SDSPAGE测量蛋白质分子量解析

合集下载

SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量解析

• 5．支持介质的筛孔：支持介质的筛孔大小对生物大分子的电泳迁移速度有明显的影响。在筛孔大的介质中泳动速度快，反之则泳动速度慢。
电泳技术的分类
• 1. 根据电泳中是否使用支持介质分为自由电泳和区带电泳： ①自由电泳不使用支持介质，电泳在溶液中进行。②区带电泳需使用支持介质，根据支持介质不同可分为醋酸纤维薄膜电泳、薄层电泳和凝胶电泳等。根据支持介质的装置形式不同又可分为水平板式电泳、垂直板式电泳、垂直盘状电泳、毛细管电脉等。 • 2.根据电泳时电压的高低分为高压电泳和常压电泳：①高压电泳使用的电压在500～1000V，这类电泳分离速度快，但热效应较大，必须具备冷却装置，主要适用于小分子化合物的快速分离。②常压电泳使用的电压在500 V以下，电位梯度为2～10 V /cm。这类电泳的分离速度较慢，但对电泳设备要求简单。
• 4．电渗：液体在电场中对于固体支持介质的相对移动称为电渗。由于支持介质表面存在一些带电基团，如滤纸表面含有羧基，琼脂含有硫酸基等。这些基团电离后使支持介质表面带电，吸附一些带相反电荷的离子在电场作用下向电极方向移动，形成介质表面溶液的流动。 • 当电渗方向与电泳方向相同时则加快电泳速度；当电渗方向与电用的示踪剂有溴酚兰和二甲苯青FF。示踪剂一般与蔗糖、甘油组成上样缓冲液，蔗糖、甘油可增加溶液密度，使其比重增加，以确保样品均匀沉入加样孔内。
醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质
【基本原理】 • 本实验用醋酸纤维薄膜作电泳支持物分离血清蛋白质。血清蛋白质的等电点都小于7.5，在 pH=8.6的巴比妥缓冲溶液中都带有负电荷，在电场中将向正极移动。由于血清中各蛋白质的等电点不一，所带净电荷有差异，所以它们的泳动速率也不同。将微量血清点于薄膜上，通电电泳后，将薄膜置染色液中使蛋白质固定并染色，可将血清蛋白质分成5条区带，从正极端起分别为白蛋白、 α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测定蛋白质分子量

连续系统：电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统：缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度均不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳

(4)聚丙烯胺凝胶的生成：
四、实验步骤：

1、贮液的配制：
2、凝胶的制备： 2.1 胶板的制备： 2.2 分离胶的制备： 2.3 浓缩胶的制备：

3、蛋白样品的制备：
4、装槽、点样： 5、电泳： 6、剥胶、染色、脱色：
2.1 胶板的制备：
3、植物组织蛋白质提取：
称取大豆叶片1g放在研钵中用液氮研磨，加

第二、不连续系统中的三种物理效应：
①电荷效应：
②分子筛效应: ③浓缩效应:
三、实验材料、仪器和试剂：

1、实验材料：黄瓜叶片(芽黄叶和正常叶)
2、仪器、器皿：
(1)垂直板电泳装置
（电泳槽，玻璃板，胶条，电泳梳子，制胶架等）； (2)稳流稳压电泳仪；（4）电子天平；（6）瓷盘、微量进样器；（3）高速冷冻离心机；（5）电冰箱；

②光聚合：
催化剂是核黄素（VB2 ），在痕量氧存在下，核黄素光
解形成无色基，无色基再被氧氧化成自由基，激活单体发生聚合。光聚合形成的凝胶孔径较大，且不稳定，适于制备大孔径的浓缩胶。
5)聚丙烯酰胺凝胶结构上的特点：

① 聚丙烯酰胺的基本结构为丙烯酰胺单体构成的长链，链与链之间通过甲叉桥联结在一起；

⑧支持物筛孔大小：
孔径小，电泳速度慢，反之则快。
2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE测定蛋白质分子量

