石斛内生菌的筛选和培养优化
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用少 量氯仿溶解后，得到石斛总生物碱，备用¨１。
３．２菌株发酵液的薄层层析（ＴＬＣ）检测 将分离 得到的菌株分别接种发酵培养基中３０℃，１８０ ｒ·ｒａｉｎ“振荡培养。培养２４和４８ ｈ分别取２０ ｍＬ发 酵液８ ０００ ｒ·ｒａｉｎ“离心１０ ｒａｉｎ，将发酵液上清用氨 水碱化后再用等体积氯仿萃取，氯仿蒸发后得浸膏。 以少量氯仿溶解后，用微量注射器点于硅胶薄层层 析板上，以空白发酵培养基提取物和石斛总生物碱 为对照。展开剂为正丁醇：冰醋酸：水（４：ｌ：５）的上 层液，显色剂为改良碘化铋钾试液。 ４培养条件的优化 ４．１培养方法将斜面培养物接种到液体马铃薯 培养基在３０℃培养１２ ｈ作为种子液，按５％体积转 接３０ ｍＬ液体培养基后在３０℃空气摇床培养２ ｄ， 转速１８０ ｒ·ｍｉｎ～；每个试验均做３个平行样品，最 后结果取均值。 ４．２液体发酵培养基中氨源的确定 分别选用蛋 白胨、亚硝酸钠、硫酸铵以及蛋白胨＋硫酸铵 （１：１），酵母粉＋硫酸铵（１：１）为氮源，试验浓度为 ０．５％，其他组分同液体马铃薯培养基。 ４．３液体发酵培养基中碳源的确定 分别选用葡 萄糖、果糖、蔗糖、可溶性淀粉为碳源，实验浓度为 ２％，氮源选择氮源优化后的最佳者，其他组分同液 体马铃薯培养基。
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１空白液体马铃薯培养基；２发酵液粗提总生物碱的ＴＬＣ比较
生垦堑堑盘查！塑！生箜！！鲞筮！塑 表２菌株ＣＰＵ００２９的生理生化试验
实验名称 过氧化氢酶 厌氧生长 甲基红试验 ｖ．Ｐ反应 Ｖ．Ｐ中的ｐＨ值 卵磷脂酶 耐盐生长 淀粉水解 枸橼酸盐利用 苯丙氨酸脱氨 酪氨酸分解
３最佳培养条件 ３．１ 氦源ＣＰＵ００２９不能利用无机氮源亚硝酸钠 和硫酸铵生长；但能利用有机氮源或复合氮源生长 并合成生物碱，并且以蛋白胨＋硫酸铵（１：１）为氮 源发酵时生物碱的产量明显高于以其他氮源发酵时 的产量。结果见表３。
表３有机氮源的优化
３．２碳源 ＣＰＵ００２９对碳源的利用相当广泛，从生 物碱产量的角度考虑选择葡萄糖最佳。结果见表４。 表４碳源的优化
［关键词］ 石斛；植物内生菌；次生代谢产物；培养优化 ［中图分类号】Ｒ２８２．７１；Ｒ９１５．１３ ［文献标识码］Ａ ［文章编号】１００３—３７３４（２００８）０９—０７５３—０５
Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｐｔｉｍｕｍ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｐｈｙｔｅｓ ｉｎ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｎｏｂｉｌｅ Ｌｉｎｄｌ
一７５４一
万方数据
生垦堑垫苤查！塑！笙箜！！鲞笙！塑 ４．４液体发酵培养基中碳氮比的确定 采用双因 素三水平的正交试验，如表１。
表１碳氮比正交试验表
４．５不同微量元素对生物碱产量的影响 本实验 考虑的无机离子有Ｍｇ“，Ｍｎ２＋和Ｆｅ３＋等，碳氮源选 择优化后的最佳者，考察的对应无机盐浓度分别为 ０．５％硫酸镁、０．１％氯化锰和０，ｌ％三氯化铁，其他 组分同液体马铃薯培养基。 ５ 其他发酵条件的优化 ５．１最佳初始ｐＨ 初始ｐＨ分别选择７．５，７．０， ６．５，６．０，５．５进行实验。 ５．２最佳装液量分别取３０，５０，８０，１００和１２０ ｍＬ 培养基装入２５０ ｍＬ三角瓶中，按５％接种培养。 ５．３最佳发酵温度 温度分别设为２５，２８，３０，３２ 和３５℃进行实验。 ５．４最佳发酵时间 在２５０ ｍＬ的三角烧瓶中装入 已经确定的最佳发酵培养基并接人菌种，进行培养， 分别于不同生长阶段在６００ ａｍ波长处测定菌液的 吸收度（稀释５倍）并提取测定生物碱含量。 ５．５ 确定最佳接种量 分别按２％，４％，６％，８％ 和１０％的比例接种种子液后进行培养。 ６生物碱含量测定
