高效液相色谱 串联质谱法测定牛羊组织中苯酚类和水杨酸苯胺类抗蠕虫药多残留-文档资料

高效液相色谱串联质谱法测定牛羊组织中苯酚类和水杨酸苯胺类抗蠕虫药多残留

1 引言

氯羟柳胺（OXY）、硝碘酚腈（NIT）、氯氰碘柳胺（CLO）、碘醚柳胺（RAF）是一类苯酚类和水杨酸苯胺类抗蠕虫药，作用机理是通过阻断肝片吸虫的氧化磷酸化过程，使虫体麻痹、死亡，用于驱杀牛、羊的肝片吸虫、蛔虫和绦虫，对血毛线虫、巨片吸虫和羊蝇蛆亦有较好作用。随着国内驱虫药的广泛应用和研究，发现碘醚柳胺有明显胚胎毒性[1]；氯氰碘柳胺对肝、肾具有一定的毒、副作用[2]；高剂量硝碘酚腈可引起心脏、神经、肌肉和呼吸的损害[3]。欧洲医药评价署、澳大利亚以及食品法典委员会均已制定了上述药物的最大残留限量（Maximum residue limit，MRL），残留标志物均为原形药物，残留监测的动物是牛羊。靶组织MRL分别如下：硝碘酚腈：牛、羊，肌肉400 μg/kg、脂肪200 μg/kg、肝20 μg/kg、肾400 μg/kg。碘醚柳胺：牛，肌肉30 μg/kg、脂肪30 μg/kg、肝10 μg/kg、肾40 μg/kg；羊，肌肉100 μg/kg、脂肪250 μg/kg、肝150 μg/kg、肾150 μg/kg。氯氰碘柳胺：牛，肌肉1000 μg/kg、脂肪3000 μg/kg、肝1000 μg/kg、肾3000 μg/kg；羊，肌肉1500 μg/kg、脂肪2000 μg/kg、肝1500 μg/kg、肾5000 μg/kg。氯羟柳胺：牛、绵羊，肌肉20 μg/kg、脂肪20 μg/kg、肝500 μg/kg、

肾100 μg/kg。我国农业部（2003）235号公告[4]已经颁布硝碘酚腈、碘醚柳胺、氯氰碘柳胺的最高残留限量，氯羟柳胺的最高残留限量正在制定中。

目前，关于苯酚类和水杨酸苯胺类抗蠕虫药在组织中残留的检测方法主要有高效液相色谱与紫外检测器[5～8]、荧光检测器和质谱检测器联用[9，10]、高效液相色谱串联质谱法[11～16]。国内仅报道高效液相色谱串联质谱法[9]检测氯氰碘柳胺在牛

组织和牛奶中残留的研究，国外对于苯酚类和水杨酸苯胺类抗蠕虫药在组织中残留分析方法的报道主要局限于某种组织或者是

单残留和两种药物的残留检测方法，尚未报道关于4种苯酚类和水杨酸苯胺类抗蠕虫药在牛、羊组织中的多残留检测方法。本研究采用HPLC MS/MS分析牛、羊组织中4种苯酚类和水杨酸苯胺类抗蠕虫药的多残留，方法前处理简便易行，灵敏度高，精密度及重复性好，适用于牛、羊组织中苯酚类和水杨酸苯胺类抗蠕虫药的多残留检测。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Agilent 1200型液相色谱仪（美国安捷伦公司）； API4000电喷雾串联四极杆质谱仪，配Analyst 4.1.5 软件（美国应用生物系统公司）； C18 色谱柱（150 mm×2.1 mm， 3.5 μm，美国Waters公司）； Centrifuge5804台式高速离心机（美国Eppendorf公司）； D10 24型氮气浓缩仪（杭州奥盛仪器XX公

司）； Milli Q纯水机（美国Millipore公司）； CNWBOND MAX 固相萃取小柱（60 mg/3 mL，德国CNW科技公司）。

硝碘酚腈（Nitroxinil，NIT）精制对照品（纯度98.5%，批号 091205），氯羟柳胺（Oxyclozanide，OXY）精制对照品（纯度98.5%，批号1670811），氯氰碘柳胺钠（Closantel，CLO）精制对照品（纯度94.1%，批号 67111001），碘醚柳胺（Rafoxanide，RAF）精制对照品（纯度99.5%，批号 0505028），均购自河北远征药业XX公司；乙腈、甲醇、甲酸（色谱纯，德国CNW科技公司）；乙酸铵（色谱纯，美国TEDIA公司）；氨水、冰醋酸（分析纯，江苏强盛功能化学XX公司）；实验用水为超纯水。

2.2 溶液的配制

标准储备液：准确称取适量的硝碘酚腈、氯羟柳胺、氯氰碘柳胺、碘醚柳胺对照品，用乙腈分别配制成1 g/L的单一标准储备液及100 μg/mL的混合标准溶液。1%三乙胺乙腈溶液：取1.0 mL三乙胺，用乙腈定容至100 mL，混匀。25% 氨化乙腈溶液：取25.0 mL氨水，用乙腈定容至100 mL，混匀。5%甲酸乙腈溶液；0.1%甲酸溶液。

2.3 色谱质谱条件

2.3.1 色谱条件 C18色谱柱（150 mm×2.1mm，3.5 μm）；流速： 0.25 mL/min；柱温：35 ℃；进样量： 5 μL；流动相：甲醇（A），乙腈（B）， 0.1%甲酸溶液（C）。梯度洗

脱程序： 0.0 min， 15%A， 25%B； 0.0～1.0 min， 15%～30%A，25%～70%B； 1.0～6.0 min， 30%A， 70%B； 6.0～6.5 min， 30%～15%A， 70%～25%B； 6.5～13.0 min， 15%A， 25%B。 2.3.2 质谱条件用多反应监测（MRM）扫描模式；电喷雾离子源（ESI）；负离子扫描；电喷雾电压

Symbolm 3500 V，离子源温度650 ℃，气帘气压力15 kPa，雾化气压力60 kPa，辅助气压力 60 kPa。射入电压、碰撞能量、去簇电压、碰撞室射出电压及定性离子对、定量离子对等参数见表1。

2.4 样品的处理与净化

（1）肌肉、肝脏、肾脏组织样品已匀浆组织样品在室温下自然解冻，准确称取（2.00±0.02）g，置于50 mL离心管中，加入乙腈丙酮混合液（60∶40，V/V）15 mL，漩涡混悬15 s，超声提取10 min，300 r/min振摇10 min，8000 r/min 离心10 min 后收集上清液；上清液中加入1 mL 5%氨水待净化。（2）脂肪组织样品已匀浆组织样品在室温下自然解冻，准确称取

（2.00±0.02）g，置于50 mL离心管中，加入1%三乙胺乙腈溶液15 mL，漩涡混悬15 s，超声提取10 min，300 r/min振摇10 min，8000 r/min 离心10 min后收集上清液；上清液中加入2 mL 5%氨水后，置于

Symbolm 20 ℃冷藏1 h，取出后在4 ℃下8000 r/min离心10 min。上清液转移至另一个50 mL离心管中，待净化。