02 实验材料
所需的试剂和溶液
丙烯酰胺（AA）：用于制备凝胶，是聚合反应的单体。
甲叉双丙烯酰胺（MBA）：交联剂，增加凝胶的交联度。
N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）：催化剂，加速交联聚合反应。
所需的试剂和溶液
过硫酸铵（APS）
引发剂，产生自由基，引发聚合反应。
SDS
十二烷基硫酸钠，用于变性蛋白质并促使其带负电荷。
发展新型分离技术
随着生物技术的不断发展，可以发展新型的蛋白质分离技术，如二维电泳、毛细管电泳等，以提高蛋白质分离的分辨率和准
确性。
应用多维度分析
在后续实验中，可以将SDS-PAGE与其他蛋白质分析技术相结合，如质谱技术、免疫学检测等，进行多维度分析，更全面地
了解蛋白质的性质和功能。
THANKS FOR WATCHING
白质带负电荷，从而在电场中向正极移动。
聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质，能够根据蛋白质分子量的不同
03
对其进行分离。
蛋白质的分子量测定
通过比较标准蛋白的迁移率和已知分子量的标准蛋白，可以大致测定出待测蛋白质的分子量。
蛋白质的迁移率与其分子量的对数成反比，因此可以通过计算待测蛋白与标准蛋白的相对迁移率来推算其分子量。
甘氨酸
作为分子量标准品。
Tris-HCl缓冲液
维持电泳过程中的pH值稳定。
所需的仪器和设备
电源
为电泳提供电力。
凝胶板
放置凝胶的框架。
垂直电泳槽
提供电泳所需的基本结构。
移液器
精确添加试剂和溶液。
紫外透射仪
检测蛋白质条带。
实验前的准备事项
清洗电泳槽和相关器具，确保无残留物。准备好所需的试剂和溶液，并确保其在有效期内。

SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量

SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量SDS-PAGE电泳是现代生物学和生物化学研究中最常用的方法之一，可用于测定蛋白质的相对分子质量、纯度和数量等指标。

下面将就SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量进行介绍。

SDS-PAGE电泳的原理：SDS-PAGE电泳是一种基于PAG（聚丙烯酰胺凝胶板）的矩阵上运行的直流凝胶电泳。

相对分子质量（MW）是以电泳迁移距离为单位来表示的。

蛋白质在PAG上被限制在孔道中运动，因此，蛋白质分子迁移距离与分子大小成正比。

通过使用外部标准，可以精确地将样品的迁移距离转换为分子量。

这种分离方法受到电荷和大小作用的影响，电势梯度使带电的蛋白质分子在凝胶中迁移。

SDS-PAGE电泳的过程：SDS-PAGE电泳的过程主要包括：样品加载、电泳和染色步骤。

（1）样品加载：样品的制备：蛋白质样品通常经过还原和变性，以便将所有蛋白质中的二硫键断裂并且在孔道中呈现线性的多聚蛋白质结构。

这需要在治疗过程中对样品添加SDS缓冲液，然后在热水浴或高压下暴露于还原剂，例如2-硫代乙酸（DTT）或β-巯基乙酸（MEA）。

（2）电泳：将处理过的样品通过凝胶基质中的丝状孔道。

随着电场的施加，蛋白质会在SDS凝胶板上自由迁移，从而分离出蛋白系列。

（3）染色：电泳结束后，将凝胶板进行染色。

目前较常用的方法是银染、共染和Coomassie Brilliant Blue染色法。

SDS-PAGE电泳的应用：SDS-PAGE电泳广泛应用于研究蛋白质相对分子质量、活性定量、纯度评估、亚基分离等方面。

其中，蛋白质相对分子质量的测定是SDS-PAGE电泳的最主要应用之一。

通过将未知蛋白与已知分子质量蛋白一起电泳，可以通过线性回归计算未知标本的分子大小。

SDSPAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告

SDS_PAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告实验报告：SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量一、实验目的通过SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）测定蛋白质相对分子质量，了解其基本原理和实验操作流程。

二、实验原理SDS-PAGE是一种常用的测定蛋白质相对分子质量的方法。

它利用十二烷基硫酸钠（SDS）与蛋白质的结合性质，将蛋白质变性并带负电荷，使得蛋白质在电场中的迁移率仅取决于相对分子质量，而与蛋白质的等电点、电荷性质无关。

通过比较标准蛋白质的迁移率和已知相对分子质量的蛋白质，可确定待测蛋白质的相对分子质量。

三、实验步骤1.准备试剂和器材：SDS-PAGE所需试剂包括丙烯酰胺、N-丙基甲基丙烯酰胺、过硫酸铵、甘氨酸、十二烷基硫酸钠、tris缓冲液、G250染料、乙醇等；器材包括电泳槽、制胶板、移液器、电泳仪、电源等。