３．３碳氮比 氮源的浓度过高，不利于生物碱的产 生，可能是因为营养丰富不利于次生代谢产物的积 累。因此确定碳源、氮源的浓度分别为２％和０．５％。 结果见表５。
表５碳氮比的确定
Ａ。：。
３．４ 微量元素 Ｍ９２＋和Ｍｎ２＋对生物碱的产量有 显著影响，而Ｆｅ３＋影响不大，故确定添加ＭｇＳＯ。和 ＭｎＣＩ：，而不必添加ＦｅＣＩ，。结果见表６。
万方数据
用，因而近年来受到了全世界的广泛关注并取得了 极大进展。本实验从新鲜石斛外植体中筛选分离得 到一株可能产与石斛相同次生代谢产物的内生菌 ＣＰＵ００２９，并对其培养条件进行初步优化，以期提高 单位发酵液中次生代谢产物的含量。
材料与方法
ｌ 实验材料 １．１ 供试材料与试剂 野生石斛假鳞茎和叶片，由 南京金陵药业提供。０．２ ｔｏｏｌ·Ｌ～ｐＨ值４．５邻苯二 甲酸氢钾缓冲液：在０．２ ｔｏｏｌ·Ｌ～ｐＨ值４．０的邻苯 二甲酸氢钾中滴加０．２ ｔｏｏｌ·Ｌ。１ ＮａＯＨ调节ｐＨ值至 ４．５。０．０４％溴甲酚绿试液：４０ ｍｇ溴甲酚绿溶解于 １００ ｍＬ上述缓冲液。０．０１ ｔｏｏｌ·Ｌ。１ ＮａＯＨ／无水乙 醇：０．０４ ｇ ＮａＯＨ溶于１００ ｍＬ无水乙醇。
一７５３—
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１．２培养基斜面和分离培养基为固体马铃薯培 养基。种子培养基、发酵培养基和原始液体培养基 均为液体马铃薯培养基＂１。 ２石斛内生菌的分离
鲜石斛假鳞茎和叶片用自来水洗净，经无菌水冲 洗后用无菌滤纸吸干水分。在常规无菌操作下，先用 ７５％乙醇浸泡ｌ ｒａｉｎ，无菌水冲洗３次，滤纸吸干水 分；０．１％的升汞浸泡８ ｒａｉｎ，无菌水冲洗５次，滤纸吸 干水分。用无菌解剖刀将已表面消毒的石斛假鳞茎 和叶片切块：假鳞茎沿剖面切成２—４ ｍｍ厚的片段， 叶片切成５ ｍｍ×５ ｍｍ的方块，置于分离培养基平板 上，在３０℃培养２—５ ｄ。另将表面消毒的植物组织 不经切割，直接放置平板上相同条件培养，检验该法 表面消毒是否彻底。待平板长出菌落或菌苔后，平板 划线纯化，直至得到单菌落，用斜面保存备用【６１。 ３发酵液的初步鉴定 ３．１石斛总生物碱的制备将石斛假鳞茎阴干，取 ２ ｇ剪碎后置于锥形瓶中，用氨水浸润３０ ｍｉｎ，加入 氯仿２０ ｍＬ，超声振荡提取２次（各２０ ｍｉｎ）；将氯仿 层合并后用脱脂棉过滤，将氯仿蒸发后得到浸膏，再
石斛内生茵的筛选和培养优化
廖晨阳，吕炜锋，姚文兵 （中国药科大学生命科学与技术学院，南京２１０００９）
［摘要】 目的：筛选石斛假鳞茎中产生物碱的内生菌并通过培养优化提高次生代谢产物的含量。方 法：从新鲜石斛中分离生物碱产生菌，并对其发酵条件进行研究。结果：筛选到一株产生物碱的内生细菌，属 于蜡状芽胞杆菌。初步确定了最适的发酵培养基组成为：去皮土豆２０％，葡萄糖２％，蛋白胨０．２５％，硫酸 铵０．２５％，磷酸二氢钾０．１％，硫酸镁０．０５％，氯化锰０．０１％，ｐＨ值６．５；最适的发酵条件为：接种量６％一８％， 温度２８—３０℃，培养时间４８ ｈ。结论：通过初步优化，单位体积发酵液的生物碱含量较原始条件大幅提高。
培养反应
＋ ＋
＋ ５．６
５％ＮａＣＩ不生长
＋
＋
＋表示能够正常生长；一表示不能生长
２菌种培养特征 菌株ＣＰＵ００２９，属于Ｇ＋性大杆菌，宽度在ｌ／ｘｍ
以上，呈链状排列在肉汤中生长混浊，有明显菌膜或 壁环；在固体ＰＤＡ培养基上生成的菌落不透明，灰 白色，表面粗糙，微有褶皱，边缘毛玻璃状或融蜡状。 生理生化实验见表２，表明该菌为蜡状芽胞杆菌。
ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｎｏｂｉｌｅ Ｌｉｎｄｌ，ａｎｄ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ａｌｓｏ ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ａ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｂａ—
ｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ，ｗｈｉｃｈ ｐｒｏｂａｂｌｙ ｐｒｏｄｕｃｅ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ａｓ ｔｈｅ ｈｏｓｔｓ ｄｏ．Ｉｔ ｗａｓ ｐｒｏｖｅｄ ｔｈａｔ
ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ａｌｋａｌｏｉｄｓ ｗｅｒｅ ｔｈｅ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐｏｔａｔｏ ｍｅｄｉｕｍ ｗｈｉｃｈ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ２％
ｇｌｕｃｏｓｅ，０．２５％ｔｒｙｐｔｏｎｅ，０．２５％ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ，０．１％ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，０．０５％ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ，ａｎｄ ０．０１％ｍａｎｇａｎｅｓｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ａｔ ｐＨ ６．５；ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ １２ ｈ’ｓｅｅｄ－ａｇｅ ａｎｄ ６％一８％ｏｆ ｉｎｏｃｕｌａ；ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ ｆｏｒ ４８ ｈ ａｔ ２８—３０℃．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ。ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ａｌｋａｌｏｉｄｓ ｉｎｃｒｅａ— ｓｅｓ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｃｕｌｔｕｒａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ．
采用酸性染料法将发酵液的氯仿提取浸膏用氯 仿稀释至１０ ｍＬ，加入邻苯二甲酸氢钾缓冲液５ ｍＬ， 溴甲酚绿试液２．０ ｍＬ，震摇３ ｍｉｎ，静置３０ ｍｉｎ。将 氯仿层过滤，取滤液５ ｍＬ，加入０．０ｌ ｔｏｏｌ·Ｌ。１ ＮａＯＨ／无水乙醇溶液１ ｍＬ，混匀后测６２０ ａｍ波长处 的吸收度；另用１０ ｍＬ氯仿同上操作，作为空白¨１。
植物内生菌（ｐｌａｎｔ ｅｎｄｏｐｈｙｔｅ）是指那些在其生 活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种 组织和器官内部的微生物¨。。自从１９９３年从红豆 杉韧皮部分离到紫杉醇产生菌以来，不断发现有内 生菌能够产生与宿主（尤其是药用植物）相同或类 似的化合物，如从川八角莲、桃儿七等植株中分离到 产长春新碱和鬼臼毒素类似物的内生真菌等¨一１。 由于植物内生菌在自然界中具有重要的生态学作
表６微量元素的影响
万方数据
．－——７５５—－——
曼！！！！苎！！！堡坐坚堕！！旦里墅！塑！！∑！！：！！塑！：１ ４其他培养条件 ４．１ 初始ｐＨ 从图２可知，初始ｐＨ值对发酵最 终ｐＨ值和生物碱产量影响不大；初始ｐＨ值为６．５ 时最佳。
［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｎｏｂｉｌｅ Ｌｉｎｄｌ；ｐｌａｎｔ ｅｎｄｏｐｈｙｔｅｓ；ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ；ｏｐｔｉｍｕｍ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
