考马斯亮蓝G-250 100mg（20mg）溶于50ml （20ml）95%乙醇中，加100ml 85%磷酸，加水稀释至1升。
该染色液可保存数月，若不加水可长期保存，用前稀释。
2、标准蛋白溶液：称取25mg牛血清白蛋白，加蒸馏水溶解并定容至100ml，将此溶液稀释2.5倍，即为100μg/mL标准液。
4摄氏度保存备用。
3提取液：50mmol/L磷酸盐缓冲液（KPP）pH7.8：称取7.6gK2HPO4和0.89gKH2PO4蒸馏水溶解，定容至1L，调pH至7.8。
50mmol/LKPP（pH7.8）内含1%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）四、操作步骤（一）标准曲线的制作3、用分光光度计比色测定吸光值A595nm。
(注意应在一小时内完成比色)4、以A595nm为纵坐标，标准蛋白色质浓度为横坐标，绘制标准曲线。
（二）样品的测定1、样品的提取：称取植物材料0.2g左右于预冷的研钵中，加入2mL预冷的提取液，研成匀浆，转至10mL离心管中，用提取液冲洗研钵2次（每次1mL），转至离心管中，总体系4mL，此即为蛋白质提取液。
实验七-考马斯亮蓝G250法测定的蛋白质含量
实验七-考马斯亮蓝G250法测定的蛋白质含量实验目的本实验的目的是通过考马斯亮蓝G250法测定蛋白质的含量，并了解该方法的基本原理。
实验原理蛋白质含量的测定方法有很多，其中比较常用的是考马斯亮蓝G250法。
该方法的基本原理是：靶蛋白质与染料考马斯亮蓝G250反应生成蓝色沉淀，通过比色法测定沉淀的吸光度，即可计算出蛋白质的含量。
具体来说，该方法的操作步骤如下：1.将待测蛋白质样品制备成一定的浓度，并加入一定体积的考马斯亮蓝G250试剂。
2.在一定时间内使反应到达平衡，将反应液离心沉淀。
3.由于考马斯亮蓝G250和蛋白质的结合比较强，一般可以近似认为反应液中大多数考马斯亮蓝G250都与蛋白质结合在一起。
因此，剩余的考马斯亮蓝G250浓度可以通过测定上清液的吸光度得到。
4.根据标准曲线（一般为已知浓度的蛋白质样品的吸光度与浓度的对应关系），可以将上清液的吸光度转化为蛋白质的含量。
实验步骤实验前准备准备工具和试剂，包括：•96孔微孔板•分光光度计•移液器、吸头•加样器•蒸馏水•NaOH溶液（1mol/L）•BSA标准品（2mg/mL）实验操作1.准备5个稀释比例的BSA标准品，分别为0.1、0.2、0.5、1.0和2.0mg/mL。
2.将标准品和待测样品分别加入96孔板中，每个样品重复3次。
3.加入一定体积（如200μL）的考马斯亮蓝G250试剂，混匀。
4.在室温下暗置约5min，使反应充分发生。
5.离心沉淀至液面完全透明。
6.将上清液吸取到另一个96孔板中。
7.加入100μL NaOH溶液，混匀。
8.制备一条标准曲线，测量各标准品和待测样品的吸光度。
数据处理根据标准曲线计算待测样品中蛋白质的含量。
实验注意事项•操作时要注意洁净卫生，避免交叉污染。
•要精确控制试剂的使用量，避免误差。
•每项操作要根据标准程序认真进行，做到数据准确可靠。
实验结果分析通过考马斯亮蓝G250法测定了不同浓度的BSA标准品和待测样品中的蛋白质含量，得到了标准曲线和待测样品的吸光度值。
实验二 可溶性蛋白质含量的测定(考马斯亮蓝g-250法).