2.制备标准蛋白样品：选择已知相对分子质量的标准蛋白样品，将其与G250染料混合，煮沸变性，冷却后作为标准蛋白样品。

3.制备样品：将待测蛋白质样品与G250染料混合，加入适量SDS-PAGE缓冲液，煮沸变性，冷却后作为待测样品。

4.制胶：将丙烯酰胺、N-丙基甲基丙烯酰胺、过硫酸铵、甘氨酸、tris缓冲液等混合，倒入制胶板中，插入样品梳子，静置凝固。

5.电泳：将凝胶放入电泳槽中，加入适量电泳液，将标准蛋白样品和待测样品分别加入对应的孔中。

打开电源，调整电流和电压，开始电泳。

6.染色和脱色：电泳结束后，将凝胶取出，用G250染料进行染色，然后进行脱色处理，以呈现清晰蛋白质条带。

7.相对分子质量测定：通过比较标准蛋白样品的迁移率和已知相对分子质量的蛋白样品，可确定待测蛋白质的相对分子质量。

四、结果分析通过本实验，我们成功地得到了SDS-PAGE凝胶电泳图谱，并测定了待测蛋白质的相对分子质量。

通过与标准蛋白样品的迁移率进行比较，发现待测蛋白质的相对分子质量约为50kDa。

此外，我们还发现不同浓度的待测蛋白质样品在凝胶电泳图谱上的条带位置也存在差异，表明它们具有不同的相对分子质量。

SDS-PAGE蛋白质纯度分析

SDS-PAGE蛋白质纯度分析十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（英语：sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，简称SDS-PAGE）是较常用的一种蛋白纯化分析技术。

SDS-PAGE可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离。

如果蛋白质样品中含有多个蛋白质或者纯化蛋白样品中含有其他杂蛋白，经过SDS-PAGE分离后不同的蛋白质会被分离成多个蛋白条带。

如果纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，则只显现一条蛋白条带。

由此SDS-PAGE技术可以对蛋白质样品的纯度进行分析。

SDS-PAGE分析原理SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。

因此，各种蛋白质-SDS复合物在电泳时的迁移速度仅由蛋白质分子量决定，不同的蛋白质由于分子量的差异经过SDS-PAGE电泳后分离，再经由蛋白质染色对蛋白质分离结果进行分析。

蛋白质SDS-PAGE分析流程1. 蛋白质浓度检测2. 样品处理: 在蛋白样品中加入等量含有B-巯基乙醇的2x loading buffer，煮沸10分钟3. 电泳准备: 配置合适浓度的SDS分离胶，安装电泳槽，注入1x 电泳液4. 蛋白质样品上样：根据蛋白质浓度，取适量处理过的蛋白样品依次加入电泳孔槽内，另外取适量蛋白标准marker加入其他空余孔槽内。

5. 开始电泳: 接通电源，将电压调至120v，保持恒定电压。

6. 电泳结束剥离胶: 当溴酚蓝迁移至凝胶底部，停止电泳；将蛋白胶取出，并切去浓缩胶和分离胶底部的溴酚蓝胶条。

7. 染色: 使用R250染色液对蛋白胶染色1小时8. 脱色: 使用脱色液对染色的蛋白胶脱色至背景干净，蛋白条带清晰可见9. 拍照分析中/英文项目报告在技术报告中，百泰派克会为您提供详细的中英文双语版技术报告，报告包括：1. 实验步骤（中英文）。

5 SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子量

实验SDS - PAGE测定蛋白质的相对分子量一、目的了解SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，并学会用这种方法测定蛋白质的相对分子量。

二、原理聚丙烯酰胺凝胶电泳之所以能将不同的大分子化合物分开，是由于这些大分子化合物所带电荷的差异和分子大小不同之故，如果将电荷差异这一因素除去或减小到可以忽略不计的程度，这些化合物在凝胶上的迁移率则完全取决于相对分子质量。

SDS是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）的简称，它是一种阴离子去污剂，它能按一定比例与蛋白质分子结合成带负电荷的复合物，其负电荷远远超过了蛋白质原有的电荷，也就消除或降低了不同蛋白质之间原有的电荷差别，这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，就可根据标准蛋白质的相对分子量的对数对迁移率所作的标准曲线求得未知蛋白质的相对分子质量。