石斛（Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｎｏｂｉｌｅ Ｌｉｎｄｌ）是中国传统中 药，应用历史悠久。现代药理研究表明，石斛具有抗 肿瘤、抗衰老、增强机体免疫力、扩张血管及抗血小 板凝集等作用，因此在临床上及中药复方中被广泛 应用…。由于多年来的掠夺性采挖和无序开发，野 生石斛已经濒临灭绝，寻找新的、可再生的石斛替代 资源成为必然。
结
果
１发酵液的初步鉴定 共分离得到１６个菌株，其中真菌２株，细菌１４
株。经ＴＬＣ检测，菌株ＣＰＵ００２９的发酵液提取物与 石斛总生物碱有显色相同、迁移率相当的层析斑点， 扫描结果见图１。发酵液的氯仿提取物经ＴＬＣ检 测，与石斛总生物碱有显色相同、迁移率相当的层析 斑点。石斛总生物碱有３个生物碱斑点，相对迁移 率（Ｒ，）分别为０．４０３，０．４７４和０．５７９；该菌株的发 酵液提取物中有一生物碱斑点，Ｒ，为０．４７４。
ＬＩＡＯ Ｃｈｅｎ—ｙａｎｇ，ＬＵ Ｗｅｉ—ｆｅｎｇ，ＹＡＯ Ｗｅｎ－ｂｉｎｇ （Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌ咖Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｎｉ＠，Ｎａｎｊｉｎｇ ２ １ ０００９，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］０ｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｓｅｌｅｃｔ ｔｈｅ ｅｎｄｏｐｈｙｔｅｓ ｉｎ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｎｏｂｉｌｅ Ｌｉｎｄｌ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ａｌｋａ— ｌｏｉｄｓ ｂｙ ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ｅｎｄｏｐｈｙｔｅｓ ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ ｐｒｏｄｕｃｅ ａｌｋａｌｏｉｄｓ ｗａｓ
３．２菌株发酵液的薄层层析（ＴＬＣ）检测 将分离 得到的菌株分别接种发酵培养基中３０℃，１８０ ｒ·ｒａｉｎ“振荡培养。培养２４和４８ ｈ分别取２０ ｍＬ发 酵液８ ０００ ｒ·ｒａｉｎ“离心１０ ｒａｉｎ，将发酵液上清用氨 水碱化后再用等体积氯仿萃取，氯仿蒸发后得浸膏。 以少量氯仿溶解后，用微量注射器点于硅胶薄层层 析板上，以空白发酵培养基提取物和石斛总生物碱 为对照。展开剂为正丁醇：冰醋酸：水（４：ｌ：５）的上 层液，显色剂为改良碘化铋钾试液。 ４培养条件的优化 ４．１培养方法将斜面培养物接种到液体马铃薯 培养基在３０℃培养１２ ｈ作为种子液，按５％体积转 接３０ ｍＬ液体培养基后在３０℃空气摇床培养２ ｄ， 转速１８０ ｒ·ｍｉｎ～；每个试验均做３个平行样品，最 后结果取均值。 ４．２液体发酵培养基中氨源的确定 分别选用蛋 白胨、亚硝酸钠、硫酸铵以及蛋白胨＋硫酸铵 （１：１），酵母粉＋硫酸铵（１：１）为氮源，试验浓度为 ０．５％，其他组分同液体马铃薯培养基。 ４．３液体发酵培养基中碳源的确定 分别选用葡 萄糖、果糖、蔗糖、可溶性淀粉为碳源，实验浓度为 ２％，氮源选择氮源优化后的最佳者，其他组分同液 体马铃薯培养基。
￡！！！！堕』！！巴！！！！塑！！旦型ｇ！！！Ｑ！！！！！：！！塑！：１
１空白液体马铃薯培养基；２发酵液粗提总生物碱的ＴＬＣ比较
生垦堑堑盘查！塑！生箜！！鲞筮！塑 表２菌株ＣＰＵ００２９的生理生化试验
实验名称 过氧化氢酶 厌氧生长 甲基红试验 ｖ．Ｐ反应 Ｖ．Ｐ中的ｐＨ值 卵磷脂酶 耐盐生长 淀粉水解 枸橼酸盐利用 苯丙氨酸脱氨 酪氨酸分解
３最佳培养条件 ３．１ 氦源ＣＰＵ００２９不能利用无机氮源亚硝酸钠 和硫酸铵生长；但能利用有机氮源或复合氮源生长 并合成生物碱，并且以蛋白胨＋硫酸铵（１：１）为氮 源发酵时生物碱的产量明显高于以其他氮源发酵时 的产量。结果见表３。
表３有机氮源的优化
３．２碳源 ＣＰＵ００２９对碳源的利用相当广泛，从生 物碱产量的角度考虑选择葡萄糖最佳。结果见表４。 表４碳源的优化
