动物组织基因组的提取ppt课件
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分离纯化核酸总的原则： ①应保证核酸一级结构的完整性； ②排除其它分子(蛋白，脂类，多糖类)的污染。
核酸纯化应达到的要求： ①核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高 浓度的金属离子； ②其它生物大分子的污染应降低到最低程度； ③排除其它核酸分子的污染。
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核酸制备时应注意的事项: ①尽量简化操作步骤，缩短提取过程。 ②减少化学因素对核酸的降解。 ③减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温 ④防止核酸的生物降解：排除核酸酶。 ⑤排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时，应去除 RNA，反之亦然。
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DNase抑制
①加入少量金属离子螯合剂，如0.01 mol/L EDTA 或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。
②去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使 DNase失活。
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RNase抑制
①操作要带手套。 ②所有器皿要严格消毒， ③试剂处理 ④低温操作
⑤在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂。
保存介质：
灭菌水
TE缓冲溶液(最常用)：
10mmol/L Tris-Cl pH8.0
1mmol/L EDTA pHpp8t课.0件.
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三、动物基因组DNA的提取
主要方法： (1)浓盐法
利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同，将二者分离。
1）用1M 氯化钠提取,得到的DNP粘液
2) 与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡,使乳化
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核酸酶的抑制和抑制剂
降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶活 性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然， 几个条件并用更好。
对于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止机械张力 拉断则更重要。
对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑 制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制RNase更 重要。
1）破碎细胞（防止核酸酶的作用）
微生物：溶菌酶、SDS裂解。 高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。
酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶， 冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。 动物：液氮处理后用匀浆器或者研钵破碎。 细胞器DNA：首先纯化细胞器。
以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂
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2）破碎抽提核酸除去杂质 ➢ 首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与其它
主要存在于细胞核的染色体中。 核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA
（cpDNA），质粒DNA。
RNA（核糖核酸）
存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNA等。
除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬 菌
体，其或只含DNA，或只含有RNA。
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三、动物基因组DNA的提取
（3）苯酚抽提法:
苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用。
用苯酚处理匀浆液时, 由于蛋白与DNA 连接键已断, 蛋白分子表面又 含有很多极性基团与苯酚相似相溶。
蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次 重复操作，再合并含DNA 的水相。
成分分离 ➢ 使核酸与蛋白质分离 ➢ 除去脂类 ➢ 多糖的除去
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3）核酸的纯化
根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染, 并除去提取过程中的系列试剂(盐、有机溶剂等）
杂质，最后得到均一的核酸样品。
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4）核酸样品的保存
核酸保存的主要条件是温度和介质
温度： 4℃ 样品经常使用 -70℃是长期保存的良好温度，为一次性保存 -20℃保存,避免反复冻融
实验一、动物组织基因组DNA提 取
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实验一 动物基因组DNA的提取 一、实验目的
➢ 学习和掌握从动物组织或细胞中提取核酸的原理和操 作技术
➢ 了解提取DNA的几种方法，原理和优缺点
➢ 学习测定DNA含量和质量的基本原理及方法
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2Байду номын сангаас
二、实验原理
1、核酸的分类 DNA (脱氧核糖核酸)
如：SDS、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、萘-1.5-二磺酸 钠、三异丙基萘磺酸钠
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核酸制备中常用的蛋白质变性剂
作用： 1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造
成蛋白污染。
2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。
3.某些蛋白质变性剂也有抑制 RNase活性和破裂细胞的作 用。 如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC
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核酸制备中常用的酶 DNase:降解DNA RNase：降解RNA 蛋白酶K：降解蛋白质
溶菌酶：破碎细胞
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3. 核酸制备的一般步骤：
I.材料准备
破碎组织细胞
II.破碎细胞或包膜－内容物释放
提取
III.核酸分离、纯化
纯化
IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质
V.核p酸pt课溶件. 解在适量缓冲液或水中 14
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2、核酸制备的一般原则 核酸的理化性质
在细胞内通常与蛋白质结合，以复合物形式存在 微溶于水，不溶于乙醇，氯仿等有机溶剂 在酸性溶液中容易降解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。 DNA溶液粘度很大，RNA的粘度较小
在强大离心力的作用下，可以从溶液中沉降下来
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2、核酸制备的一般原则
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常用的RNA酶抑制剂
• 焦磷酸二乙酯（DEPC）
抑制强烈、不彻底
• 异硫氰酸胍
有效抑制、分解核蛋白
• 氧钒核糖核苷复合物
有效抑制
• RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin） 有效抑制
• 其它：SDS、尿素、硅藻土等
有效抑制
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核酸制备中常用的去垢剂
核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸 提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂。 去垢剂的作用： 1．溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂； 2．溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出 来； 3．对RNase、DNase有一定的抑制作用。
3) 离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相 中间，而DNA位于上层水相中
4) 用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来.
