QIAGEN试剂盒——动物组织样品DNA提取方法

QIAGEN试剂盒提取组织DNA

试验前的注意事项

1、仔细阅读试剂盒使用说明。

2、所有的离心操作应在15-25℃下完成。

3、涡旋一般进行5-10s。

4、对于福尔马林或石蜡浸泡过样品，另见说明。

5、总RNA提取另见说明。

试验准备

1、Buffer ATL 和 Buffer AL保存时可能会出现沉淀，如果必要的话，可置于56°C 水浴至完全溶解。

2、提供的Buffer AW1 和 Buffer AW2是高浓度液，使用前需用96-100%的乙醇稀释至瓶子上注明的使用浓度。

3、预备一个热的振荡器或摇床或摇动的平板至56°C备步骤2使用。

4、如果为冻存的组织，需要将其溶至室温。但是要避免此类的反复溶解。

应额外准备的物品：

200μL枪及枪头；20μL枪及枪头；2mL的微量离心管；96-100%乙醇；56℃水浴锅；离心机（20,000×g(14,000rpm)）；小镊子；振荡器

操作步骤：

1、取25mg的动物组织（脾脏最多10mg）粉碎成碎片放入1.5ml的微量离心管中。对于啮齿类的尾巴，择取两只小鼠或一只大鼠尾巴0.4-0.6cm。加入180μL buffer ATL，并将对应的动物作以标记。

（保证足够量的组织样本，对于脾脏由于其细胞含量丰富，我们建议不超过10mg。我们强烈建议将组织粉碎以便于溶解提取DNA。最好的方法是在添加bufferATL和蛋白酶K之前置于液氮中冻融。同时，也可以采用QIAGEN公司产的几种组织匀浆机进行组织粉碎）

2、加入20μL蛋白酶K，涡旋混合均匀，56℃孵育直至溶解。在组织溶解的过程中不断（偶尔）涡旋使组织充分散开，或将该微量离心管置于摇晃的平台上，如摇床等。（不同组织溶解时间不同，通常组织为1-3h，小鼠尾巴为6-8h。如果试验条件许可，可以溶解过夜，其不会影响DNA提取）

3、涡旋15s。加入200μL buffer AL 并涡旋使充分混匀，70℃孵育10min，然后加入200μL乙醇（96%-100%），再次涡旋混合。

（如果在做多个样品时，可以将buffer AL和乙醇先混合均匀，一起加入到组织中涡旋均匀。在添加bufferAL与乙醇后可能会出现白色沉淀，该沉淀不会影响试剂盒的操作。一些组织（如脾脏）添加了bufferAL与乙醇后出现凝胶状产物，这种情况下，我们建议剧烈摇晃或涡旋样本使之消失。70℃孵育10min该步骤在我在河南农大用的盒子操作中没有）

4、移出步骤3中的混合物（包括沉淀物）至DNeasy Mini spin column，该柱子放在一2mL收集管中（本试剂盒提供的）。6000 × g(8000 rpm)离心1min，收取管子，弃去滤液。 13000 rpm

5、将DNeasy Mini spin column放入另一2mL的收集管中（本试剂盒提供），加入500μLbuffer AW1，6000×g (8000 rpm)离心1min，收取管子，弃去滤液。

6、将DNeasy Mini spin column 放入另一2mL的收集管中（本试剂盒提供），加入500μLbuffer AW2，20,000 ×g (14,000 rpm)离心3min，使Dneasy膜干燥，收取管子，弃去滤液。

（使DNeasy Mini spin column膜干燥是非常重要的，因为残留的乙醇会影响下面的反应。这个离心步骤就是为了确保没有残留的乙醇影响下步的洗脱。离心后，小心地取出DNeasy Mini spin column防止其与下边的滤液接触。如果与下边的滤液接触沾了少量乙醇则需要再次20,000×g(14,000rpm)离心1mim）

7、向DNeasy Mini spin column膜移入1mL或2mL的微量离心管中（本试剂盒不提供）直接加入200μL buffer AE，清洗DNeasy Mini spin column膜，室温孵育1min，然后6000 × g(8000 rpm)离心1min。

（为了DNA浓度可将200μL buffer AE改为100μL，但是这样会减少DNA的总产量）

8、推荐：如果需要获取最大量的DNA，可将步骤7重复1次。

（使用一个新的1mL或2mL的微量离心管，这样可防止降低前者DNA浓度。当然也可以使用前者离心管）

注意：洗脱液不要多于200μL，以防止滤液过多与DNeasy Mini spin column发生接触。