6动物组织细胞基因组DNA的提取和定量
动物组织细胞基因组DNA提取
动物组织细胞基因组DNA提取一、实验原理真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都能用来制备基因组DNA。
真核生物的DNA 是以染色体的形式存在于细胞核内，因此，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。
提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。
蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在下保持很高的活性。
在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离，EDTA则抑制细胞中Dnase的活性；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA 分子完整地分离出来。
二、仪器及试剂1. 仪器：恒温水浴锅、台式离心机、紫外分光光度计（GeneQuant）、移液器、玻璃匀浆器、离心管（灭菌）、吸头（灭菌）2. 试剂：（1）细胞裂解缓冲液：Tris (pH8.0) 100 mmol/LEDTA (pH 8.0) 500 mmol/LNaCL 20 mmol/LSDS 10%胰RNA酶20ug/ml（2）蛋白酶K：称取20mg蛋白酶k溶于1ml灭菌的双蒸水中，?C20℃备用。
（3）TE缓冲液（pH 8.0）：高压灭菌，室温贮存。
（4）酚?氯仿?异戊醇（25:24:1）、（5）异丙醇、冷无水乙醇、70%乙醇、灭菌水。
三、操作步骤1. 取新鲜或冰冻动物组织块0.1g（0.5cm3），尽量剪碎。
置于玻璃匀浆器中，加入1ml 的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入 1.5ml 离心管中，加入蛋白酶K （500ug/ml）20μｌ，混匀。
在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37℃水浴12～24h，间歇振荡离心管数次。
于台式离心机以12000 rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。
动物基因组DNA的提取流程总结
动物基因组DNA的提取1.切取组织5g 左右，用组织粉碎机或研钵将细胞分离。
注：1）少量结缔组织并不影响最后得到的DNA勺质量；2）若标本为血液，则只需肝素抗凝、离心后取白细胞层；3）若为培养的贴壁细胞，则用胰酶消化后收集，PBS洗涤即可。
2.加入5ml DNA提取缓冲液，（10mmol/L Tris-CI ,0.1 mol/L EDTA 0.5% SDS）, 混匀。
注：1）最好先加入Tris-Cl、EDTA再加入SDS 2）最好一边匀浆，一边加入液体，使之充分混匀。
3.加入25ul蛋白酶K,使终浓度达到100ug/ml，混匀，37C温浴过夜。
注：1）致密组织（如小鼠尾巴）可以适当延长蛋白酶的作用时间；2）若组织量很大且组织比较疏松（如动物脾脏），或对所提取的DNA完整性要求不高时，可以不用蛋白酶K,而是剧烈振荡20分钟，将组蛋白与DNA分离。
此法可能会使部分DNA链断裂，但足以达到一般实验要求，并不影响后续处理；3）也可同时加入RNase。
4.加入等体积的酚－氯仿－异戊醇混合物（25:24:1），剧烈振荡10分钟，冰浴10 分钟，2500rpm 10 分钟离心收集水相。
注：不要混带中间蛋白层。
5.加1/10 体积3mol/L NaAc 及 2 倍体积冰预冷的无水乙醇，颠倒混匀。
冰浴1小时，沉淀DNA注：冰浴时间从10分钟到2小时均可，只是时间太短会影响到最后的产量，但不影响质量。
6.用玻棒轻搅钩出DNA沉淀，置于另一离心管中。
注：如果确信没有混入蛋白，也可用离心的方法去除液体，但应在加入蛋白酶K的同时加入RNaseA7.70%^醇洗涤，晾干，加适量TE或灭菌水溶解，-20 C保存。
注：若要长久保存DNA（数年以上），最好将其沉淀以无水乙醇封闭后，置于-80 °C。
动物基因组DNA的提取
动物基因组DNA的提取[实验原理]在EDTA和SDS等去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提，可以得到哺乳动构基因组DNA，用此方法得到的DNA长度为100-150 kb，适用于L嘴菌体构建基因组文库和Southern分析。
通过本实验了解并掌握提取基因组DNA的原理和步骤，以及相对分子质量较大的DNA 的琼脂糖凝胶电泳技术。
[仪器、材料与试剂](一)仪器1.台式离心机2.玻璃匀浆器3．高压灭菌锅4．恒温水浴(二)材料1．1.5mL微量离心管2．微量取样器和吸头3．无菌过滤器(一次性)4．10 mL注射器5．鼠肝6．三羟甲基氨基甲烷(Tris)7.十二烷基硫酸钠(SDS)8．乙二胺四乙酸(EDTA)9．蛋白酶K10．RNA酶11．DNA相对分子质量标准物，DNA／EcoRI+HindⅢ相对分子质量标准物(三)试剂1、1.5 mol／L NaCl2、0.5 mol／L Tris·HCI pH8.03．0.5 mol／L EDTA pH8.04．3 mol／L NaAc pH5.2以上均高压灭菌。
5．蛋白酶K 10mg／mL配好后用一次性过滤器过滤，-20 保存(教师配制)6.组织匀浆液100mmol／LNaCI，10mmol／LTris·HCl(pH 8.0)，0.25mmol／LEDTA(pH8.0)7．酶解液200mmol／LNaCI，20mmol／L Tris·HCI(pH 8．O)，50mmol／LEDTA(PH 8.0)，200~g／mL蛋白酶K，1％SDS8．无DNA酵的RNA酶：将胰RNA酶溶解于10mmol／L Tris.HCI(pH7.5)、15 mmol ／L NaCl溶液中，浓度l0mg／mL，于100℃水浴处理15min，以降解DNA酶，缓慢冷却到室温，-20℃保存9．TE缓冲液：10mmol／LTris·HCl(pH8.0)，25 mmol／LEDTA(pH8.0)10．平衡酚(pH8.0)：氧仿：异戊醇=25：24：1<体积比)11．氧仿：异戊醇=24：l(体积比)12．5xTBE 5．4gTris，2．75g硼酸2mL 0.5mol／L EDTA(pH8.0)，加水到100mL；13．6x上样缓冲液o．25％溴酚蓝，40％(W／V)蔗糖水溶液14．λDNA／EcoRI+／HindⅢ相对分于质量标准物片段(bP)21 227，5148，4 973，4 268，3 530，2 027，1 904，1 584，1 315，947，831，564，125[实验步骤]本实验在无液氮的条件下，铡备鼠肝DNA，与有液氮条件下相比，产量和质量都有所下降。
动物组织基因组DNA的分离纯化及鉴定
动物组织基因组DNA的分离纯化及鉴定郝春霖（武汉大学药学院，2009302590232）摘要：采用盐溶法和有机溶剂抽提分离纯化猪肝基因组DNA，并利用紫外吸收和二苯胺显色法进行核酸定量和纯度测定。
制备的样品A260/ A280值在1.8附近，纯度较高。
但由紫外吸收法数据计算出样品DNA浓度远大于二苯胺显色法的计算结果，本文对数据差异做了相关讨论。
Abstract：The genomic DNA of poker liver were isolated and purified by salting-in and organic agent extraction method. In order to determine the quantitative and to test the fineness of our sample, it has been reacted with diphenylamine to produce the color product and exposed to the UV to find its O.D value. The A260/ A280 value of the sample is about 1.8, which indicates itself highly purified. However, the data of the two different methods are so different that it confuses us. This essay discusses the differences deeply and analyzes the reasons for the results.关键词：猪肝盐溶法抽提基因组DNA 紫外吸收法二苯胺Key words:poker liver salting-in method extract genomic DNA UVpcx diphenylamine引言：制备组织基因组DNA在基因结构和功能的研究中扮演着重要角色，是分子生物学研究中最重要的实验操作技术之一，样品分离纯化的程度对后续实验结构起到决定性作用；而不同种类生物的基因组DNA提取方法各异，同一生物的不同组织或器官也因其细胞结构及成分差异，而需采用不同的提取方法。
动物组织基因组DNA的提取
实验一动物组织基因组DNA的提取一、实验目的掌握从动物组织中提取总DNA的方法。
二、实验原理DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，为了进行测序、杂交、基因表达、文库构建等实验，获得高分子量和高纯度的基因组DNA是非常重要的前提，因此基因组DNA的提取也是分子生物学试验技术中最重要、最基本的操作之一。
染色体存在于细胞核中，外有核膜及胞膜。
从组织中提取DNA必须先将组织分散成单个细胞，然后破碎胞膜及核膜，使染色体释放出来，同时去除与DNA结合的组蛋白及非组蛋白。
整个实验可分为细胞裂解、DNA分离与纯化和DNA 的洗脱收集。
1.细胞裂解：酶法（蛋白酶K）。
2. DNA 分离与纯化：细胞破碎后，常使用吸附材料结合方法去除杂质和纯化DNA，主要有硅基质材料、阴离子交换树脂和磁珠等。
本实验采用TIANGEN血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒中的硅基质材料的离心吸附柱。
硅基质材料吸附核酸的原理，主要利用DNA在高盐低pH值环境下与硅基质材料相结合，在低盐高pH值环境下与硅基质材料脱离的特征，高效、专一吸附DNA，可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。