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三、动物基因组DNA的提取
（2）阴离子去污剂法:
用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性, 可以直接从生物材料中 提取DNA。
由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合, 而阴离子 去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA。
核酸纯化应达到的要求： ①核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高 浓度的金属离子； ②其它生物大分子的污染应降低到最低程度； ③排除其它核酸分子的污染。
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核酸制备时应注意的事项: ①尽量简化操作步骤，缩短提取过程。 ②减少化学因素对核酸的降解。 ③减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温 ④防止核酸的生物降解：排除核酸酶。 ⑤排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时，应去除 RNA，反之亦然。
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DNase抑制
①加入少量金属离子螯合剂，如0.01 mol/L EDTA 或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。
②去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使 DNase失活。
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RNase抑制
①操作要带手套。 ②所有器皿要严格消毒， ③试剂处理 ④低温操作
⑤在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂。
保存介质：
灭菌水
TE缓冲溶液(最常用)：
10mmol/L Tris-Cl pH8.0
1mmol/L EDTA pHpp8t课.0件.
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三、动物基因组DNA的提取
主要方法： (1)浓盐法
利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同，将二者分离。
1）用1M 氯化钠提取,得到的DNP粘液
2) 与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡,使乳化
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核酸酶的抑制和抑制剂
降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶活 性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然， 几个条件并用更好。
对于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止机械张力 拉断则更重要。
对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑 制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制RNase更 重要。
1）破碎细胞（防止核酸酶的作用）
微生物：溶菌酶、SDS裂解。 高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。
酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶， 冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。 动物：液氮处理后用匀浆器或者研钵破碎。 细胞器DNA：首先纯化细胞器。
以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂
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2）破碎抽提核酸除去杂质 ➢ 首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与其它
主要存在于细胞核的染色体中。 核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA
（cpDNA），质粒DNA。
RNA（核糖核酸）
存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNA等。
除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬 菌
体，其或只含DNA，或只含有RNA。
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三、动物基因组DNA的提取
（3）苯酚抽提法:
苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用。
用苯酚处理匀浆液时, 由于蛋白与DNA 连接键已断, 蛋白分子表面又 含有很多极性基团与苯酚相似相溶。
蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次 重复操作，再合并含DNA 的水相。
成分分离 ➢ 使核酸与蛋白质分离 ➢ 除去脂类 ➢ 多糖的除去
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3）核酸的纯化
根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染, 并除去提取过程中的系列试剂(盐、有机溶剂等）
杂质，最后得到均一的核酸样品。
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4）核酸样品的保存
核酸保存的主要条件是温度和介质
温度： 4℃ 样品经常使用 -70℃是长期保存的良好温度，为一次性保存 -20℃保存,避免反复冻融
实验一、动物组织基因组DNA提 取
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实验一 动物基因组DNA的提取 一、实验目的
➢ 学习和掌握从动物组织或细胞中提取核酸的原理和操 作技术
➢ 了解提取DNA的几种方法，原理和优缺点
➢ 学习测定DNA含量和质量的基本原理及方法
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二、实验原理
1、核酸的分类 DNA (脱氧核糖核酸)
如：SDS、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、萘-1.5-二磺酸 钠、三异丙基萘磺酸钠
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核酸制备中常用的蛋白质变性剂
作用： 1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造
成蛋白污染。
2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。
3.某些蛋白质变性剂也有抑制 RNase活性和破裂细胞的作 用。 如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC
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核酸制备中常用的酶 DNase:降解DNA RNase：降解RNA 蛋白酶K：降解蛋白质
溶菌酶：破碎细胞
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3. 核酸制备的一般步骤：
I.材料准备
破碎组织细胞
II.破碎细胞或包膜－内容物释放
提取
III.核酸分离、纯化
纯化
IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质
V.核p酸pt课溶件. 解在适量缓冲液或水中 14
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2、核酸制备的一般原则 核酸的理化性质
在细胞内通常与蛋白质结合，以复合物形式存在 微溶于水，不溶于乙醇，氯仿等有机溶剂 在酸性溶液中容易降解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。 DNA溶液粘度很大，RNA的粘度较小
在强大离心力的作用下，可以从溶液中沉降下来
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2、核酸制备的一般原则
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常用的RNA酶抑制剂
• 焦磷酸二乙酯（DEPC）
抑制强烈、不彻底
• 异硫氰酸胍
有效抑制、分解核蛋白
• 氧钒核糖核苷复合物
有效抑制
• RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin） 有效抑制
• 其它：SDS、尿素、硅藻土等
有效抑制
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核酸制备中常用的去垢剂
核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸 提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂。 去垢剂的作用： 1．溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂； 2．溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出 来； 3．对RNase、DNase有一定的抑制作用。
3) 离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相 中间，而DNA位于上层水相中
4) 用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来.
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三、动物基因组DNA的提取
（2）阴离子去污剂法:
用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性, 可以直接从生物材料中 提取DNA。
由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合, 而阴离子 去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA。