分光光度法
分光光度法
分光光度法
与不同波长相对应的吸收强度。
如以波长（λ）为横坐标，吸收强度（A）为纵坐标，就可绘出该物质的吸收光谱曲线。
利用该曲线进行物质定性、定量的分析方法，称为分光光度法，也称为吸收光谱法。
用紫外光源测定无色物质的方法，称为紫外分光光度法；用可见光光源测定有色物质的方法，称为可见光光度法。
它们与比色法一样，都以Beer-Lambert定律为基础。
上述的紫外光区与可见光区是常用的。
但分光光度法的应用光区包括紫外光区，可见光区，红外光区。
波长范围(1)200～400nm的紫外光区，(2)400～760nm的可见光区，(3)2.5～25μm(按波数计为4000cm<-1>～400cm<-1>)的红外光区。
、红外分光光度计或原子吸收分光光度计。
为保证测量的精密度和准确度，所有仪器应按照国家计量检定规程或本附录规定，定期进行校正检定。
基本原理当一束强度为I0的单色光垂直照射某物质的溶液后,由于一部分光被体系吸
收,因此透射光的强度降至I,则溶液的透光率T为:。
分光光度法
基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法，称为吸光光度法。包括：比色法、可见及紫外吸光光度法和红外光谱法。本章重点介绍：可见吸光光度法。在选定波长下，被测溶液对光的吸收程度与溶液中的吸光物质的浓度有简单的定量关系。吸收光波范围是紫外，可见和红外光区。它所测量的是物质的物理性质－物质对光的吸收，测量所需的仪器是特殊的光学电子学仪器，所以光度法不属于传统的化学分析法，而属于近代的仪器分析，这里只是按照我国现行教学习惯把可见光的光度法作为化学分析部分的一章。
(一)朗伯一比耳定律的推导
当一束平行单色光通过任何均匀、非散射的固体、液体或气体介质时，光的一部分被吸收，一部分透过溶液，一部分被器皿表面反射。设入射的单色光强度为I0，反射光强度为Ir，吸收光强度为Ia，透过光强度为It，则它们之间的关系为：
I0=Ir+Ia+It
因为λ射光常垂直于介质表面射λ，Ir很小(约为λ射光强度的4％)又由于进行光度分析时都采用同样质料，同厚度的吸收池盛装试液及参比溶液，反射光的强度是不变的。因此，由反射所引起的误差可校正，抵消。故上式可简化为：
ΔE=hc/λ
这里，ΔE=E2-E1，表示某一能吸级差的能量。由于不同物质的分子其组成与结构不同，它们所具有的特征能级不同，能级差也不同，所以不同物质对不同波长的光的吸收就具有选择性，有的能吸收，有的不能吸收。在电子能级发生变化时,不可避免地也伴随着分子的振动和转动能级的变化.分子光谱又成为带状光谱.
2、溶液有色的原因。
具有单一波长的光称为单色光，在可见光中，通常所说的白光是由许多不同波长的可见光组成的复合光。由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫这些不同波长的可见光按照一定的比例混合得到白光。进一步的研究又表明，只需要把两种特定颜色的光按一定比例混合，就可以得到白光，如绿光和紫光混合，黄光和蓝光混合，都可以得到白光。
分光光度法
第二节分光光度法(一)基础知识分类号：P2-O一、填空题1．分光光度法测定样品的基本原理是利用朗伯—比尔定律，根据不同浓度样品溶液对光信号具有不同的，对待测组分进行定量测定。
答案：吸光度(或吸光性，或吸收)2．应用分光光度法测定样品时，校正波长是为了检验波长刻度与实际波长的，并通过适当方法进行修正，以消除因波长刻度的误差引起的光度测定误差。
答案：符合程度3．分光光度法测定样品时，比色皿表面不清洁是造成测量误差的常见原因之一，每当测定有色溶液后，一定要充分洗涤。
可用涮洗，或用浸泡。
注意浸泡时间不宜过长，以防比色皿脱胶损坏。
答案：相应的溶剂(1+3)HNO3二、判断题1．分光光度计可根据使用的波长范围、光路的构造、单色器的结构、扫描的机构分为不同类型的光度计。
( )答案：正确2．应用分光光度法进行试样测定时，由于不同浓度下的测定误差不同，因此选择最适宜的测定浓度可减少测定误差。
一般来说，透光度在20％～65％或吸光值在0.2～0.7之间时，测定误差相对较小。
( )答案：正确3．分光光度法主要应用于测定样品中的常量组分含量。
( )答案：错误正确答案为：分光光度法主要应用于测定样品中的微量组分。
4．应用分光光度法进行样品测定时，同一组比色皿之间的差值应小于测定误差。
( ) 答案：错误正确答案为：测定同一溶液时，同组比色皿之间吸光度相差应小于0.005，否则需进行校正。
5．应用分光光度法进行样品测定时，摩尔吸光系数随比色皿厚度的变化而变化。
( ) 答案：错误正确答案为：摩尔吸光系数与比色皿厚度无关。
三、选择题1．利用分光光度法测定样品时，下列因素中不是产生偏离朗伯—比尔定律的主要原因。
( )A．所用试剂的纯度不够的影响B．非吸收光的影响C．非单色光的影响D．被测组分发生解离、缔合等化学因素答案：A2．分光光度计波长准确度是指单色光最大强度的波长值与波长指示值。
( )A．之和B．之差C．乘积答案：B3．分光光度计吸光度的准确性是反映仪器性能的重要指标，一般常用标准溶液进行吸光度校正。
分光光度法分类
分光光度法分类
分光光度法是一种常用的化学分析方法，它利用物质对特定波长的光的吸收来测定物质的浓度。
根据测定原理和测定范围的不同，分光光度法可以分为多种分类。
一、紫外可见分光光度法
紫外可见分光光度法是利用物质对紫外或可见光的吸收来测定物质浓度的方法。
它广泛应用于生物化学、环境监测、食品检测等领域。
紫外可见分光光度法的优点是测定灵敏度高，测定速度快，操作简便，但其缺点是对样品的透明度和颜色有一定的要求。
二、原子吸收光度法
原子吸收光度法是利用物质对特定波长的光的吸收来测定物质浓度的方法。
它广泛应用于金属元素的分析和测定。
原子吸收光度法的优点是测定精度高，测定范围广，但其缺点是对样品的处理要求高，操作复杂。
三、荧光光度法
荧光光度法是利用物质在受到激发后发出荧光来测定物质浓度的方法。
它广泛应用于生物化学、环境监测、食品检测等领域。
荧光光度法的
优点是测定灵敏度高，测定速度快，但其缺点是对样品的处理要求高，操作复杂。
四、化学发光光度法
化学发光光度法是利用化学反应产生的发光来测定物质浓度的方法。
它广泛应用于生物化学、环境监测、食品检测等领域。
化学发光光度
法的优点是测定灵敏度高，测定速度快，但其缺点是对样品的处理要
求高，操作复杂。
总之，分光光度法是一种非常重要的化学分析方法，它在生物化学、
环境监测、食品检测等领域都有广泛的应用。
不同的分光光度法有不
同的优缺点，我们需要根据具体的实验要求来选择合适的方法。
第十章 分光光度法
注：溶液的透光率T反映了物质对光的吸收程度， T越大表示它对光的吸收越弱；反之，T越小，表 示对光的吸收越强。
T 取值为0.0 % ~ 100.0 %
T
全部吸收
T = 0.0 %
全部透射 T = 100.0 %
2.吸光度： 为透光率的负 A lg I0 lg 1 ＝ lgT
（四）吸光系数 1．定义（物理意义）
一定条件下，吸光物质在单位浓度及单位液层 厚度时的吸光度，叫这个物质的吸光系数。
2．两种表示方法
(1) 摩尔吸光系数( ε )：表示一定波长下，吸光物质的溶液
浓度为1mol/L，液层厚度为1cm时，溶液的吸光度。
(2)百分吸光系数(
E1% 1cm
)：表示一定波长下，吸光物质的溶
黄 橙
红
/nm 颜色 400-450 紫
450-480 蓝 480-490 青蓝 490-500 青 500-560 绿 580-610 黄 610-650 橙 650-760 红
互补光 绿
黄 橙 红 紫 蓝 青蓝 青
物质的颜色与光的关系：
完全吸收
光谱示意 复合光
表观现象示意
完全透过
吸收黄色光
二.物质对光的选择性吸收
A. A~λ曲线
B. A~c曲线
C. A~V曲线
D. E~V曲线
4、紫外分光光度法中，为了使测定结果有较高 的灵敏度和准确度，入射光的波长应（ ）
A．最大吸收波长
B．最小吸收波长
检测器 作用：将光信号转换为电信号，并放大 光电管，光电倍增管
信号输出 表头、记录仪、屏幕、数字显示
第十章
1 光源
在紫外可见分光光度计中，常用的光源 有两类：热辐射光源和气体放电光源 热辐射光源适用350nm-800nm，用于可见 光区，如钨灯和卤钨灯；气体放电光源适 用150nm-400nm，用于紫外光区，如氢灯 和氘灯。
分光光度法的原理及应用
分光光度法的原理及应用1. 原理介绍分光光度法是一种常见的分析化学技术，用于测量溶液中化合物的浓度和吸收光谱。
分光光度法基于分子在特定波长下对光的吸收现象，通过测量被溶液吸收的光强度来确定溶液中化合物的浓度。
1.1 光吸收现象分子在特定波长的光照射下，能够吸收光的能量，使得分子内部电子发生激发跃迁，从基态到激发态。
这种吸收是根据化合物的分子结构和电子能级之间的能量差异来决定的。