［关键词］ 石斛；植物内生菌；次生代谢产物；培养优化 ［中图分类号】Ｒ２８２．７１；Ｒ９１５．１３ ［文献标识码］Ａ ［文章编号】１００３—３７３４（２００８）０９—０７５３—０５
Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｐｔｉｍｕｍ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｐｈｙｔｅｓ ｉｎ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｎｏｂｉｌｅ Ｌｉｎｄｌ
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万方数据
生垦堑垫苤查！塑！笙箜！！鲞笙！塑 ４．４液体发酵培养基中碳氮比的确定 采用双因 素三水平的正交试验，如表１。
表１碳氮比正交试验表
４．５不同微量元素对生物碱产量的影响 本实验 考虑的无机离子有Ｍｇ“，Ｍｎ２＋和Ｆｅ３＋等，碳氮源选 择优化后的最佳者，考察的对应无机盐浓度分别为 ０．５％硫酸镁、０．１％氯化锰和０，ｌ％三氯化铁，其他 组分同液体马铃薯培养基。 ５ 其他发酵条件的优化 ５．１最佳初始ｐＨ 初始ｐＨ分别选择７．５，７．０， ６．５，６．０，５．５进行实验。 ５．２最佳装液量分别取３０，５０，８０，１００和１２０ ｍＬ 培养基装入２５０ ｍＬ三角瓶中，按５％接种培养。 ５．３最佳发酵温度 温度分别设为２５，２８，３０，３２ 和３５℃进行实验。 ５．４最佳发酵时间 在２５０ ｍＬ的三角烧瓶中装入 已经确定的最佳发酵培养基并接人菌种，进行培养， 分别于不同生长阶段在６００ ａｍ波长处测定菌液的 吸收度（稀释５倍）并提取测定生物碱含量。 ５．５ 确定最佳接种量 分别按２％，４％，６％，８％ 和１０％的比例接种种子液后进行培养。 ６生物碱含量测定
３．３碳氮比 氮源的浓度过高，不利于生物碱的产 生，可能是因为营养丰富不利于次生代谢产物的积 累。因此确定碳源、氮源的浓度分别为２％和０．５％。 结果见表５。
表５碳氮比的确定
Ａ。：。
３．４ 微量元素 Ｍ９２＋和Ｍｎ２＋对生物碱的产量有 显著影响，而Ｆｅ３＋影响不大，故确定添加ＭｇＳＯ。和 ＭｎＣＩ：，而不必添加ＦｅＣＩ，。结果见表６。
万方数据
用，因而近年来受到了全世界的广泛关注并取得了 极大进展。本实验从新鲜石斛外植体中筛选分离得 到一株可能产与石斛相同次生代谢产物的内生菌 ＣＰＵ００２９，并对其培养条件进行初步优化，以期提高 单位发酵液中次生代谢产物的含量。
材料与方法
ｌ 实验材料 １．１ 供试材料与试剂 野生石斛假鳞茎和叶片，由 南京金陵药业提供。０．２ ｔｏｏｌ·Ｌ～ｐＨ值４．５邻苯二 甲酸氢钾缓冲液：在０．２ ｔｏｏｌ·Ｌ～ｐＨ值４．０的邻苯 二甲酸氢钾中滴加０．２ ｔｏｏｌ·Ｌ。１ ＮａＯＨ调节ｐＨ值至 ４．５。０．０４％溴甲酚绿试液：４０ ｍｇ溴甲酚绿溶解于 １００ ｍＬ上述缓冲液。０．０１ ｔｏｏｌ·Ｌ。１ ＮａＯＨ／无水乙 醇：０．０４ ｇ ＮａＯＨ溶于１００ ｍＬ无水乙醇。
一７５３—
鱼！！！！竺』！！翌型型塑！！望竺ｇ！！塑！：！！！：！！塑！：１
１．２培养基斜面和分离培养基为固体马铃薯培 养基。种子培养基、发酵培养基和原始液体培养基 均为液体马铃薯培养基＂１。 ２石斛内生菌的分离
鲜石斛假鳞茎和叶片用自来水洗净，经无菌水冲 洗后用无菌滤纸吸干水分。在常规无菌操作下，先用 ７５％乙醇浸泡ｌ ｒａｉｎ，无菌水冲洗３次，滤纸吸干水 分；０．１％的升汞浸泡８ ｒａｉｎ，无菌水冲洗５次，滤纸吸 干水分。用无菌解剖刀将已表面消毒的石斛假鳞茎 和叶片切块：假鳞茎沿剖面切成２—４ ｍｍ厚的片段， 叶片切成５ ｍｍ×５ ｍｍ的方块，置于分离培养基平板 上，在３０℃培养２—５ ｄ。另将表面消毒的植物组织 不经切割，直接放置平板上相同条件培养，检验该法 表面消毒是否彻底。待平板长出菌落或菌苔后，平板 划线纯化，直至得到单菌落，用斜面保存备用【６１。 ３发酵液的初步鉴定 ３．１石斛总生物碱的制备将石斛假鳞茎阴干，取 ２ ｇ剪碎后置于锥形瓶中，用氨水浸润３０ ｍｉｎ，加入 氯仿２０ ｍＬ，超声振荡提取２次（各２０ ｍｉｎ）；将氯仿 层合并后用脱脂棉过滤，将氯仿蒸发后得到浸膏，再