三、材料、试剂和设备1.材料：动物组织2.试剂：TIANGEN血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，无水乙醇等3.设备：离心机，微量移液器等四、实验步骤1.处理材料：取动物组织10mg，尽量切碎，加200μl 缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。
2.加入20μl蛋白酶K溶液，混匀后56℃水浴，直至组织溶解（不同组织裂解时间不同，通常需1-3小时即可完成）。
简短离心以去除管盖内壁的水珠，再进行下一步骤。
（细胞裂解）3.加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁水珠。
（溶解DNA）注意：加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀，一般70℃放置时会消失，不会影响后续实验。
如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA 量少和提取出的DNA不纯。
动物组织基因组DNA提取
动物组织DNA提取1样品预处理取新鲜组织25-50mg（组织不宜过多，否则裂解不完全堵塞离心柱），组织剪碎或者切成小块，放入预冷研钵，快速加入液氮用力研磨，或直接放入匀浆器中匀浆。
冻存组织同样使用研钵研磨或匀浆器快速用力研磨或匀浆（冻存组织避免反复冻融，使细胞破碎，内源酶外泄影响基因组DNA提取）2.加入100ulPBS到研磨好的样品中，样品均匀悬浮于PBS3.加600ul的Lysis Buffer，颠倒混匀，如需消化RNA，可加入20ulRNase A，颠倒混匀，室温放置5min4.加入10ul ProteinaseK，混匀，56度水浴45-60min，（颠倒混匀数次，裂解完全液体则清亮粘稠，此步骤可过夜）5 .12000rpm 离心10min，上清转入新的离心管，加800ul无水乙醇，混匀6.液体分次转入离心柱（一次加不完可分次加入），12000rpm 离心1min，弃废液。
7.加入700ulWash bufferA（用前检查是否已加入无水乙醇），12000rpm 离心30s-1min，弃废液。
8. 加入700ulWash bufferB（用前检查是否已加入无水乙醇），12000rpm 离心30s-1min，弃废液。
9.加入500ulWash bufferB，12000rpm 离心30s-1min，弃废液。
10.再次12000rpm 离心2min，将离心柱置于心得离心管中，打开离心柱盖，于室温或37度恒温箱放置5-10min，直至无明显乙醇味。
11.在硅基质膜中央加入50-200ulTEbuffer（事先预热55-65度）置于室温2-5min，12000rpm 离心30s。
12. 离心得到的溶液再次加入离心柱中，室温放置2min，12000rpm 离心2min，所得溶液为纯化后的基因组DNA.纯化效果检测：取2-5ulDNA产物，0.7%agarose电泳检测DNA分子的完整性和紫外分光光度计检测浓度和纯度。
动物组织细胞基因组DNA提取
动物组织细胞基因组DNA提取一、实验原理真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都能用来制备基因组DNA。
真核生物的DNA 是以染色体的形式存在于细胞核内，因此，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。
提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。
蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在下保持很高的活性。
在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离，EDTA则抑制细胞中Dnase的活性；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA 分子完整地分离出来。
二、仪器及试剂1. 仪器：恒温水浴锅、台式离心机、紫外分光光度计（GeneQuant）、移液器、玻璃匀浆器、离心管（灭菌）、吸头（灭菌）2. 试剂：（1）细胞裂解缓冲液：Tris (pH8.0) 100 mmol/LEDTA (pH 8.0) 500 mmol/LNaCL 20 mmol/LSDS 10%胰RNA酶20ug/ml（2）蛋白酶K：称取20mg蛋白酶k溶于1ml灭菌的双蒸水中，?C20℃备用。
（3）TE缓冲液（pH 8.0）：高压灭菌，室温贮存。
（4）酚?氯仿?异戊醇（25:24:1）、（5）异丙醇、冷无水乙醇、70%乙醇、灭菌水。
三、操作步骤1. 取新鲜或冰冻动物组织块0.1g（0.5cm3），尽量剪碎。
置于玻璃匀浆器中，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml 离心管中，加入蛋白酶K （500ug/ml）20μl，混匀。