1.2 分光光度计分光光度计是用于测量溶液吸收光强度的仪器。
它包含一个光源、一个选择特定波长的单色仪、一个样品室和一个光电探测器。
分光光度计能够通过测量样品吸收光的强度来确定溶液中的化合物浓度。
2. 应用分光光度法在许多领域中得到广泛的应用，包括环境监测、食品安全、药物分析等。
以下是一些常见的应用：2.1 环境监测分光光度法常被用于环境中有害物质的检测和监测。
例如，通过测量水样中某种化学物质的吸光度，可以确定水体中的污染程度。
这种方法在水质监测和环境保护中起着重要的作用。
2.2 食品安全分光光度法可以用于检测食品中的添加剂、农药残留物和重金属等有害物质。
常见的应用包括测量食品中的某种营养成分的含量以及检测污染物的浓度。
2.3 药物分析在药物研究和制造过程中，分光光度法用于测量药物的浓度和纯度，以及监测反应的进程。
这种方法是药物研究和制造中常用的一种分析手段。
2.4 生物化学分光光度法在生物化学研究中也具有重要的应用。
例如，通过测量生物样品中特定化合物的吸光度，可以确定样品中的含量，进而研究生物反应的机制和动力学。
3. 测量步骤以下是使用分光光度法测量溶液中化合物浓度的一般步骤：1.设置分光光度计的工作波长和仪器条件，根据所测化合物的特性选择合适的波长。
2.校准仪器，使用标准样品测量光强度。
根据标准样品的光强度和浓度的线性关系，建立校正曲线。
3.取待测样品，使用适当的溶剂将其稀释至合适的浓度范围。
4.在分光光度计中将样品放入样品室，调节波长和仪器条件。
分光光度法的概念
分光光度法是一种常用的化学分析方法，它利用物质对光的吸收、反射、散射等特性，通过测量光强度的变化来测定物质的浓度。
这种方法具有灵敏度高、操作简便、适用范围广等优点，因此在化学分析、生物分析、环境监测等领域得到了广泛应用。
分光光度法的原理是，当一束平行光通过某一均匀的溶液时，光线会被溶液中的物质吸收，导致光强减弱。
不同物质对光的吸收能力不同，因此可以通过测量光强度的变化来推算出物质的浓度。
这种方法被称为比色法或吸光光度法。
在分光光度法中，常用的仪器是分光光度计。
分光光度计由光源、单色器、样品池和检测器等部分组成。
光源发出的光线经过单色器后，被分解成不同波长的单色光。
样品池中的溶液会吸收这些单色光，导致光强减弱。
检测器将检测到的光信号转化为电信号，再经过放大和处理后，输出测量结果。
分光光度法的应用非常广泛。
在化学分析中，可以用于测定各种无机和有机化合物的浓度。
在生物分析中，可以用于测定蛋白质、核酸、酶等生物大分子的浓度和活性。
在环境监测中，可以用于测定水体中的重金属离子、有机物、营养物等污染物的浓度。
虽然分光光度法具有许多优点，但也存在一些局限性。
例如，对于某些物质，其吸收光谱可能与其他物质重叠，导致测量结果不准确。
此外，分光光度法只能测定溶液中的物质浓度，而不能直接测定固体样品中的物质含量。
因此，在实际应用中，需要根据具体情况选择合适的方法进行测定。
总之，分光光度法是一种重要的化学分析方法，它通过测量物质对光的吸收和反射等特性来推算出物质的浓度。
这种方法具有灵敏度高、操作简便、适用范围广等优点，因此在化学分析、生物分析、环境监测等领域得到了广泛应用。
同时，也需要根据具体情况选择合适的方法进行测定，以确保结果的准确性和可靠性。
分光光度法
光度法的优点
与目视比色法相比，光度法的优点： 1. 用光电仪器进行测量可消除轻度色盲、眼睛 疲劳等主观误差。 2. 有其他物质共存时，可选适当的入射光和参 比溶液来消除干扰，提高选择性。 3. 对于大批试样分析，校正曲线可简化手续， 提高分析速度。
2.3.2.测量条件的选择(1)
（1）选择合适的入射光 由于溶液对光的吸收是有选择性的，因此 必须选择溶液吸收最大的波长作为入射光的波 长。 （2）控制适当的吸光度范围 用光度计测量吸光度，都存在着误差。当 测量小于0.2和大于0.7吸光度时，误差会迅速 增加。为了使测量误差落在0.2～0.7之间，可 以控制试样的称取量。对于组分含量高的试样， 可减少称取量，或是稀释;对于含量低的溶液 可增加称样量或浓缩的方法来提高浓度。
图2－8 721分光光度计的光学系统
几种类型的分光光度计（ 几种类型的分光光度计（三）
图2－9 7530G紫外—可见光分光光度计
几种类型的分光光度计（ 几种类型的分光光度计（四）
图2－10 7530G紫外-可见分光光度计光学系统
检测器和读数装置 （2）