石斛内生茵的筛选和培养优化
廖晨阳，吕炜锋，姚文兵 （中国药科大学生命科学与技术学院，南京２１０００９）
［摘要】 目的：筛选石斛假鳞茎中产生物碱的内生菌并通过培养优化提高次生代谢产物的含量。方 法：从新鲜石斛中分离生物碱产生菌，并对其发酵条件进行研究。结果：筛选到一株产生物碱的内生细菌，属 于蜡状芽胞杆菌。初步确定了最适的发酵培养基组成为：去皮土豆２０％，葡萄糖２％，蛋白胨０．２５％，硫酸 铵０．２５％，磷酸二氢钾０．１％，硫酸镁０．０５％，氯化锰０．０１％，ｐＨ值６．５；最适的发酵条件为：接种量６％一８％， 温度２８—３０℃，培养时间４８ ｈ。结论：通过初步优化，单位体积发酵液的生物碱含量较原始条件大幅提高。
培养反应
＋ ＋
＋ ５．６
５％ＮａＣＩ不生长
＋
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＋表示能够正常生长；一表示不能生长
２菌种培养特征 菌株ＣＰＵ００２９，属于Ｇ＋性大杆菌，宽度在ｌ／ｘｍ
以上，呈链状排列在肉汤中生长混浊，有明显菌膜或 壁环；在固体ＰＤＡ培养基上生成的菌落不透明，灰 白色，表面粗糙，微有褶皱，边缘毛玻璃状或融蜡状。 生理生化实验见表２，表明该菌为蜡状芽胞杆菌。
ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｎｏｂｉｌｅ Ｌｉｎｄｌ，ａｎｄ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ａｌｓｏ ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ａ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｂａ—
ｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ，ｗｈｉｃｈ ｐｒｏｂａｂｌｙ ｐｒｏｄｕｃｅ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ａｓ ｔｈｅ ｈｏｓｔｓ ｄｏ．Ｉｔ ｗａｓ ｐｒｏｖｅｄ ｔｈａｔ
ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ａｌｋａｌｏｉｄｓ ｗｅｒｅ ｔｈｅ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐｏｔａｔｏ ｍｅｄｉｕｍ ｗｈｉｃｈ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ２％
ｇｌｕｃｏｓｅ，０．２５％ｔｒｙｐｔｏｎｅ，０．２５％ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ，０．１％ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，０．０５％ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ，ａｎｄ ０．０１％ｍａｎｇａｎｅｓｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ａｔ ｐＨ ６．５；ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ １２ ｈ’ｓｅｅｄ－ａｇｅ ａｎｄ ６％一８％ｏｆ ｉｎｏｃｕｌａ；ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ ｆｏｒ ４８ ｈ ａｔ ２８—３０℃．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ。ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ａｌｋａｌｏｉｄｓ ｉｎｃｒｅａ— ｓｅｓ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｃｕｌｔｕｒａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ．