在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37℃水浴12～24h，间歇振荡离心管数次。
于台式离心机以12000 rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。
动物组织中DNA的提取与鉴定
实验目的
1. 掌握动物组织中DNA提取的原理和操作过程 2. 了解DNA的组分，掌握DNA的定性检测的具 体方法 3. 掌握DNA纯度检测和浓度测定方法
实验原理—DNA提取
动物组织细胞中的核糖核酸(RNA)与脱氧核糖 核酸(DNA)大部分与蛋白质结合形成核蛋白。 RNA核蛋白和DNA核蛋白在不同浓度氯化钠溶液 中的溶解度有显著区别。DNA核蛋白在0.14 mol/L 氯化钠中溶解度低，但在1 – 2 mol/L氯化钠中溶 解度高；RNA核蛋白在0.14 mol/L氯化钠中溶解度 仍有相当大的溶解度。调节氯化钠浓度，可使 RNA核蛋白和DNA核蛋白分步提取开来。
实验原理—DNA提取
氯仿-异戊醇溶液可以使核蛋白变性沉淀，将核酸 物质萃取出来；再向萃取液中加入适量乙醇，可 使DNA析出。氯仿异戊醇抽提和乙醇沉淀方法在 DNA纯化研究中非常常用，氯仿-异戊醇抽提的原 理是，氯仿可使蛋白质变性并加速有机相与液相 分层；异戊醇有助于消除抽提过程中产生的气泡。 而DNA不溶于乙醇等有机溶剂，因此可以通过乙 醇沉淀来纯化和浓缩DNA。
实验原理—DNA鉴定
DNA是由脱氧核糖核苷酸单体构成，其组成部分包括磷酸、 有机碱（嘌呤与嘧啶）、戊糖（脱氧核糖）。
1）磷酸
钼酸铵
磷钼酸
Vc 或 氨基萘酚磺酸 钼蓝
（显蓝色） 2）嘌呤碱
硝酸银
嘌呤银化合物（灰褐色、絮状）
3）脱氧核糖 蓝色化合物
硫酸
ω-羟基-γ-酮基戊醛
二苯胺
实验试剂 1. 含有0.14 mol/L NaCl的0.015 mol/L柠檬酸 钠溶液 2. 1mol/L NaCl溶液 3. 氯仿-异戊醇（24 : 1, V/V） 4. 95%乙醇 5. 氨水溶液 6. 5% AgNO3溶液
实验六哺乳动物基因组DNA的提取
• 实验材料与试剂：
• 材料：家兔的全血 • 器材：移液器、高速冷冻离心机、
台式离心机、水浴锅等。试源自：1、提取DNA所需的试剂配制
1 M Tris· Cl（pH 8.0） 0.5M EDTA（pH 8.0） 10% SDS STE 氯仿:异戊醇（24:1） 3M无水NaAc（pH5.2） TE缓冲液（pH8.0） 抗凝剂ACD PBS 0.5M NaCl 20 mg/ml 蛋白酶K 酚:氯仿（1:1） 冰乙醇
2、琼脂糖电泳所用的有关试剂
10×TBE缓冲液, 1.2%琼脂糖, 琼脂糖凝胶加样缓冲液, 10mg/ml溴化乙锭（EB）。
实验步骤
1、基因组DNA的提取
将冰冻的家兔血液在室温下溶化； 取0.6ml血液转入一无菌的1.5ml离心管中，加入等体积 的PBS磷酸盐缓冲液，充分混匀后12000rpm离心5min， 弃上清； 加入400µ l STE，14µ l的20%的SDS，37℃水浴1h； 加8µl的20mg/ml的蛋白酶K混匀，55℃水浴消化过夜 （10～14h）；
实验六 哺乳动物基因组DNA的 提取及琼脂糖凝胶电泳检测DNA
6学时
• 实验目的：学习和掌握用酚-氯仿抽提法
提取哺乳动物的基因组DNA的方法。
• 实验原理：真核生物DNA提取的材料来源
可以是培养的细胞、血液、肝、脾、肾等 组织，通常的方法是在有EDTA和SDS等去污 剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚 /氯仿/异戊醇抽提，可能得到哺乳动物基 因组DNA，用此方法得到的DNA长度为100150kb。
观察琼脂糖凝胶中DNA最常用的方法是利用荧光染料溴化 乙锭进行染色，溴化乙锭含有一个可以嵌入DNA堆积碱基之间的 一个三环平面基团。它与DNA的结合几乎没有碱基序列特异性。 在高离子强度的饱和溶液中，大约每2.5个碱基插入一个溴化乙 锭分子。当染料分子插入后，其平面基团与螺旋的轴线垂直并 通过范德华力与上下碱基相互作用。这个基团的固定位臵及其 与碱基的密切接近，导致与DNA结合的染料呈现荧光，其荧光产 率比游离溶液中染料有所增加。 DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染 料本身吸收302nm和366nm的光辐射。这两种情况下，被吸收的 能量在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。由于溴化乙锭 -DNA复合物的荧光产率比没有结合DNA的染料高出20-30倍，所 以当凝胶中含有游离的溴化乙锭（0.5ug/ml）时，可以检测到 少至10ng的DNA条带。
基因组DNA提取
基因组DNA的提取一、从哺乳动物组织提取基因组DNA实验材料：液氮、消化缓冲液、PBS（冰冷）、25:24:1酚/氯仿/异戊醇、7.5M乙酸铵、无水乙醇及70%乙醇、0.1%SDS、RNA酶、TE缓冲液（pH8.0）、离心管、研钵、冷冻离心机。
实验步骤：1.取新鲜或冰冻动物组织块，剪成小块。
置于液氮中冻结。
2.将500mg的组织用预冷的研钵和研杵研碎，或用小锤子将其捣为细粉末，每100mg组织用1.2 mL消化缓冲液悬浮。