2. 光电管. 是一个二极真空管由一个阳极和一个光敏阴 极组成。 3. 光电倍增管。 是利用光敏阴极把光信号放大的装置。 4. 读数装置。 读数装置常用的是微安计或检流计。
几种类型的分光光度计（ 几种类型的分光光度计（一）
图2－7 721分光光度计
几种类型的分光光度计（ 几种类型的分光光度计（二）
2.分光光度法 2.分光光度法
光度可用光电比色计或分光光度计进 行测量。 测定时常用的是校正曲线法或比较法。
（1）校正曲线法
校正曲线法，又称工作曲线或标准曲线法。 当溶液厚度b固定时，吸光度A与溶液浓度c成 正比.取一系列不同浓度标准溶液（5－7图）， 分别测定其吸光度，以浓度c为横坐标，吸光 度为纵坐标，作校正曲线.试液用同样条件显 色，测定吸光度，从曲线上求得试液浓度。
分光光度法的基本原理
分光光度法的基本原理
分光光度法是一种常用于分析、确定物质浓度的方法。
其基本原理是将待测物质溶液通过一束光束，然后通过光学系统使光束分成两部分，分别通过样品液和对照液，最终两束光束再重合形成一个荧光强度差。
待测物质会对入射光束进行吸收，导致出射光束的强度减弱，而对照液不会对光束产生吸收作用，出射光束强度不变。
通过测量两束光的强度差异，可以推断待测物质的浓度。
分光光度法使用光栅或棱镜使入射光束通过色散，然后通过滤光片选择特定波长的光，再通过样品液和对照液后，出射光会被光电池或光电二极管接收，转化为电信号。
根据输出的电信号强度，可以计算出待测物质的浓度。
分光光度法的优点是测量精度高、灵敏度高、操作简便。
它可以在高浓度样品中进行测量，可以使用各种波长的光来进行分析。
然而，它也存在一些限制，例如对色散（波长漂移）的影响比较大，需要定期校准光谱仪器。
此外，分光光度法对于有色物质的测量更准确，对于无色物质的测量精度较低。
分光光度法
三、测量条件的选择
1、入射光波长的选择
一般应该选择λmax为入射光波长。
如果 λmax 附近有干 扰存在，选择灵敏度 稍低但能避免干扰的 入射光波长（曲线较 平坦处）
2、参比溶液的选择
❖ 选择参比溶液的原因
由于入射光的反射，以及溶剂、试剂等对光的 吸收会造成透射光通量的减弱。为了使光通量 的减弱仅与溶液中待测物质的浓度有关，需要 选择合适的溶液作参比溶液。
单色光和互补光
➢ 单色光：具有同一波长的光。 ➢ 复合光：含有多种波长的光。如:日光，白炽灯光。
➢ 可见光：400～760 nm
➢互补色光：适当颜色的两种色光按一定强度 比例可以混合成为白光，这两种色光叫做互 补色光。
一、物质的颜色
物质的颜色是由于物质对不同波长 的光具有选择性吸收而产生的。
物质的颜色显示其吸收光的互补色。
（2）不同浓度的高锰酸钾溶液，其吸收曲线的 形状相似，最大吸收波长λmax一样。在同一波 长下吸光度A有差异。物质定量分析的依据。
（3）不同物质其吸收曲线形状和λmax各不 相同，因此吸收曲线可以提供物质的结构信 息，物质定性分析的依据之一。
§3 光吸收的基本定律
一、朗伯-比耳定律 朗伯-比耳定律的数学表达式为：
3.工作曲线不过原点 存在系统误差：吸收池不完全一样；参比溶液选择 不当等。
第三节 紫外－可见分光光度计
一、仪器的基本组成部件
光源
单色器
吸收池
检测器 信号显示系统
1、光源
在使用波长范围内提供连续的光谱，光强应 足够大，有良好的稳定性，使用寿命长。
➢ 可见光光源：钨灯，辐射 波长范围325～2500nm。
有机显色剂：种类繁多
三元配合物显色体系：一种金属离子同时与两种不同 的配位体或一种配位体与两种不同的金属离子形成的 配合物
分光光度法
某一波长下的吸光度。
若溶液的组成用质量浓度表示。LambertBeer 定律可表示为： A = a ·b · ：质量浓度(g ·L-1) b：为液层厚度(cm) a：质量吸光系数(L · g-1 · cm-1) a 和 的换算关系为： =aM 吸光度A与透光率T： A =－lgT = ·b ·c T = 10 - bc
CuSO4溶液：之所以呈蓝色，是因为吸收了白光中的 黄光，透过其黄光的互补光蓝光。
又例如： KMnO4溶液，吸收了白光
中的绿光，透过的为其互补光紫色，故其 溶液呈紫色。
再例如：NaCl、KNO3溶液，对其射
入的可见光全不吸收，光全透过，因此溶 液为无色。
物质对光的吸收曲线
某一溶液对何种波长的光吸收？吸收的程度如 何？
这可通过使不同波长的光通过某一固定浓度 的有色溶液，分别测量每一波长下对应的光的 吸收程度[吸光度， A]， 作A-λ曲线，即吸收光谱曲线。
• 图中Ⅰ、Ⅱ、 Ⅲ三条曲线， 代表同一被测 物质含量由低 到高的吸收曲 线。
邻二氮杂菲亚铁溶液的吸收曲线
（1）同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸光
物质的颜色：
•
•
在可见光区(400~760nm)不同波长的光具有不同的颜色。
溶液呈现一定的颜色是对光选择性吸收的结果。当一束白光 通过一有色溶液时，某些波长的光被溶液吸收，另一些波长的 光则透过，溶液的颜色由透过光决定。
• 透射光与吸收光又可组成白光，这两种光称为互补色光。
溶液的颜色 ⑴溶液为什么会有颜色？ 溶液之所以呈现不同的颜色，是由于溶液中 的质点选择性地吸收某种颜色的光所引起的。 ⑵ 吸收光与溶液颜色的关系： 当白光通过某一均匀溶液时： ①如溶液对其全不吸收，光全透过，溶液为无色； ②如溶液对其全部吸收，无光透过，溶液呈黑色； ③如溶液对其部分吸收，其余光透过，溶液 呈透过光的颜色。
大学化学 分光光度法
A4 A3 A2 A1 用于溶液中多组分测定
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18
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三、对朗伯-比尔定律的偏离
根据朗伯－比尔定律，以A对c作图，应为一通 过原点的直线，通常称为工作曲线（或标准曲线）。 有时会在工作曲线的高浓度端发生偏离的情况，这种 现象称为对朗伯－比尔定律的偏离。
引起这种偏离的因素（两大类）： （1）物理性因素：单色光纯度不够； （2）化学性因素：溶液中化学反应
图中查出未知液的浓度。
A
Ax
c1 c2 c3 c4 c5 cx A1 A2 A3 A4 A5 Ax
cx
标准曲线图
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c
31
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例：Fe2+含量的测定
原理： Fe2+离子在pH=3～9的水溶液中与邻菲罗啉生
成稳定的橙红色的[Fe(C12H8N2)3]2+，本实验就是利用 该反应来测定溶液中的铁的含量。
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3
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一、 光的基本性质
光具有波粒二象性，即波动性、粒子性。
Ehh c
根据波长的不同，可分为： 紫外光区：200nm ～ 400nm 可见光区：400nm ～ 750nm 红外光区：750nm ～ 250μm
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4
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二、 物质对光的选择性吸收
1.光的互补
具有同一波长的光称为单色光。 不同波长组成的光称为复合光。
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21
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仪器
紫外-可见分光光度计
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22
本章目录
§11.4 显色反应和显色条件的选择
显色反应和显色剂
在分光光度分析中，常利用显色反应把待测组分X 转变为有色化合物，然后再进行测定。
分光光度法
吸收 外观有颜色的药物在可见光区有特征吸收 都可用紫外-可见分光光度法进行分析。
仪器
可见分光光度计
721型分光光度计
仪器
紫外-可见分光光度计
一、基本组成
光源
单色器
样品室
检测器
显示器
1. 光源
在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光
把分子吸收能量随波长变化的情况记录下来所得 的图谱为吸收光谱。
利用物质的吸收光谱进行定性、定量及结构分析 的方法称为吸收光谱法, 简称光谱法。
三、光的吸收定律
（一）百分透光率（T）和吸收度（A） 入射光 I0 → 吸收Ia → 透射It