表-1 配制0～100μg/ml血清白蛋白液
管号
123456
100μg/ml牛血清蛋白量(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
蒸馏水量(ml)
1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0
蛋白质含量(mg)
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10
实验步骤
（2）0～1000μg/ml标准曲线的制作 另取6支试管，按表 28-2数据配制0～1000μg/ml牛血清白蛋白溶液各1ml。与 步骤（1）操作相同，绘出0～1000μg/ml的标准曲线。
实验目的
植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类， 测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标。在研究每 一种酶的作用时，常以比活（酶活力单位／mg蛋白）表 示酶活力大小及酶制剂纯度。因此，测定植物体内可溶性 蛋白质是研究酶活的一个重要项目。
实验原理
考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的 一种。考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色，当它与 蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在 465nm，后者在595nm。在一定蛋白质浓度范围内 （0～100μg/ml），蛋白质与色素结合物在595nm波 长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质 的定量测定。
Protein content ( g)
注意事项
1 由于取的组织不同，所以 OD值相 差较大。
2 研磨须充分，否则溶解后析光时所 得数据并不是1克植物量对应值。
3 标准溶液的测定实验组同时进行， 以免引起误差。
取植物叶片0.1-0.2剪碎，用磷酸缓冲液研磨，倒入 10ml 离心管中，定容到10 ml，10000 pm离心， 20min 得上清液作为待测样品。
实验1考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量
蛋白质含量的测定
微量凯氏定氮法 Folin-酚试剂法（Lowry法） 双缩脲法（Biuret法） 紫外光吸收法 考马斯亮蓝法（Bradford法）
▪ 实验类型——基础验证型
实验目的
掌握和学习考马斯亮蓝G-250染色法 测定蛋白质含量的基本方法。
五 思考题
测定蛋白质含量还有哪些方法， 测定原理有哪些不同？
移液枪的使用方法
量程的调节 枪头（吸液嘴）的装配 移液的方法 移液器的正确放置 维护保养时的注意事项
吊钩 手柄
移液控制及调节旋纽 吸/枪头推出器
数字显示器
枪杆
移液枪的结构
1.量程的调节 ！！看清量程再调节
千万不要将按钮旋出量程， 否则会卡住内部机械装置而损坏了移液枪。
➢ 吸量管上端标有“吹”字。将所量液体全部放出后，还需要吹出 残留于管尖的溶液。此类吸量管为“吹出式”，未标“吹”字的 吸量管，则不必吹出管尖的残留液体。(0.5ml以下的都要吹）
➢ 吸量管尖应接触受器内壁，但不应插入受器内的原有液体之中， 以免污染吸量管及试剂。
➢ 吸取血液、尿、组织样品、粘稠试剂或有颜色的吸量管，用后应 及时用自来水冲洗干净。如果吸取一般试剂的吸量管可不必马上 冲洗，待实验完毕后，用自来水冲洗干净，晾干备用。
/mL
0
10
蛋白质浓度
(μg/mL)
A595
3
4
5
6
7
0.2
0.4
0.6
0.8 1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
4.0
4.0
4.0
4.0 4.0
20
40
60
考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量
蛋白质含量测定(考马斯亮蓝G-250法)一、目的考马斯亮蓝(Coomassie brilliant blue) G-250法是比色法与色素法相结合的复合方法，由Bradford于1976年建立，具有简便快捷，灵敏度高，稳定性好等特点，是一种较好的蛋白质定量测定常用方法。
通过本实验学习应用该法测定蛋白质含量的原理，复习分光光度计的使用及标准曲线的绘制等基本实验技能。
二、原理考马斯亮蓝G-250是一种染料，游离态呈红色，与蛋白质结合后转变为青色。
在0~1000μg 范围内，蛋白质-色素结合物在595 nm下的吸光度与蛋白质含量正相关，可用比色法测定。
三、仪器、试剂和材料1．仪器设备：(具塞刻度)试管吸管分光光度计2．试剂(1) 标准蛋白质溶液称取100 mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100 ml，制成 1 mg/ml溶液。