3.将6ml样品在盖紧的离心管中于50℃摇荡下温育12～18 h。
4.用6ml酚/氯仿/异戊醇抽提样品，1700g离心10 min。
如果样品溶解得不好，再加6ml不含蛋白酶K的消化缓冲液，并重复离心。
如果在界面上有一层厚的白色物质，重复有机抽提，将上层(水溶液)转移至一个新管中。
5.加入6ml 7.5M乙酸铵和24ml 100%乙醇，1700g离心2 min。
6.用70%乙醇洗涤，晾干，沉淀用TE缓冲液重新溶解，使终浓度在约1mg/mL左右。
7.加入0.1%的SDS和1pg/mL无DNA酶的RNA酶，37℃温育1h,以除去残留的RNA.重复步骤 4～5。
二、从植物组织提取基因组DNA实验材料：液氮/干冰、2-巯基乙醇(2-ME)、 CTAB抽提液、CTAB/NaCl溶液、24:1(v/v)氯仿/异戊醇、CTAB沉淀液、高盐TE缓冲液、80%乙醇、TE缓冲液、抗有机溶剂的试管和烧杯、研钵和研杵、粉碎器/匀浆器、捣碎机、恒温金属浴、冷冻离心机。
实验步骤：1.取1g的鲜叶组织，在3.2ml CTAB抽提液中加入0.8ml 2-巯基乙醇，使终浓度达2%(v/v)。
将此溶液及1ml CTAB/NaCl溶液加热至65℃。
2.用液氮(-196℃)或干冰(一78℃)冷却粉碎器/匀浆器，将植物组织粉碎成为细粉，然后将冷冻的组织转移到一个抗有机溶剂的试管或烧杯中。
3.往粉碎的组织中加入预热的2-ME/CTAB,混合使之充分湿润，65℃温育10～60min,不时混匀：4.用4ml的24:1氯仿/异戊醇抽提匀浆液，颠倒使充分混合，于4℃, 7500g离心5 min(对于小样品，在离心机上以10000 r/min离心),回收上(水)相。
小白鼠6种组织部位总DNA不同提取方法的比较
小白鼠6种组织部位总DNA不同提取方法的比较DNA是生物体的基本遗传物质。
基因组DNA的提取是分子生物学的基础试验操作，其提取效率和质量的好坏直接决定了后面一系列基因工程试验的成败，如基因分离、AFLP、RAPD、SSR等。
因此•学习、掌握DNA提取方法并对其迸行比较、总结，有利于后续试验的顺利开展。
国内外研究人员已经发现并使用了许多种DNA提取方法［2-7］，并且针对不同生物体的具体特点，对许多方法逬行了改良，摸索出适用于具体物种的高效方法［8-15］。
目前，传统的SDS法和CTAB 法由于其成本低廉、提取的DNA质量相对较好，在实际应用中仍占有主要地位。
随着生物技术的普及和应用，使用试剂盒提取基因组DNA逐渐增多［16-19］。
基因组提取试剂盒具有操作简便、节省时间等独特优势，但是对于一般的实验室、特别是普通高等学校来说，由于价格较为昂贵，在很大程度上限制了其使用范围；尤其对刚接触分子生物学试验的初学者，只知道按照说明书流程操作，不了解试剂的化学成分、具体配制方法及作用，不利于理解、掌握试验的基本原理，动手能力差、试验技能得不到提高，最终出现一旦离开试剂盒，什么试验也不会做的情况。
本试验以普通试验动物小白鼠作为提取基因组DNA的材料，选取小白鼠的6个组织部位，分别是肝、脾、肾、尾、肺和心脏，采用提取基因组DNA的经典方法SDS法和CTAB法，提取小白鼠的基因组DNA，并对其质量、浓度、纯度进行检测，从中筛选出经济、简便、易于操作、质量良好的基因组DNA，这对于今后的试验教学和科研工作具有重要的指导作用。
1材料和方法1.1材料1.1.1试验材料小白鼠购自沈阳医学院实验中心。
1.1.2试剂dNTP 'DNA Marker 高保真酶均购自宝生物工程（大连）有限公司‘引物于Invitrogen北京分公司合成» CTAB和SDS法提取液配制所需药品购自Sigma，其余所用的化学试剂（氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇等）均为国产分析纯试剂。
动物基因组dna_rna 提取及含量测定
工业上常用稀碱和浓盐酸法提RNA，用这 ， 工业上常用稀碱和浓盐酸法提 两种方法提取的核酸均为变性RNA。主要 两种方法提取的核酸均为变性 。 用于制备核苷酸的原料。其工艺较简单， 用于制备核苷酸的原料。其工艺较简单， 浓盐法是用10％氯化钠的溶液， 浓盐法是用 ％氯化钠的溶液，在90摄氏 摄氏 度提取3—4小时，冷却，离心，上清液乙 度提取 小时，冷却，离心， 小时 醇沉淀RNA。稀碱法用 醇沉淀 。稀碱法用0.2％氢氧化钠是 ％ 酵母裂解，然后酸中和，除蛋白和菌体， 酵母裂解，然后酸中和，除蛋白和菌体， 上清液乙醇沉淀的RNA ,或调核酸等电点 上清液乙醇沉淀的 或调核酸等电点 PI2.5沉淀。 沉淀。 沉淀
DNA含量的测定 含量的测定
原理：
强酸、加热条件下，可以使DNA中的嘌呤碱基与脱氧核 糖间的糖苷键断裂，而产生嘌呤碱基，脱氧核糖与嘧啶核 苷酸。其中 2ˊ脱氧核糖在酸性环境中成为ω― 羟基 ―γ― 酮基戊醛，此物与二苯胺反应生成蓝色化合物，在595nm 处有最大吸收。DNA在40-400µg范围内光密度与DNA浓度 成正比。在反应液中加入少量乙醛可提高灵敏度，而且其 他化合物的干扰也显著降低。当样品含少量RNA时不影响 测定，而蛋白质、多种糖及其衍生物芳香，羟基醛都能与 二 苯 胺 形 成 各 种 有 色 物 质 ， 干 扰 测 定 。
思考题
二苯胺法测定DNA，为什么加乙醛，作用是什 么？ 除杂质常用那些方法？
经常采用三种方法去除蛋白
用SDS等去污剂使蛋白质变性，可以直接从生物材 料中提取DNA 苯酚法：用含水的酚溶液沉淀蛋白质和DNA，分层、 DNA 离心蛋白变性，因而抑制了核酸酶活性，并且操 作过程比较缓和，可以得到较好的DNA制品 用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白，使乳化， 离心除蛋白，DNA在上层水相，用乙醇沉淀上层， 可将DNA沉淀出来
动物组织基因组DNA的提取
二、实验原理
7、核酸样品的保存
核酸保存的主要条件是温度和介质 温度： ① 4℃ ——最佳最简单； ② -70℃——长期保存的良好温度； ③ -20℃ ； 保存介质： TE缓冲液（最常用） 10mmol/L Tris-HCl pH 8.0 1mmol/L EDTA pH 8.0
三、实验试剂、仪器和耗材
6、核酸制备的步骤 破碎细胞
提取
纯化
二、实验原理
6、核酸制备的步骤 破碎细胞
① 微生物：溶酶菌、SDS裂解； ② 高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。 酶法——蛋白酶、胰蛋白酶； 冰冻法 —— 反复冻融或液氮冻后 组织捣碎； ③ 动物：液氮处理后用匀浆器破碎； 以上原理
2、核酸制备的一般原则
核酸制备时应注意的事项： ① 尽量简化操作步骤，缩短提取过程； ② 减少化学因素对核酸的讲解； ③ 减少物理因素的核酸的讲解：机械剪切力和 高温； ④ 防止核酸的生物讲解；
二、实验原理
3、核酸酶的抑制和抑制剂
降低温度，改变pH值，及盐的浓度，都利于对 核酸酶活性的抑制，但均不如用核酸酶抑制剂更 有利，几个条件并用更好。 DNA ，抑制 Dnase 活力很容易，但防止机械拉 力张力更重要； RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但 抑制 Rnase 活力较难，故在 RNA 提取中设法抑制 Rnase更重要。
二、实验原理
4、核酸制备中常用的去垢剂
核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质， 用于核酸提取的去垢剂一般都是阴离子去垢剂， 去垢剂的作用： ① 溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂； ② 溶解核糖体上面的蛋白，使其解聚，将核酸 释放出来； ③ 对Rnase和Dnase有一定的抑制作用； 如: SDS，脱氧胆酸钠，4-氨基水杨酸钠，萘-1， 5-二磺酸钠等
实验一 动物肝脏组织中基因组DNA提取和鉴定
微溶于低盐溶液（0.14mol/L）
RNA-Pro(RNP) 溶于低盐溶液（0.14mol/L） (存在于核仁及细胞质) 微溶于高盐溶液（1mol/L）
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三、仪器和试剂
1、仪器： 低速离心机、落地式高速冷冻离心机、摇床、稳 压电源、电泳槽、凝胶成像系统。 2、试剂： 0.14mol/L NaCl－0.15mol/L EDTA(pH=8.0)； 2.5mol/L NaCl；25% SDS；氯仿/异戊醇=24:1 （V/V）；95%乙醇；1×TAE；琼脂糖；上样缓冲液。
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四、实验步骤
1、DNA的提取 （4）将上述沉淀转移至100mL锥形瓶中，加入10mL预冷的 0.14mol/L NaCl-0.14mol/L EDTA溶液，缓慢搅拌，同时加 入750uL 25%SDS溶液，用封口膜封口，置于摇床中，30℃ 150r/min震荡30min。 （5）加入7mL 2.5mol/L NaCl，用封口膜封口，置于摇床中， 30℃ 150r/min震荡10min。 。 （6）再加入17mL 氯仿:异戊醇溶液，用封口膜封口，置于 摇床中，30℃ 150r/min震荡20min。 。
离子去污剂法：利用SDS、CTAB（十六烷基三甲基溴化
铵）等去污剂使蛋白质变性，直接从生物材料中提取 DNA。
苯酚抽提法：苯酚既是蛋白变性剂，又能抑制DNase的 降解。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA连接键已 断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。 蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。
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四、实验步骤
1、DNA的提取 （7）将混合液转移至50mL刻度离心管中， 3500r/min离心 10min ，取上清至一个新的50mL刻度离心管。 （8）加入20mL95%乙醇溶液，上下颠倒混匀后，出现丝状 物，用枪头挑取丝状物，或者3500r/min离心5min 。 （9）弃去上清液（注意：缓慢倒去上清液），沉淀物质即 为DNA，空气干燥后即可加入适量的TE缓冲液。