I0 = Ia + It 透光率（描述入射光透过溶液的程度）
一、光的性质与波长范围
光的性质
光是一种电磁波，具有波粒二象性，即波动性和 粒子性。
光在传播时表现了光的波动性
一定的光波具有一定的波长 、频率 、光速c等 参数来描述:
c=
续前:
波长: 相邻两波峰或波谷之间的距离，波长的单位 可用纳米（nm），微米（um）表示:
1nm=10-3um=10-6mm=10-7cm=10-9m 频率（ ）: 是每秒内光波的振动次数，单位是
A=－lgT=ECL 朗伯-比尔定律适用于无色溶液、有色溶液及气
体和固体的非散射均匀体系。
（三）吸收系数
吸光物质在单位浓度、单位液层厚度时的吸收度。 A
E= CL
当溶液的浓度C的单位不同时，吸收系数的意义和表 示方法也不同，常用的表示方法有两种：
1、摩尔吸收系数：是指在一定波长下，溶液浓度为 1mol/L，液层厚度为1cm时的吸收度，用ε表示。
第七章分光光度法
第七章分光光度法【基本要求】1.1 掌握分光光度法基本原理—Lambert-Beer定律，能熟练运用Lambert-Beer 公式进行有关计算。
1.1 掌握吸光度、透光率、吸光系数、摩尔吸光系数的概念。
1.2 明确溶液颜色与光吸收的关系。
1.3 了解物质对光的选择性吸收及吸收光谱。
1.4 了解分光光度计的基本构造；提高测量灵敏度和准确度的方法。
1.5 了解紫外分光光度法进行物质定性分析和定量测定的基本原理。
【重点难点】2.1 重点分光光度法原理－Lambert-Beer定律。
紫外分光光度计的使用2.2 难点提高测量灵敏度和准确度的方法。
【讲授学时】4学时4.1 第一节概述一、比色分析法比色分析法：利用比较溶液颜色深浅的方法来确定溶液中有色物质的含量。
有色物质溶液颜色越深，浓度越大；颜色越浅，浓度越小。
二、比色分析法测定步骤①选择适当显色剂，使被测组分转变成有色物质，称为显色阶段。
测定无色溶液时要进行显色阶段。
②选择最佳条件测定溶液的深浅度，称为比色阶段。
三、发展过程：目视比色法→光电比色法→分光光度计（吸光光度法）四、比色与分光光度法的特点比色和分光光度法主要用于测定微量组分。
1、灵敏度高：测定试样中微量组分（1～0.001%）常用方法，甚至可测定10-4 ~ 10-5%的痕量组分。
2、准确度高：一般比色法相对误差为5～10%，分光光度法为2～5%，其准确度虽比重量法和滴定法低，但对微量组分的测定已完全满足要求。
如采用精密蓝450-480紫400-450红650-750青蓝480-490青490-500绿500-580黄580-600橙600-650白光分光度计，误差将减少至1～2%。
3、应用广泛：几乎所有的无机离子和许多有机化合物都可以直接或间接地用比色法和分光光度法进行测定。
4、操作简便、快速，仪器设备也不复杂。
例如：试样中含Cu 量为0.001%，即在100mg 试样中含Cu 0.001mg ，用比色法可以测出。
分光光度法(金)
3)应用
①标准曲线法 ②标准管法
①标准曲线法
特点：方便、快捷，适用于大批量样品处理
方法： a.标准曲线绘制
配制一系列与待测样品溶质相同的，浓 度由小到大的标准溶液，分别测OD值。
D
0
C
b. 未知样品浓度测定
D Dx
0
Cx
C
②标准管法
特点：相对准确，适用于少量样品处理
方法：设标准溶液，浓度已知，分别测样品和标准
溶液的OD值。
D测 = K L C测 D标准 = K L C标准
D测 C测 = D标准 ×C标准
4)分光光度法的优点
灵敏：能测定出溶液中含量极少的物质浓度 准确：误差小，与真实值非常接近 快速：操作步骤简单，较少时间内得出结果 简便：无需从溶液中分离待测样品
5)分光光度法所使用的仪器 ——分光光度计
③以酪蛋白含量为横坐标，OD值为纵坐标， 绘制标准曲线；
2. 未知样品浓度测定：
取5号管， 吸取1ml （1：10稀释）血清待测样, 用水补足至2ml，加入双缩脲试剂4ml，混匀后与 以上4管同时比色，从标准曲线查出其蛋白质浓度 ，按稀释倍数求出血清原液浓度。
3. 标准管法：
C测 =
D测 D标
×
实验一 用分光光度法 测定血清蛋白含量
【实验目的】
1.掌握标准曲线的制备方法和标准管法 的计算方法；
2. 掌握双缩脲法测定血清蛋白的原理和 方法。
【实验原理】
呈色反应 茚三酮反应
双缩脲反应 √