(2) 考马斯亮蓝G-250蛋白试剂称取100 mg考马斯亮蓝G-250，溶于50 ml 95%乙醇中，加入85% (m/v)的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000 ml (此溶液在常温下可放置一个月)。
(3) 样品蛋白液(10~100 μg/ml)四、操作步骤1标准蛋白质含量(μg)为横坐标、吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。
2．样品中蛋白质含量的测定取2支(具塞)试管，分别准确加入0.l ml样品蛋白液，再各加5 ml考马斯亮蓝G-50试剂，充分混合，放置2min后，以标准曲线0号试管做参比，在595 nm波长下比色，记录吸光度。
五、结果处理根据所测样品提取液的平均吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量(μg/ml)六、思考题1．考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理是什么？还有哪些蛋白质定量法？2．如何正确使用分光光度计？。
考马斯亮蓝测定蛋白含量总结
一原理考马斯亮蓝G－250(GooMAssIe BrIllIAnT Blue G－250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝G－250在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nM，后者在595nM。
在一定蛋白质浓度范围内(1～100μg)，蛋白质与色素结合物在595nM波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝G－250结合在2Min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1H内保持稳定。
该反应快速灵敏(灵敏度比FolIn－酚法还高4倍)、易于操作、干扰物质少(考马斯亮蓝G－250和蛋白质通过范德华力结合，受蛋白质的特异性影响较小，除组蛋白外，其他不同种类蛋白质染色强度差异不大)，可测定微克级蛋白质含量，是一种比较好的蛋白质定量法。
但此方法也存在其缺点，考马斯亮蓝在蛋白质含量很高时线性关系偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有差异。
考马斯亮蓝G-250试剂呈色反应颜色稳定、灵敏度高，最低测试蛋白质量在1ug左右。
二试剂配置三步骤1破碎细菌提取蛋白液大肠杆菌表达外源蛋白，在超声破碎的时候，用含有1%triton-X-100的PBS悬浮，然后超声的效果较好，1%triton-X-100的作用还是很明显的，对其他的一些细菌同样起作用，比如链霉菌。
(30% Triton X-100的配制Triton X-100 28.2ml0.1mol/L PBS(pH=7.3)或0.05mol/l TBS(pH=7.4) 72.8ml配制方法取Triton X-100及PBS（或TBS）混合，置37℃～40℃水浴中2～3h，使其充分溶解混匀。
用前取该储备液稀释至所需浓度。
通常将30%稀释到1%。
)注意：在表达重组蛋白后超声波破碎细胞，采用冰浴，400w，破2s停1s，但是不一会就产生大量泡沫，影响了破碎功率，pbs和tris缓冲液都是这样，最后都是破碎不完全，而我的目的蛋白就在这些未破碎的细胞中。
实验 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
实验五考马斯亮蓝法测定蛋白质含量一、实验目的1.掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质含量的原理与方法2.熟练分光光度计的使用和操作方法。
二、实验原理考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种，它与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。
它在酸性溶液中呈棕红色，最大光吸收峰在465nm，当它与蛋白质结合形成复合物时，其最大吸收峰改变为595nm。
考马斯亮蓝G-250—蛋白质复合物呈蓝色，在一定范围内，595nm下光密度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质含量的测定。
考马斯亮蓝结合法是近年来发展起来的蛋白质定量测定法，本方法具有操作方便、快速、干扰因素少的特点。
离心机的使用说明： 1.要离心的离心管和管套要称重，重量不等时将水加在管套里。
2．离心管的放置是对角线放置，要求必须对称。
3. 先将离心机转速旋钮恢复到零刻度后，再定时间，定好时间后缓慢旋转转速旋钮，使离心机均匀的提速到预定转速。
分光光度计的使用说明： 1.接通电源开关，预热20min后，再选择须用的单色光波长。
2.放入已加入溶液的比色皿，盖上样品室盖，推动试样架拉手，使对照比色皿（溶液装入4／5高度，置第一格）置于光路上，调节100％透射比按钮，使吸光度值A=0.00。
3.推动试样架拉手，使样品比色皿置于光路上，读出吸光度值。
4.测量完毕，取出比色皿，洗净后置于乙醇溶液中浸泡脱色。
5.电源开关置于“关”，拔下电源插头。
三、试剂与器材：1. 试剂：（1）0.9％NaCl：9g NaCl溶解在1L的容量瓶中。
（2）标准蛋白质：称取50mg结晶牛血清蛋白定溶于50ml容量瓶里。
（3）染液：考马斯亮蓝G-250 0.5g，溶于250mL95%乙醇，再加入500mL85％(W／V)磷酸，保存于棕色瓶中，称为母液。
取150 mL然后加蒸馏水定容到1000mL，保存于棕色瓶中，备用。
2.器材：试管；吸管10mL、l5mL、lmL、0.1mL；722分光光度计四、操作方法1.标准曲线的制备取6支试管，按下表加入各试剂：以各管相应标准蛋白质含量（mg）为横坐标、A595为纵坐标，绘制标准曲线。
考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量
考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量专业班级：制药工程3班小组成员：梦娴敏林晓丝一、实验目的1、了解考马斯亮蓝法测定蛋白质的原理2、掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的操作步骤二、实验原理1、根据蛋白质的理化性质，有多种蛋白质定量方法。
考马斯亮蓝G-250是比色法与色素法相结合的复合方法。
考马斯亮蓝G-250是一种染料，在游离状态下呈棕红色，当与蛋白质结合后呈青蓝色。
在一定围，也就是蛋白质含量在0~1000ug围，蛋白质-色素结合物在595nm 下的吸光度与蛋白质含量成正比，所以可用比色法测定。
2、考马斯亮蓝G-250法有常量法和微量法两种。
三、仪器与试剂1、仪器：分析天平；铁架台；大漏斗；洗瓶；烧杯100m l×2、50m l×1；吸管10ml×2、5ml×1；胶头滴管；移液枪；离心管10个；722型分光光度计；容量瓶100ml×3；洗耳球×2；玻璃棒；记号笔。
2、试剂：（1）蒸馏水。
（2）标准蛋白质溶液：用移液枪吸取1ml浓度为1mg/ml标准蛋白质溶液，溶于蒸馏水并定容至10ml，制成0.1mg/ml的原液。
（3）考马斯亮蓝G-250(0.01%)染液:称取0.01g考马斯亮蓝G-250,溶于5ml 90%乙醇中，加入85%（m/v)的磷酸10ml,最后用蒸馏水定容至100ml（此溶液不宜久存，在常温中可放置1~2个月）；将定容好的染液过滤并装入棕色瓶中保存。
（4）样品液：用移液枪取1ml纯牛奶液体（经调查，市场上大部分纯牛奶中蛋白质的含量大致为每100ml中2.5~3.5g），用蒸馏水稍做稀释，然后转移至一号100ml的容量瓶中并定容至100ml;用10ml的吸量管吸取10ml一号容量瓶中的液体于二号100ml的容量瓶中，最后用蒸馏水定容至100ml，此时二号容量瓶中为待测样品液。
四、操作步骤1、0~100μg/ml标准曲线的制作：取8支离心管，编号后，按下表加入试剂，盖塞后，将各试管中的溶液纵向倒转混匀，室温静止5min后，以管一为空白对照，在595nm 下比色测定。
用考马斯亮蓝G250法测定蛋白质含量
⽤考马斯亮蓝G250法测定蛋⽩质含量⽤考马斯亮蓝G250法测定蛋⽩质含量呵呵你的⾃⼰检查⼀下你的仪器蛋⽩质浓度的测定(四)??考马斯亮蓝染⾊法⽬的要求学习考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)法测定蛋⽩质浓度的原理和⽅法。
实验原理考马斯亮蓝法测定蛋⽩质浓度，是利⽤蛋⽩质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋⽩浓度的快速、灵敏的⽅法。
考马斯亮蓝G―250存在着两种不同的颜⾊形式，红⾊和蓝⾊。
它和蛋⽩质通过范德华⼒结合，在⼀定蛋⽩质浓度范围内，蛋⽩质和染料结合符合⽐尔定律(Beer’s law)。
此染料与蛋⽩质结合后颜⾊有红⾊形式和蓝⾊形式，最⼤光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋⽩质的量。
蛋⽩质和染料结合是⼀个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最⼤光吸收，并可稳定1h，之后，蛋⽩质―染料复合物发⽣聚合并沉淀出来。
蛋⽩质―染料复合物具有很⾼的消光系数，使得在测定蛋⽩质浓度时灵敏度很⾼，在测定溶液中含蛋⽩质5µL/ml时就有0.275光吸收值的变化，⽐Lowry法灵敏4倍，测定范围为10,100µg蛋⽩质，微量测定法测定范围是1,10µg蛋⽩质。