从动物组织中提取基因组DNA
从动物组织中提取基因组DNA（一）实验目的通过实践操作与实验实践掌握从动物组织中提取DNA的基本原理和基本方法。
(二) 实验原理在EDTA和SDS等去污剂存在下，用蛋白酶K笑话细胞，随后用酚抽提，可以得到哺乳动物基因组DNA，用此法得到的DNA长度为100-150kb，适用于噬菌体构建基因组文库和DNA 印迹分析。
（三）试剂、材料、仪器与器材1. 试剂与材料1)Tris–HCL 1mol/L PH8.0 50ml配制方法：40ml双蒸水，6.057g固体Tris放入烧杯中溶解，用浓盐酸调PH值到8.0，转移到50ml 容量瓶中，加入双蒸水定容，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4℃保存备用。
2)生理盐水: 0.85%NaCL 100ml配制方法：在20ml双蒸水中溶解0.85g固体NaCL，加水定容至100ml，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4℃保存备用。
3)EDTA 0.5mol/L PH8.0 50ml配制方法：将9.08g的EDTA·Na2·2H2O溶解于40ml双蒸水，用1g的NaOH颗粒（慢慢逐步加入）调PH值到8.0，用50ml容量瓶定容，如果EDTA难溶，先加NaOH溶解，然后逐步加EDTA·Na2·2H2O。
4)TES缓冲液（释放DNA） 100ml配制方法：将0.5844g的5 mol/lNaCl溶解于80ml双蒸水，在分别加入1ml的0.5 mol/l EDTA、0.2ml的Tris-HCl (pH=8.0)，加定容至100ml, 摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4℃保存备用。
5)10% SDS（变性剂破细胞壁）100ml配制方法：将10g的十二烷基硫酸钠（SDS）溶解于80ml双蒸水于68℃加热溶解，用浓HCl调至PH=7.2，定容至100ml，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，4℃保存备用。
实验五、动物细胞DNA的提取与鉴定
DNA酚抽提法示意图
主要试剂的作用：
EDTA：（乙二胺四乙酸）
EDTA起两个作用：（1）鳌合细胞膜和骨架上的Ca2＋、Mg2＋ ，从而使细胞
更易破碎；（2）鳌合Mg2＋ 使得内源性DNase没有Mg2＋ 不能发挥作用，保持DA
的稳定性，Tris起缓冲pH值的作用
SDS ：十二烷基硫酸钠
SDS是离子型表面活性剂，主要作用是：（1）破坏细胞膜及核膜；（2）解聚细 胞中的核蛋白；（3）与蛋白质结合，使蛋白质变性而沉淀下来；（4）抑制DNA酶 活性，使DNA分子尽量完整地分离出来
TE缓冲液(pH8.l(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0), 室温保存；
氯仿-异戊醇（23：1）：体积23:1 其它试剂：Tris饱和酚（购买）、无水乙醇、75%乙醇，琼脂糖粉。
四、实验方法与步骤
1.30-40ul血液+470ulSET+12.5ul20%SDS+6ul蛋白酶K 摇匀，55℃水浴过夜（按顺序加）； 2.加苯酚500ul,10min摇匀,离心10000r/min 10min； 3.抽上清，加500ul氯仿异戊醇（23：1）,20min摇匀,离心 10000r/min 10min；(重复1次） 4.抽上清,加无水乙醇（冰冻）1000ul,摇匀，冷冻于-20℃ （20分钟以上），离心10000r/min 2min； 5.弃上清，75%乙醇1000ul，离心10000r/min 2min； 6.弃上清，55℃烘干，加TE300ul溶解DNA沉淀或（加300ul 去离子水，溶解后电泳），4℃保存或电泳。 冷冻20min-2h，烘干30min左右，TE(可换做的ddH2O)
实验五 动物细胞DNA的 抽取与鉴定
指导：刘满清
动物基因组DNA、总RNA的提取及含量测定
地衣酚 (orcinol)，又称“3，5-二羟基甲苯”、“5-甲基间苯二酚”、“苔黑酚”。化学 式C7H8O2.H2O。
原理：当RNA与浓盐酸共热时，即可发生降解，形成核糖继而转变成糠醛，后者与地衣 酚反应，在Fe3+或Cu2+催化下，生成鲜绿色复合物，反应在670nm处有最大吸收峰， RNA浓度在20 ~ 200μg/mL范围内，光吸收与RNA浓度成正比。
等
思考题
RNA 提取方法有几种？有什么优 缺点？ RNA 提取过程中应注意什么？
DNA的提取及含量测定
在动植物中，小牛胸腺、动物肝脏、鱼类精子，植物种子的胚 中都含有丰富的DNA； 微 生 物 中 ， 面 包 酵 母 含 4% ， 啤 酒 酵 母 含 6% ， 大 肠 肝 菌 含 9%~10%。 本实验：将沉淀物溶解于生理盐水，加入去污剂十二烷基硫酸 钠（SDS）溶液，使DNA与蛋白质分离开。加入固体氯化钠使 其浓度达到1mol/L，使DNA溶解。加氯仿-异戊醇去除蛋白质， 也可重复该步操作得较纯DNA。最后用95%乙醇沉淀DNA。