尿素被加热至 180℃左右时，两分子尿素缩合 放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性条 件下可与Cu2+结合生成复杂的紫红色化合物。 此反应称为双缩脲反应。
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荧光法最主要的优点是测定灵敏
度高，选择性好。
10 12
10
~ 10
g / ml
荧光激发光谱（激发光谱）
横坐标 纵坐标 激发光波长 荧光强度
荧光发射光谱（荧光光谱）
横坐标 荧光发射光波长
纵坐标
荧光强度
定量测定原理
当激发光强度、波长、所用溶剂
及温度等条件一定时，在较稀浓度范
围内药物的荧光强度与溶液中该物质
浓度、液层厚度关系定律
I A lg T lg ECL I0
A Ecl
摩尔吸收系数ε
A c% El
C= 1mol/L l= 1cm
1 % 百分吸收系数 E1cm
C=1%(g/100ml)
l= 1cm
二、紫外-可见分光光度计
1、光源 2、单色器 3、吸收池 紫外区 氢灯或氘灯
羰基：C＝O 1760、1695 苯环：C＝C 1610、1580
COOH OCOCH3
酯基：C—O 1310、1190
邻位取代苯环：N—H750
盐酸普鲁卡因
H2N
COOCH2CH2N(C2H5)2 HCl
氨基： NH NH2ຫໍສະໝຸດ 3315、3200
2585
N-H 1645
羰基：C=O 1692
C-O 醚
酯
＝CH 苯(单取代)
四、应用
（一）已知化合物的鉴别
1、对照品法（USP） 2、对照图谱法（ChP）
用本法鉴别药物时，中国药典要
求按指定条件绘制供试品的红外光吸 收图谱，与《药品红外光谱集》中的
相应标准图谱对比，如果峰位、峰形、
相对强度都一致时，即为同一种药物
阿司匹林 羟基：O—H 3300～2300
红外吸收光谱是由分子的振动及
转动能级的跃迁而引起的 将分子吸收红外光的情况用仪器
记录下来，就是红外光谱图
红外吸收光谱又称为分子的振-转光谱
一、基本原理
红外分光光度法是利用物质分子 吸收波数在4000～400cm-1范围的红外
光而产生的吸收光谱进行分析的方法，
由分子的振动、转动能级跃迁引起
纵坐标
透光率（T%）
01：83、红外分光光度法在药物的杂
质检查中主要用来检查 A、合成反应中间体
B、无紫外吸收的杂质
C、具有挥发性的杂质
D、金属的氧化物或盐
E、无效或低效的晶型
01：133.苯乙酮的红外图谱上有特征吸
收峰的区域是 A、1900~1650cm-1
B、 3300~3000cm-1
C、 1600~1580cm-1
A、需已知药物的吸收系数
B、供试品溶液和对照品溶液的浓度应接近
C、供试品溶液和对照品溶液应在相同的条
件下测定 D、可以在任何波长处测定 E、是中国药典规定的方法之一
97：131、用紫外分光光度法鉴别药物 时，常采用核对吸收波长的方
法，影响本法试验结果的有
A、仪器波长的准确度 B、供试品溶液的浓度 C、溶剂的种类 D、吸收池的厚度
入射光成直角方向上进行测定，这是由于
A、荧光的波长比入射光的波长长
B、荧光强度比透射光强度小 C、荧光强度比透射光强度大 D、只在入射光成直角方向上才有荧光 E、荧光是向多方向发射的，为了减少
透射光影响
96：74、荧光是指当用一定波长的紫外光
或可见光照射某一物质时，此物质会在短
时间内发射出
A、波长较照射光波长为短的光 B、波长较照射光波长为长的光 C、波长与照射光波长相等的光 D、波长较磷光波长为长的光
97：136、有一不饱和烃，如用红外光
谱判断它是否为芳香烃，主要依
据的谱带范围是
A、3100～3000cm1 B、3000～2700cm1 C、1950～1650cm1 D、1670～1500cm1
E、1000～650cm1
98：72、红外光谱图中1650～1900cm1
处具有强吸收峰的基团是 A、甲基
辨率
三、红外光谱与物质结构的关系
分子中每个基团一般都有相应的吸收 峰。药物分子的组成、结构、官能团不同
时，其红外光谱也不同。药物的红外光谱
能反映药物分子的结构特点，具有专属性
强、准确度高的特点，是验证已知药物的
有效方法。
特征区 4000 ～ 1300cm-1 疏，易辨认
指纹区 1300～400cm-1 密，高度敏感
95：[121—125]受影响的物理常数 A、吸收系数 B、比旋度
C、两者均可 121、受温度影响 B
D、两者均不可
1% E1cm
122、受光线波长影响 C