此反应重复性好，精确度⾼，线性关系好。
标准曲线在蛋⽩质浓度较⼤时稍有弯曲，这是由于染料本⾝的两种颜⾊形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋⽩质结合⽽不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。
此⽅法⼲扰物少，研究表明:NaCl，KCl，MgCl2，⼄醇，(NH4)2SO4⽆⼲扰。
强碱缓冲液在测定中有⼀些颜⾊⼲扰，这可以⽤适当的缓冲液对照扣除其影响。
Tris，⼄酸，2―巯基⼄醇，蔗糖，⽢油，EDTA及微量的去污剂如TritonX―100，SDS，玻璃去污剂有少量颜⾊⼲扰，⽤适当的缓冲液对照很容易除掉。
但是，⼤量去污剂的存在对颜⾊影响太⼤⽽不易消除。
试剂与器材⼀、试剂考马斯亮蓝试剂:考马斯亮蓝G―250 100mg溶于50ml95%⼄醇中，加⼊100ml85%磷酸，⽤蒸馏⽔稀释⾄1000ml，滤纸过滤。
考马斯亮蓝法测蛋白质含量
考马斯亮蓝法测蛋白质含量实验概要bradford法是最常用的蛋白质快速定量方法。
coomassie brilliant blue g-250与蛋白质结合使染料的最大吸收峰由465 nm变为595 nm，溶液的颜色由棕色变为蓝色，595nm波长下吸光度值与蛋白含量成正比。
灵敏度比lowry法高4倍，与bca法相当。
反应迅速，2分钟即可达到平衡并在1小时内保持稳定。
操作简便，只需要一种反应试剂。
实验原理考马斯亮蓝(coomassie brilliant blue)法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。
这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。
这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰g-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰(lmax)的位置，由465 nm变为 595 nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。
通过测定595 nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。
主要试剂考马斯亮蓝g-250染色工作液： 10mg考马斯亮蓝g-250粉末溶于5ml 95%乙醇中，彻底溶解后，加入10ml 85%磷酸中，边加边搅拌（市售液体磷酸（h3po4）的质量分数≥85.0%，稠状透明液体，可直接使用，对皮肤有很强的腐蚀作用，建议使用5ml移液枪缓慢吸取使用）蒸馏水稀释至100ml。
后经滤纸过滤后储存于棕色试剂瓶中，避光保存。
长时间不用，可放置于4℃冰箱中保存1年，再次使用还需过滤，加入反应管前需要升至室温，否则虽不影响精度，但测得的od值较低，对仪器要求较高。
标准牛血清白蛋白（bsa）：精确称取4mg bsa粉末，溶于1ml 0.15mol/l nacl溶液配制成4mg/ml标准蛋白溶液，-20℃保存。
（如用1cm比色皿测定，建议精确称取40mg bsa 粉末，溶于10ml 0.15mol/l nacl溶液配制成4mg/ml标准蛋白溶液，分装成小管，-20℃保存。
考马斯亮蓝法法测定蛋白质含量
（优选）考马斯亮蓝法法测定 蛋白质含量
【实验原理】
考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于 染料结合法的一种。
考马斯亮蓝G250在酸性溶液中呈棕 红色，最大吸收峰在465nm；当它与蛋白 质通过范德华键结合成复合物时变为蓝色， 其最大吸收峰移至595nm，而且消光系数 更大。
考马斯亮蓝G-250在游离状态 下呈红色，最大光吸收在 465nm；当它与蛋白质结合 后变为青色，蛋白质-色素结 合物在595nm波长下有最大 光吸收。其光吸收值与蛋白质 含量成正比。
蛋白质与考马斯亮蓝G250的 结合十分迅速，约2min即可 反应完全，其复合物在1h内 保持稳定。
考马斯亮蓝R250与蛋白 质反应虽然比较缓慢， 但是可以被洗脱下去， 所以可以用来对电泳条 带染色。
在一定蛋白质浓度范围内 (1～1000µg/ml）,
考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在465nm；
蛋白质－染料复合物在595nm处的光吸收与蛋白 考马斯亮蓝试剂（mL）
蛋白质与考马斯亮蓝G250的结合十分迅速，约2min即可反应完全，其复合物在1h内保持稳定。 考马斯亮蓝法法测定蛋白质含量
质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。 当一束平行单色光(I0)照射有色溶液时，光的一部分被吸收，一部分透过溶液(I)