本实验用目前常用的垂直平板电泳，样品的起点一致，便于比较。

三、试剂和器材（一）试剂1. 凝胶贮备液：丙烯酰胺（Acr）29.2g和亚甲基双丙烯酰胺（Bis）0.8g重蒸水溶解后，定容至100ml，棕色试剂瓶4℃保存，30天内使用。

2. 分离胶缓冲液：1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8。

18.15 Tris（三羟甲基氨基甲烷），少许重蒸水溶解，用1M HCl调pH8.8，重蒸水定容至100ml，4℃保存。

3. 浓缩胶缓冲液：0.5mol/LHCl，pH6.8。

6gTris,少许重蒸水溶解，用1M HCl调pH6.8，重蒸水定容至100ml，4℃保存。

4. 10%SDS，室温保存。

5. 两类样品缓冲液：2倍还原缓冲液（2×reducing buffer）0.5mol/L HCl，pH6.8 2.5 ml甘油 2.0 ml质量浓度10%SDS 4.0ml质量浓度0.1%溴酚蓝0.5mlβ-巯基乙醇 1.0 ml总体积10 ml6. 电极缓冲液，pH8.3。

Tris3g，甘氨酸14.4g，SDS1.0g加重蒸水溶解定容至1000ml，4℃保存。

生物化学实验-SDS-PAGE电泳法测定蛋白质分子量

2、当蛋白质的分子量在15000～200000之间时，电泳迁移率与分子量的对数值呈直线关系，符合下列方程：㏒10Mr = －b·mR + K
（式中：Mr为蛋白质分子量，mR为相对迁移率，b为斜率，K为截距。在条件一定时，b 和K均为常数。）
若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线。未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
2）1mol/L，pH8.8Tris-HCl缓冲液 Tris 21g 溶于蒸馏水，用浓HCl调至pH8.8蒸馏水定容1000ml。
3）1mol/L，pH6.8 Tris-HCl 缓冲液 Tris21g 溶于蒸馏水，用浓 HCl调至 pH6.8 定容1000ml。
4Байду номын сангаас10%（W/V）SDS 5）10%（W/V）过硫酸铵（现用现配） 6）TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)
实验试剂
（1）标准蛋白质（低分子量Marker）
蛋白质名称
分子量
兔磷酸化酶B
97400
牛血清白蛋白
66200
兔肌动蛋白
43000
牛碳酸肝酶
31000
胰蛋白酶抑制剂
20190
鸡蛋清溶菌酶
14400
待测蛋白质：牛血清白蛋白、人血清蛋白
（2）凝胶试剂
1）30%（W/V）丙烯酰胺 30g 丙烯酰胺，0.8g甲叉双丙烯酰胺，溶于100ml蒸馏水中，储于4℃暗处，一个月内可使用。
（3）10×电极缓冲液（pH8.3） Tris30.3g，甘氨酸144.2g，SDS10g，溶于蒸馏水并定容至1000ml。使用时10倍稀释。
（4）2 样品稀释液 SDS 500mg，巯基乙醇1ml，甘油3ml，溴酚蓝4mg， 1mol/L，pH6.8Tris-HCl 2ml，用蒸馏水定容至10ml。按每份0.5-1.0ml分装，-20℃贮存。以此液制备样品时，样品若为固体，应稀释1倍使用；样品若为液体，则加入于样品等体积的原液混合即可。

SDS-PAGE测量蛋白质分子量解析

①浓缩效应
1.凝胶的组成：浓缩胶为大孔径（稀） T＜5％，分离胶一般为小孔径（浓） T﹥7.5％。样品在较稀的凝胶上自由迁移，直至浓凝胶时，便形成一道栅栏，所有的样品分子在浓缩胶的界面堆积成一窄带，得到浓缩，然后，再依据分子量的大小进行电泳分离。 2.缓冲液的组成:图示。PH系统的不连续，各种分子的电荷之间的差异进行分离。 3.缓冲体系的不连续，其中各组成的离子、快慢离子迁移快慢的差别是影响样品浓缩效应的重要因素。 4.离子的迁移速率及浓度的不连续又造成电场强度与电导率的变化。
不连续凝胶电泳（disc）的分离原理
(一).原理

不连续凝胶电泳系统具有与一般电泳的① 电荷效应分离外，还具有②浓缩效应与③分子筛效应，因而，能提高电泳的分辨率；使电荷性质与密度相近的但分子量有差别的分子得以分离；或分子量相近、性质一样、电荷性质与密度有差别的分子可以分离；或电荷性质、分子量大小相近，但构型不同时亦可分离。不连续凝胶电泳洗脱碱性不连续－分离酸性样品酸性不连续－分离碱性样品大多数蛋白质分子呈酸性或中性，适合用碱性系统进行电泳分离。

