动物组织DNA的提取与鉴定

（3）TE缓冲液（pH 8.0）：高压灭菌，室温贮 存。
（4）酚：氯仿：异戊醇（25:24:1） （5）异丙醇、冷无水乙醇、70%乙醇、灭菌水。 盐酸，醋酸钠，琼脂糖，溴酚蓝，溴化乙锭。
*主要的试剂及配置：
• DNA提取液SET： 10mmol/LTris.Cl（pH8.0）、
100mmol/lEDTA、500mmol/lNaCl、20%SDS
3.加等量的酚：氯仿：异戊醇振荡混匀，离心12000 rpm，5min。 4.取上层溶液至另一管，加入等体积的氯仿异戊醇， 振荡混匀，离心12000 rpm，5min5. 取上层溶液来自百度文库另 一管，加入1/2体积的7.5mol/L乙酸氨加入2倍体积的 无水乙醇，混匀后室温沉淀2min ，离心12000 rpm ,10min。
5.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将 附于管壁的残余液滴除掉。
6.用1ml 70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000 rpm ， 5min。
7.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上， 将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。 8.加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或 20℃保存备用。 9.将提取物置于紫外分光光度计上检测其纯度。
5、加样 将DNA样品与加样缓冲液按4：1混匀后，用微量移液器将混 合液加到样品槽中，每槽加10-20μl，记录样品的点样次序和 加样量。 6、电泳 安装好电极导线，点样孔一端接负极，另一端接正极，打 开电源，调电压至3-5V/cm，电泳1-3hr，当溴酚蓝移到距凝胶 前沿1-2cm时，停止电泳。 7、染色和观察 取出凝胶，放在含有溴化乙锭的染色液中染色30min，即可 在254nm的紫外灯下观察，有橙红色荧光条带的位置，即为 DNA条带，或在紫外灯下照相记录电泳图谱。溴化乙锭是致 癌剂，操作时要小心，必须戴手套。
*鉴定：
1、安装电泳槽 将有机玻璃的电泳凝胶床洗净，晾干，用胶带将两端的 开口封好，放在水平的工作台上，插上样品梳。 2、琼脂糖凝胶的制备 称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中，（按0.3-1.5%的琼脂 糖含量，1-25kb大小的DNA用1%的凝胶，20-100kb的 DNA用0.5%的凝胶，200-2000bp的DNA用1.5%的凝胶） 置微波炉或沸水浴中加热至完全溶化（不要加热至沸 腾），取出摇匀。 3、灌胶 将冷却到60℃的琼脂糖溶液轻轻倒入电泳槽水平板上 4、待琼脂糖胶凝固后，在电泳槽内加入电泳缓冲液，然 后拔出梳子。
冰无水乙醇
可以吸收分子之间的水，使DNA沉淀析出， 无水乙醇使用前冰冻，可以减少DNA沉淀析 出过程释放热量DNA的损伤。
75%乙醇：
洗涤DNA的作用，主要去盐和有机杂质。
四、实验步骤
*提取：
1. 取新鲜或冰冻动物组织块0.1g（0.5cm3），尽 量剪碎。置于玻璃匀浆器中，加入1ml的细胞 裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml 离 心管中，加入蛋白酶K （500ug/ml）20μl，混 匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转 入37℃水浴12～24h，间歇振荡离心管数次。 于台式离心机以12000 r/min离心5min，取上清 液入另一离心管中。 2.加2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝 状物，用100ul 吸头挑出，凉干，用200ul TE 重 新溶解。
• TE缓冲液（pH8.0）: 100mmol/lTris.Cl（pH8.0）、1mol/lEDTA （pH8.0）、室温保存； • 氯仿-异戊醇（23：1）：体积23:1 • 其他试剂：Tris饱和酚（购买）、无水乙醇、 75%乙醇。
*各种试剂的作用
EDTA（乙二胺四乙酸）
（1）螯合细胞膜和骨架上的Ca2+、Mg2+,从而 使细胞更易破碎。 （2）螯合Mg2+使得内源性Dnase没有Mg2+不 能发挥作用，保持DNA的稳定性，Tris起缓存 pH值的作用。
动物组织DNA的提取与鉴定
一、实验目的
• 1.了解并掌握提取动物基因组 DNA的原理和常用方法。
• 2.学习和掌握琼脂糖电泳法鉴定 DNA的原理和方法。
二、实验原理
• 提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基 硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/ 异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从 溶液中析出。 • 琼真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都能用来制备基 因组 DNA。真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内， 因此，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等 分离，又要保持DNA分子的完整。 • 脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法。 琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷， 是一种很好的电泳支持物。DNA在碱性条件下（pH8.0的缓冲液） 带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同DNA分子 片段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率液不同。溴化 乙锭（EB）可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外 线照射后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛选 重组子的目的。
（1）主要用于DNA提取时蛋白质的去除，抑制DNA酶活性； （2）苯酚溶于有机溶剂，微溶于水； （3）提取DNA前苯酚用Tris-Hcl饱和，防止吸收过多DNA， 降低DNA的损失率； （4）氯化苯酚会破坏DNA。
氯仿；异戊醇（23:1）
（1）主要用于DNA或者RNA提取时蛋白的去除； （2）DNA提取时候，氯仿起变性蛋白质和将第一次抽提 后的水相中的酚带走的作用。异戊醇能降低分子表面张 力，能减少抽提过程中的泡沫产生，同时异戊醇有助于 分相，增加界面的稳定性
蛋白酶K
水解蛋白质的作用，消化DNA酶和细胞中的 蛋白质
SDS（十二烷基硫酸钠）
SDS是离子型表面活性剂，主要作用是： （1）破坏细胞膜及核膜； （2）解聚细胞中的核蛋白； （3）与蛋白质结合，使蛋白质变性而沉淀下 来； （4）抑制DNA酶活性，使DNA分子尽量完整 的分离出来。
苯酚：蛋白质强变性剂
三、实验仪器及试剂
• 1. 仪器： 恒温水浴锅、台式离心机、紫外分光光度 计、移液器、玻璃匀浆器、离心管（灭 菌）、吸头（灭菌）、 电泳仪，电泳槽、 紫外透射反射仪、微波炉、微量进样器
2. 试剂： （1）细胞裂解缓冲液： Tris (pH8.0) 100 mmol/L EDTA (pH 8.0) 500 mmol/L NaCL 20 mmol/L SDS 10% 胰RNA酶 20ug/ml （2）蛋白酶K：称取20mg蛋白酶k溶于1ml灭菌 的双蒸水中，20℃备用。