蛋白质与考马斯亮蓝G250的结合十分迅速，约2min即可反应完全，其复合物在1h内保持稳定。 由于蛋白质－染料复合物具有很高的消光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度（最低检出量为1µg）。 考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。 （优选）考马斯亮蓝法法测定蛋白质含量
当它与蛋白质通过范德华键结合成复合物时变为蓝色，其最大吸收峰移至595nm，而且消光系数更大。 可见光范围内波长和颜色的关系
考马斯亮蓝G250法测定蛋白质含量精
仪器和试剂
1．仪器：分析天平；吸管0.1ml×1、1ml×2、5ml×1； 试管10个；722型分光光度计；容量瓶100ml、1000ml 各一个；
2．试剂： （1）0.9% NaCl溶液； （2）标准蛋白质溶液：称取10mg 牛血清白蛋白，溶于 蒸馏水并定容至100ml，制成0.1mg/ml 的原液。 （3）考马斯亮蓝G-250（0.01%）染液：称取0.1g考马斯 亮蓝G-250，溶于50ml 90%乙醇中，加入85%（m/v） 的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容至1000ml。此溶液不 宜久存，在常温中可放置1-2个月。 （4）样品液：取牛血清白蛋白0.1mg/ml 的溶液，用 0.9% NaCl溶液稀释至一定浓度。
操作步骤
1．0~100μg／mL标准曲线的制作： 取6支试管，编号后，按下表加入试剂，
混匀，室温静置5min后，以管1为空白对照， 在595nm下比色测定。以标准蛋白质含量 （μg）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘出 标准曲线。
管号
123 4 56
蛋白质标准液 （ml）
0 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
0.9%NaCl溶液 1.0 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 （ml）
考马斯亮蓝染液 5 5 5 5 5 5
蛋白质含量（μg）
A595
2．样品中蛋白质含量的测定
另取两支干净的试管（做一重复），加 入合适浓度的待测样品，使其测定值在标 准曲线的范围内，测定方法同上，由样品 液的吸光度查标准曲线即可求出含量。
考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量
实验目的
了解考马斯亮蓝法测定蛋白质的原理 掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的操作
步骤
实验原理
考马斯亮蓝G250在酸性的溶液中游离状态 呈红褐色，与蛋白质结合后呈蓝色，其最 大吸收波长由465nm转变为595nm。在一定 的蛋白质浓度范围内，595nm处的光密度值 与蛋白质浓度成反比，可用比色法进行蛋 白质定量测定。
考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量
实验八考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量一实验目的学会用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量二实验原理考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区结合，这种结合具有高度的敏感性。
考马斯亮蓝G-250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色其最大吸收峰改为595nm，考马斯亮蓝G-250-复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感度。
在一定范围内，考马斯亮蓝G-250-复合物呈色后，在595nm下吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质浓度的测定。
三实验器材（1）旋涡混合器。
（2）试管1.5cm×15cm（×8）（3）吸管0.10ml（×1），0.50ml（×2），1.0ml（×2），2.0ml（×1），2.0ml（×1）。
（4）722型（或7220型）分光光度计。
（5）容量瓶1000ml（×1）。
（6）量筒100ml（×1）。
（7）电子分析天平。
四实验试剂1、9％NaCL溶液。
2、标准蛋白液；牛血清白蛋白（0.1mg/ml），准备称取牛血清白蛋白0.2g，用0.9%NaCl 溶液溶解并稀释至2000ml。
3、染液：考马斯亮蓝G250(0.01%),称取0.1g考马斯亮蓝G250溶于50ml95%乙醇中，再加入100ml浓磷酸，后加蒸馏水定容到1000ml。