123、受供试品浓度影响 D 124、受时间影响 D
20 D
125、受溶剂种类影响 A
95：138、紫外分光光度计应定期检查
A、波长精度 B、吸收度准确性
A样 A对
C样 C对 A样 A对 C对
C样
2. 吸收系数法
1% A E1cm c l
C（g/100ml）
A
1% E1cm L
C（g/ml）
A
1% E1cm L 100
3. 计算分光光度法（多组分的测定） 双波长分光光度法
三波长分光光度法
导数光谱法 解联立方程法
E、供试品的纯度
99：133、紫外分光光度计是由以下部
件组成的 A、氘灯
B、光栅
C、石英吸收池
D、光电管
E、真空热电偶
01：78、含有某一发色团的药物，最
大吸收波长为230nm，其跃迁类型为 A、σ→σ*
B、π→π*
C、 n →π*
D、 n →σ*
E、以上跃迁类型都可能
例1、摩尔吸收系数的表示符号是
可见区
钨灯或卤钨灯
棱镜或光栅 石英或玻璃
4、检测器
光电池、光电管、光电
倍增管、光二极管阵列检测器
紫外-可见分光光度计的校正
波长 吸收度 汞灯、氘灯、钬玻璃 重铬酸钾的硫酸溶液
杂散光
碘化钠和亚硝酸钠溶液
吸收池误差
三、紫外-可见吸收光谱与结构的关系 （一） 紫外-可见吸收光谱
以波长为横坐标，以吸收度
C、狭缝宽度
D、溶剂吸收 E、杂散光
97：76、某药物的摩尔吸收系数（）很 大，则表示
A、光通过该物质溶液的光程长
B、该物质溶液的浓度很大 C、该物质对某波长的光吸收能力很强
D、该物质对某波长的光透光率很高 E、测定该物质的灵敏度低
97：127、紫外分光光度法中，用对照品比 较法测定药物含量时
苯环：C=C 1604、1520 酯基：C-O 1271、1170、1115
（二）药品的纯度检查
用于药物中无效或低效晶
型的检查 如 甲苯咪唑中A晶型的检查
无味氯霉素中A晶型的检查
（三）未知化合物的研究
（四）含量测定
仪器
UVVis
光源
氘灯或氢 灯,钨灯 或卤钨灯
单色器
棱镜或 光栅
吸收池
石英 玻璃
第五章
分光光度法
第一节
紫外-可见分光光度法
根据物质对波长为200～760 nm
波长范围的光吸收特性所建立的一种 定性、定量和结构分析的方法。
紫外-可见吸收光谱
分子的价电子吸收了光的能量，
由低能量的基态跃迁到高能量的激
发态，在相应波长位置出现吸收带
形成的光谱，称为紫外-可见吸收光
谱
一、基本原理
（一） Lambert -Beer定律 物质对单色光吸收特性与
C、1755cm1 D、1420cm1
COOH OH
E、3230cm1
96：71、有一种含氮的药物，如用红 主要依据的谱带范围为
A、3300～3000cm1 B、3000～2700cm1
外光谱判断它是否为腈类物质时，
C、2400～2100cm1
D、1900～1650cm1
E、1500～1300cm1
B、Lambert定律
C、Nernst公式
D、Van Deemter方程
E、Beer-Lambert定律
第二节
一、基本原理 荧光
荧光分析法
处于第一激发态的分子，
跃迁回基态时发射的光称为荧光，其
能量小于激发光，波长长于激发光； 除去激发光源，荧光立即熄灭
荧光为发射光。利用荧光的物理
特性进行定性与定量测定的方法称为 荧光分析法。
max mix
1% E1cm
A1 / A 2
注意
（1） 结构完全相同的化合物应有 完全相同的吸收光谱 （2） 吸收光谱完全相同的化合物
不一定是同一个化合物
（二）杂质检查中的应用 *利用药物与杂质吸收光谱的明 显差别，进行杂质检查 *在一定波长处测定A，规定A
（三）在含量测定中的应用
1. 对照品比较法
检测器
光电管 光电倍增管 光二极管阵 列检测器
RF
汞灯或 氙灯 硅碳棒 Nernst灯
滤光片 低荧光玻璃 光电倍增管 光栅(两个) 或石英池 光栅 KBr窗池 KBr压片 真空热电偶 高莱池
IR
95：137、乙酰水杨酸与水杨酸的红外
吸收光谱的主要区别是 A、1610cm1
COOH OCOCH3
B、1460cm1
B、羰基
C、羟基 D、氰基
E、苯环
00：[116～120] A．紫外可见光谱 B．红外光谱
C．两者均是
D．两者均不是
116. 由振动能级跃迁引起的 B
117. 由n →π*跃迁引起的 A
118. 通过振动弛豫回到第一激发态，再
跃迁回基态所引起的 D
119. 符合Beer-Lambert定律 A 120. 采用真空热电偶作检测器 B