加样电泳
光吸收检测考玛斯亮篮染色
染色
银染色
SDS-PAGE测蛋白质分子量
SDS-PAGE是在PAG系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠）， SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的 SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X 为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

生化实验七 SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量

实验七 SDS —聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量一、实验原理了解SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，学会用这种方法测定蛋白质的相对分子量二、实验原理带电的颗粒(蛋白质)在电场的作用下，移动的速度是根据此公式，在同一电场强度(v ／d)和电极缓冲液(η)条件下，带电的各种蛋白质成分，移动的速度决定于各蛋白质的带电量(q)和自身分子的大小(6πr)。

若使各蛋白质成分的带电量(q)相近似时，则各蛋白质成分移动的速度就只决定于各蛋白质成分自身分子的大小(6πr)。

1967年Shapiro 等人发现，在聚丙烯酰胺凝胶中加入阴离子去污剂十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulfate ，SDS)，不影响凝胶的形成，而蛋白质的电泳迁移率则主要取决于它的自身分子量的大小。

加入SDS 之所以能获得如此的效应，是因为SDS 能打开蛋白质分子间的氢键和疏水键，使蛋白质变性成为松散的线状。

同时大多数蛋白质的每个氨基酸都能与固定量的SDS 相结合[溶液中的SDS 总量，至少要比蛋白质的量高3倍以上，大多数蛋白质与SDS 按1:1.4(W ／W)的比例结合]，形成SDS 一蛋白质复合物。

其结果： (1)由于SDS 解离后带有很强的负电荷，致使SDS 一蛋白质复合物都带上了相同密度的负电荷，其电量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，基本掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差异。

(2)SDS 与蛋白质结合后，改变了蛋白质原有构象，使所有蛋白质水溶液中的形状都近似椭圆柱形。

不同SDS 一蛋白质复合物的短轴直径都一样，约为18nm ，而长轴则与蛋白质分子的大小成正比。

这样SDS 一蛋白质复合物在凝胶电泳中的迁移率，就不再受蛋白质原有电荷及其形状的影响了，而只取决于椭圆柱长度，即蛋白质分子的大小。

需要注意的是：为使SDS 与蛋白质能充分的按比例结合，必须将蛋白质间的二硫键完全打开。

因此，在用SDS 处理蛋白质样品时，必须同时用巯基乙醇处理。

sds-page测定蛋白质纯度

百泰派克生物科技
sds-page测定蛋白质纯度
SDS-PAGE是一种根据分子量分离蛋白质的凝胶电泳分析技术。

当蛋白质通过凝胶
基质电泳分离时，较小分子量的蛋白质受到来自凝胶基质的阻力更小，电泳时迁移速度更快。

影响蛋白质在凝胶基质中的迁移速率的其他因素还包括蛋白质的结构和电荷，在SDS-PAGE中，十二烷基硫酸钠（SDS，又称十二烷基硫酸钠）和聚丙烯酰胺凝胶的使用很大程度上消除了结构和电荷的影响，蛋白质的分离完全基于多肽链的长度。

蛋白质经SDS-PAGE电泳后按分子量大小分离开来，如果蛋白样品只含有一种蛋白质，那么其电泳后只会显现一个唯一的蛋白条带；但如果一个蛋白样品中含有多种大小不同的蛋白，那么电泳后不同的蛋白质会被分离成大小不同的蛋白条带。

于是，可以据此利用SDS-PAGE的分离作用进行蛋白纯度的鉴定，不仅可以分析一个未知
蛋白样品的纯度，还可以验证蛋白样品纯化后的效果。

百泰派克生物科技使用Bio-Rad Mini-PROTEAN® Tetra凝胶系统，提供基于1D和
2D的 SDS-PAGE分析服务技术包裹，用于多种蛋白质组学分析，包括蛋白质样品纯度分析、分子量测定、蛋白质鉴定、二硫键鉴定以及蛋白质定量等，欢迎免费咨询。