4、样品液：取牛血清白蛋白（0.1mg/ml）溶液，用0.9%NaCl稀释至一定浓度。
五实验方法（一）标准曲线的制备1、取7支干净试管，按表15进行编号并加入试剂。
2、混匀，室温静置3min，以第1管为空白，于波长595nm处比色，读取吸光度，以吸光度为纵坐标，名标准液浓度（ug/ml）作为横坐标作图得标准曲线。
表15 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度——标准曲线的制备（二）样品的测定另取一支干净试管，加入样品液1.0ml及考马斯亮蓝染液4.0ml，混匀，室温静置3min，于波长595nm处比色，读取吸光度，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。
考马斯亮蓝 法测定蛋白质含量
二、Bradford法(一）、原理：考马斯亮蓝G250 ( CBB- G-250）与蛋白质结合后形成蓝色的化合物，在595nm有最大吸收峰，且蓝色的深浅与蛋白浓度成正比。
这是一种快速、准确、重复性好的蛋白质定量方法。
该方法快速、准确、干扰因素少。
CBB- G-250在2分钟内即可完全与蛋白结合，并在2小时内保持稳定，该反应几乎不受钠、钾等阳离子的干扰，更不受蔗糖等碳水化合物的干扰。
但较高浓度的十二烷基硫酸钠（Soldium dodecyl sulfate），Triton X－100等对其有干扰，此影响可通过选择适当的对照品来消除。
（二）器材及试剂1、器材A. 分光光度计B. 微量加样器C. 移液管、试管及试管架D. 坐标纸2. 试剂（1）考马斯亮蓝G-250溶液：称取CBB- G-250 100毫克溶于50 ml 95%(V/V)乙醇溶液中，然后加入100毫升85%（V/V）磷酸，最后加蒸馏水定容至1000毫升。
（2）0.14mol/L 氯化钠溶液（生理盐水）（3）标准蛋白质溶液（0.1mg/ml）：精确称取10.0毫克牛血清白蛋白，用生理盐水定容至100毫升。
(4) 血清样品(已稀释200倍)(5) 层析样品(三）、操作（标准曲线制作）：取7支试管按下表操作：混匀，室温放置5分钟，在595nm测定各管O.D值并以蛋白浓度为横坐标，以O.D 值为纵坐标绘制标准曲线．以Bradford法测定层析分离蛋白内的蛋白浓度取试管从层析样品中各取20.0ul，加入生理盐水20ul,最后加入考马斯亮蓝G-250溶液5.0ml，混匀，以595nm 波长测定二者光密度，在标准曲线上查出其蛋白浓度以上需要购买的试剂有：1、标准蛋白质即牛血清白蛋白。
教学内容：实验八考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质含量【实验目的】1. 掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质的原理与方法2. 熟练分光光度计的使用和操作方法【实验原理】此方法是1976年Bradform建立。
考马斯亮蓝法测蛋白质
考马斯亮蓝法测蛋白质含量一、原理考马斯亮蓝G-250（Coomassie G-250）是一种甲基取代的三苯基甲烷，分子中磺酸基的蓝色染料，在465nm处有最大吸收值。
考马斯亮蓝G-250能与蛋白质通过范得华相互作用形成蛋白质—考马斯亮蓝复合物蓝色溶液，引起该染料的最大吸收λmax的位置发生红移，在595nm处有最大吸收值。
由于蛋白质—考马斯亮蓝复合物在595nm 处的光吸收远高于考马斯亮蓝在465nm处的光吸收，因此，可大大地提高蛋白质的测定灵敏度。
蛋白质—考马斯亮蓝复合物溶液颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。
利用溶液颜色的差异进行比色测定，适合于蛋白质类的定量分析，尤其适合于稀有蛋白质的微量分析。
考马斯亮蓝G-250试剂呈色反应颜色稳定、灵敏度高，最低测试蛋白质量在1ug左右。
二、操作步骤1. 标准曲线测定法分别取六只试管，其中一只加入1.0ml蒸馏水做空白，5只分别加入不同体积的浓度为100ug/ml牛血清清蛋白标准液，补充水到1.0ml。
然后每只试管加入5.0ml考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀放置5min，在紫外-可见分光光度计595nm处测定吸光值。
以A595吸光值为纵坐标，牛血清清蛋白的ug数量为横坐标绘制标准曲线。
具体操作见下表。
蛋白质标准曲线测定加样在标准蛋白质测定时，为了减小误差，每一个浓度的蛋白质做3支平行管。
3.试剂配置a.牛血清清蛋白标准液结晶牛血清清蛋白或酪蛋白，预先经微量凯氏定氮法标定该蛋白质的百分含量或者根据牛血清清蛋白的消光系数是 6.6来计算其百分含量。
然后根据该蛋白的纯度配置成浓度为100 ug/ml的蛋白溶液。