采用酸性染料法将发酵液的氯仿提取浸膏用氯 仿稀释至１０ ｍＬ，加入邻苯二甲酸氢钾缓冲液５ ｍＬ， 溴甲酚绿试液２．０ ｍＬ，震摇３ ｍｉｎ，静置３０ ｍｉｎ。将 氯仿层过滤，取滤液５ ｍＬ，加入０．０ｌ ｔｏｏｌ·Ｌ。１ ＮａＯＨ／无水乙醇溶液１ ｍＬ，混匀后测６２０ ａｍ波长处 的吸收度；另用１０ ｍＬ氯仿同上操作，作为空白¨１。
植物内生菌（ｐｌａｎｔ ｅｎｄｏｐｈｙｔｅ）是指那些在其生 活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种 组织和器官内部的微生物¨。。自从１９９３年从红豆 杉韧皮部分离到紫杉醇产生菌以来，不断发现有内 生菌能够产生与宿主（尤其是药用植物）相同或类 似的化合物，如从川八角莲、桃儿七等植株中分离到 产长春新碱和鬼臼毒素类似物的内生真菌等¨一１。 由于植物内生菌在自然界中具有重要的生态学作
表６微量元素的影响
万方数据
．－——７５５—－——
曼！！！！苎！！！堡坐坚堕！！旦里墅！塑！！∑！！：！！塑！：１ ４其他培养条件 ４．１ 初始ｐＨ 从图２可知，初始ｐＨ值对发酵最 终ｐＨ值和生物碱产量影响不大；初始ｐＨ值为６．５ 时最佳。
［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｎｏｂｉｌｅ Ｌｉｎｄｌ；ｐｌａｎｔ ｅｎｄｏｐｈｙｔｅｓ；ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ；ｏｐｔｉｍｕｍ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
石斛（Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｎｏｂｉｌｅ Ｌｉｎｄｌ）是中国传统中 药，应用历史悠久。现代药理研究表明，石斛具有抗 肿瘤、抗衰老、增强机体免疫力、扩张血管及抗血小 板凝集等作用，因此在临床上及中药复方中被广泛 应用…。由于多年来的掠夺性采挖和无序开发，野 生石斛已经濒临灭绝，寻找新的、可再生的石斛替代 资源成为必然。
结
果
１发酵液的初步鉴定 共分离得到１６个菌株，其中真菌２株，细菌１４
株。经ＴＬＣ检测，菌株ＣＰＵ００２９的发酵液提取物与 石斛总生物碱有显色相同、迁移率相当的层析斑点， 扫描结果见图１。发酵液的氯仿提取物经ＴＬＣ检 测，与石斛总生物碱有显色相同、迁移率相当的层析 斑点。石斛总生物碱有３个生物碱斑点，相对迁移 率（Ｒ，）分别为０．４０３，０．４７４和０．５７９；该菌株的发 酵液提取物中有一生物碱斑点，Ｒ，为０．４７４。
ＬＩＡＯ Ｃｈｅｎ—ｙａｎｇ，ＬＵ Ｗｅｉ—ｆｅｎｇ，ＹＡＯ Ｗｅｎ－ｂｉｎｇ （Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌ咖Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｎｉ＠，Ｎａｎｊｉｎｇ ２ １ ０００９，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］０ｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｓｅｌｅｃｔ ｔｈｅ ｅｎｄｏｐｈｙｔｅｓ ｉｎ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｎｏｂｉｌｅ Ｌｉｎｄｌ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ａｌｋａ— ｌｏｉｄｓ ｂｙ ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ｅｎｄｏｐｈｙｔｅｓ ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ ｐｒｏｄｕｃｅ ａｌｋａｌｏｉｄｓ ｗａｓ