sds-page测定蛋白质的相对分子量

03 SDS-PAGE测定蛋白质相对分子量的原理
蛋白质的相对分子量与迁移率的关系
蛋白质在SDS-PAGE电泳中的迁移率与其相对分子量成反比，即相对分子量越大，迁移速度越慢。
在电场的作用下，SDS将蛋白质分子包裹起来，消除了蛋白质分子间的电荷差异，使相对分子量成为影响迁移率的唯一因素。
电泳
加样
将准备好的样品用微量移液器加到加样孔中。
开始电泳
接通电源，开始电泳，注意控制电流和电压，确保电泳过程稳定。
染色和脱色
染色
电泳结束后，将凝胶取出，放入含有染色液的容器中，染色一定时间，以便观察蛋白质条带。
脱色
染色完成后，将凝胶取出，放入含有脱色液的容器中，脱色一定时间，以便观察清晰的蛋白质条带。
将SDS和β-巯基乙醇加入样品中，以促进蛋白质变性并带上负电荷。
煮沸处理
通过煮沸处理使蛋白质变性，并使SDS充分结合到蛋白质上。
凝胶制备
01
制备分离胶
按照分离胶的配方，将各组分混合均匀，并迅速注入到玻璃板中的凹槽内。
聚合凝胶
02
03
制备浓缩胶
加入适量水，使分离胶聚合凝固。
按照浓缩胶的配方，将各组分混合均匀，并迅速注入到分离胶上。
计算相对分子量时需考虑实验条件、电泳缓冲液、电压等因素的影响，以确保结果的准确性。
04 SDS-PAGE实验注意事项
避免样品降解
确保样品储存于低温环境
01
在实验过程中，应将未使用的样品保存在低温环境中，以避免
蛋白质降解。
避免样品反复冻融
02
反复冻融会使蛋白质发生变性，影响实验结果，因此应尽量减
SDS-PAGE可用于测定各种相对分子量范围的蛋白质，从低到高均可。

SDS-PAGE测定蛋白质分子量

SDS-PAGE测定蛋白质分子量
SDS-PAGE（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis）测定蛋白质分子量，简便、快速且重复性好，是一种常用的蛋白质分子量测定方法。

百泰派克生物科技提供基于SDS-PAGE或质谱的蛋白质分子量测定服务。

SDS-PAGE
SDS-PAGE即十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，是一种间断的电泳系统，通常用于分离分子量在5—250kDa之间的蛋白质。

十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate ，SDS）和聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel ，PAG）组合使用可以消除结构和电荷的影响，从而仅根据分子量的差异来分离蛋白质。

SDS-PAGE测定蛋白质分子量。

SDS-PAGE测定蛋白质分子量
蛋白质分子量即蛋白质相对分子质量，是蛋白质化学式中各个原子的相对原子质量的和。

蛋白质分子量正确与否往往预示着蛋白质的结构和功能正确与否。

测定蛋白质分子量的方法有很多，SDS-PAGE是主要方法之一，也是实验室使用最普遍的一种。

在SDS-PAGE中，已知分子量的标准蛋白质和未知样品同时电泳。

染色后，根据标准蛋白质的相对迁移率和分子量的对数，可得到一条标准曲线，利用未知样品的相对迁移率可在标准曲线上求得其分子量。

另外，SDS-PAGE法可分为还原电泳和非还原电泳，还原电泳中蛋白质二硫键被还原使得蛋白质可以充分伸展，因此使
测定结果更为准确。

SDS-PAGE测定蛋白质分子量

实验十 SDS-PAGE测定蛋白质分子量一、实验目的1.学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。

2.掌握垂直板电泳的操作方法。

3.运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定。

二、实验原理1.带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这种现象称为电泳。

电泳分类：移动界面电泳、区带电泳、稳态电泳。

其中区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支持介质中迁移。

支持介质的作用主要是为了防止机械干扰和由于温度变化以及大分子溶液的高密度而产生的对流。

区带电泳早期使用不同的支持介质有滤纸、玻璃珠、淀粉粒、纤维素粉、海砂、海绵、聚氯乙烯树脂；以后有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜，现在则多用聚丙烯酰胺（PAGE）和琼脂糖凝胶。

2.PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。

不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。

3.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠），SDS 能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。

当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMr=K-bX，式中：Mr为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

sds-page测定蛋白质相对分子质量原理

sds-page测定蛋白质相对分子质量原理
SDS-PAGE（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis）是一种常用的蛋白质分析技术，用于测定蛋白质的相对分子质量。