b.考马斯亮兰G—250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G—250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入100ml 85%的磷酸，用水稀释至1升三、数据及绘图。
考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量
考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量专业班级：制药工程3班小组成员：李梦娴李敏林晓丝一、实验目的1、了解考马斯亮蓝法测定蛋白质的原理2、掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的操作步骤二、实验原理1、根据蛋白质的理化性质，有多种蛋白质定量方法。
考马斯亮蓝G-250是比色法与色素法相结合的复合方法。
考马斯亮蓝G-250是一种染料，在游离状态下呈棕红色，当与蛋白质结合后呈青蓝色。
在一定范围内，也就是蛋白质含量在0~1000ug范围内，蛋白质-色素结合物在595nm下的吸光度与蛋白质含量成正比，所以可用比色法测定。
2、考马斯亮蓝G-250法有常量法和微量法两种。
三、仪器与试剂1、仪器：分析天平；铁架台；大漏斗；洗瓶；烧杯100m l×2、50m l×1；吸管10ml×2、5ml×1；胶头滴管；移液枪；离心管10个；722型分光光度计；容量瓶100ml×3；洗耳球×2；玻璃棒；记号笔。
2、试剂：〔1〕蒸馏水。
〔2〕标准蛋白质溶液：用移液枪吸取1ml浓度为1mg/ml标准蛋白质溶液，溶于蒸馏水并定容至10ml，制成0.1mg/ml的原液。
〔3〕考马斯亮蓝G-250(0.01%)染液:称取0.01g考马斯亮蓝G-250,溶于5ml 90%乙醇中，加入85%〔m/v)的磷酸10ml,最后用蒸馏水定容至100ml〔此溶液不宜久存，在常温中可放置1~2个月〕；将定容好的染液过滤并装入棕色瓶中保存。
〔4〕样品液：用移液枪取1ml纯牛奶液体〔经调查，市场上大部分纯牛奶中蛋白质的含量大致为每100ml中2.5~3.5g〕，用蒸馏水稍做稀释，然后转移至一号100ml的容量瓶中并定容至100ml;用10ml的吸量管吸取10ml一号容量瓶中的液体于二号100ml的容量瓶中，最后用蒸馏水定容至100ml，此时二号容量瓶中为待测样品液。
四、操作步骤1、0~100μg/ml标准曲线的制作：取8支离心管，编号后，按下表加入试剂，盖塞后，将各试管中的溶液纵向倒转混匀，室温静止5min后，以管一为空白对照，在595nm 下比色测定。
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五、结果处理
根据所测样品提取液的平均吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量(μg/ml)
六、思考题
1．考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理是什么？还有哪些蛋白质定量法？
2．如何正确使用分光光度计？
二、原理
考马斯亮蓝G-250是一种染料，游离态呈红色，与蛋白质结合后转变为青色。在0~1000μg范围内，蛋白质-色素结合物在595 nm下的吸光度与蛋白质含量正相关，可用比色法测定。
三、仪器、试剂和材料
1．仪器设备： (具塞刻度)试管 吸管 分光光度计
2．试剂
(1) 标准蛋白质溶液 称取100 mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100 ml，制成 1 mg/ml溶液。
蛋白质含量测定(考马斯亮蓝G-250法)
一、目的
考马斯亮蓝(Coomassie brilliant blue) G-250法是比色法与色素法相结合的复合方法，由Bradford于1976年建立，具有简便快捷，灵敏度高，稳定性好等特点，是测定蛋白质含量的原理，复习分光光度计的使用及标准曲线的绘制等基本实验技能。
各管充分混匀。放置2min后在595 nm波长下比色测定(比色应在 l h内完成)。以标准蛋白质含量(μg)为横坐标、吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。
2．样品中蛋白质含量的测定
取2支(具塞)试管，分别准确加入0.l ml样品蛋白液，再各加5 ml考马斯亮蓝G-50试剂，充分混合，放置2min后，以标准曲线0号试管做参比，在595 nm波长下比色，记录吸光度。
(2) 考马斯亮蓝G-250蛋白试剂 称取100 mg考马斯亮蓝G-250，溶于50 ml 95%乙醇中，加入 85% (m/v)的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到 1000 ml (此溶液在常温下可放置一个月)。
(3) 样品蛋白液(10~100 μg/ml)
四、操作步骤
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