• 除杂质：加等体积氯仿-异戊醇混合液，充分震荡10分钟， 8000 r/min离心7分钟，取上 层液量好体积，倒入烧杯中（离心管）（现象？），加同体积的氯仿-异戊醇混合液， 重复上次操作（现象？）。直至界面不出现蛋白凝胶为止；
• 沉淀：准确量取上清液体积， (1/10体积3mol/L NaAC溶液), 加2倍体积95％冷乙醇，搅 拌后，置冰箱静止冷却，待有白色丝状物出现，约10-15分钟，离心8000 r/min离心7分 钟，得白色沉淀（质量？）；
生物化学实验II
动物基因组DNA、总RN 的提取及含量测定
目的要求
• 学习和掌握从动物组织中提取核酸的原理和操作技 术；
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10.加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃ 或–20℃保存备用。
11.吸取适量样品于GeneQuant上检测浓度和纯度。
【注意事项】
标本必须新鲜，提取前细胞应保持完整。
所用EP管、吸嘴等器物及ddH2O、试剂 等应高压灭菌，操作尽量在4℃以下进行。 混匀试剂、吸取上清等操作时应避免动 作剧烈。 弃异丙醇时动作应轻，切忌甩干，以免 DNA丢失。
动物细胞基因组DNA的 提取及定量
真核细胞基因组DNA的分离纯化
核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中
都以与蛋白质结合的状态存在。
真核生物的染色体DNA为双链线性分子.
大多数生物体内RNA分子为单链线性分子
分离纯化核酸总的原则：
应保证核酸一级结构的完整性 排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染 无其他核酸分子的体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝 状物，用100ul 吸头挑出，凉干，用200ul TE 重新溶解。
4.加等量的酚·氯仿·异戊醇振荡混匀，
离心12000 rpm，5min。
5.取上层溶液至另一管，加入等体积的氯仿·异戊
醇，振荡混匀，离心12000 rpm，5min。
6. 取上层溶液至另一管，加入1/2体积的7.5mol/L
3. 对于很稀的核酸溶液，可用荧光光度法进行测 定。核酸经凝胶电泳后，在ＥＢ（溴化乙锭）中 浸染，核酸分子与溴化乙锭结合后， 能吸收300360nm波长的紫外光，同时诱发出波长为590nm 的红橙色荧光，从而可通过照像机摄影，凝胶成 像系统记录实验结果。此方法灵敏度高，10ng或 更少的DNA即可检出。
一、实验目的
掌握DNA定量的原理 掌握紫外分光光度仪的正确使用。
二、实验原理
1.
核酸分子（DNA或RNA）由于含有嘌吟环 和嘧啶环的共轭双键，在260 nm波长处有 特异的紫外吸收峰，其吸收强度与核酸的 浓度成正比，这个物理特性为测定核酸溶 液浓度提供了基础。
2. 紫外分光光度法还可通过测定260nm和 280nm的紫外线吸收值的比值（A260/A280） 估计核酸的纯度，纯的DNA制品的比值为1.8， RNA的比值为2.0, 若DNA高于1.8,则可能有 RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。 OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间，若比 值较高说明有残余的盐存在。
应去除RNA分子）。
分离核酸 应注意以下几点：
减少化学因素对核酸的降解
减少物理因素对核酸的降解
防止核酸的生物降解：
核酸提取的主要步骤：
破碎细胞，去除与核酸结合的蛋白质以及
多糖、脂类等生物大分子，去除其他不需 要的核酸分子，沉淀核酸以去除盐、有机 溶剂等杂质，最后得到纯化的核酸。
实验步骤
1.
2.
取新鲜或冰冻动物组织块0.1g（0.5cm3）， 尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，加入1ml的 细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入 1.5ml 离心管中，加入蛋白酶K （50ug/ml） 20μl，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴 30min。 匀浆后的液体700ul，离心12000rpm, 5min， 取上清液入另一离心管中
乙酸氨加入2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀 2min ，离心12000 rpm ,10min。
7.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上， 将附于管壁的残余液滴除掉。
8.用1ml 70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000 rpm ， 5min。 9.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上， 将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。