SDS-PAGE原理基于以下几个关键步骤：
1. 蛋白样品的准备：将待测蛋白样品与SDS（十二烷基硫酸钠）混合，使蛋白质表面被负电荷包裹。

2. 样品加载和电泳过程：将蛋白样品加载到聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel）中的孔洞中。

通常采用垂直电泳方式进行，将正电极和负电极连接至凝胶两端，通过电场使蛋白质向电泳方向迁移。

3. 分子分离：在电泳过程中，由于SDS的存在，样品中的蛋白质被完全解聚并带负电荷，使每个蛋白质分子的移动速率只与其相对分子质量成正比。

较小的蛋白质能够在凝胶中更快地迁移，较大的蛋白质则移动速率较慢。

4. 染色和可视化：电泳结束后，使用染色剂（如Coomassie蓝染色剂）将蛋白质染色，使其可见。

通过测量蛋白质在凝胶上的迁移距离，可以估计蛋白质的相对分子质量。

总结：SDS-PAGE利用SDS使蛋白质解聚并带负电荷，在电泳过程中按照相对分子质量的大小分离蛋白质，通过染色和测量蛋白质的迁移距离来估计其相对分子质量。

SDSPAGE测量蛋白质分子量解析

150µl
10%Ap
150µl
TEMED
500µl
浓缩胶(5% 5ml)
3.2ml
0.85ml
0.5mol/L pH=6.8 Tris-HCl 0.65ml
50µl
50µl
200µl
3.样品及MW标准参照物溶液的制备
样品溶液和上样缓冲液混匀，使用前在100℃水浴 1min，以除去可能出现的亚稳态聚合物。
Tris0.6g，加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8，最后用蒸馏水容至100ml。
2.实验试剂
（7）10%过硫酸铵(AP) （8）TEMED（四甲基乙二胺）（9）样品溶解液：SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+
溴酚蓝（2mg）+甘油（2g） +0.05mol/L pH8.3TrisHCl（2ml），最后定容至10ml。（10）固定液：取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。（11）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液 250ml，过滤后备用。（12）脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至1000ml。（13）电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05mol/LTris- 0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml。
4.上样。 15μl/孔
5.电泳
上槽接负极，下槽接正极，打开电泳仪开关，开始时将电流调至10mA，待样品进入分离胶时，将电流调至20-30mA。待指示剂染料靠迁移至下沿1～1.5cm 处停止电泳，需2～3h。
6.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，将凝胶放入0.05% 考马斯亮蓝R250（内含20％磺基水杨酸）染色液中，

蛋白 SDS-PAGE纯度鉴定与分子量测定

蛋白SDS-PAGE纯度鉴定与分子量测定一、原理：（1）SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodiumdodecylsulphate-polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE）简称SDS-PAGE。

用于蛋白纯度及蛋白质亚基相对分子量（relativemolecularmass,Mr）测定。

SDS是一种阴离子去污剂，带有大量负电荷，与蛋白质结合后使蛋白质所带负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异。

SDS破坏蛋白质氢键、疏水键，引起蛋白质构象改变，使蛋白质－SDS复合物形状近似椭圆形，短轴相同（1.8nm），长轴与蛋白质分子量成正比。

因此，蛋白质—SDS复合物(SDS-denaturedprotein)在凝胶中的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与椭圆棒长度（蛋白质分子量）有关。

蛋白质的迁移率与分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX（6）1ml注射器及6号长针头；（7）微量注射器（10μl或50μl）?????试剂：标准蛋白质：不连续体系SDS-PAGE有关试剂（1）10%（W/V）SDS溶液：称5gSDS，加重蒸水至50ml，微热使其溶解，置试剂瓶中，4℃贮存。

SDS在低温易析出结晶，用前微热，使其完全溶解。

（2）1%TEMED（V/V）：取1mlTEMED，加重蒸水至100ml，置棕色瓶中，4℃贮存。

（3）10%AP（W/V）：称AP1g，加重蒸水至10ml。

最好临用前配制。

（4）样品溶解液：内含1%SDS，1%巯基乙醇，40%蔗糖或20%甘油，0.02%溴酚蓝，0.01mol/LpH8.0?Tris-HCl缓冲液。

①先配制0.05mol/LpH8.0?Tris-HCl缓冲液：称Tris?0.6g，加入50ml重蒸水，再加入约3ml?1mol/LHCl，调pH至8.0，最后用重蒸水定容至100ml。