肿瘤标志物检测的质量保证

肿瘤标志物检测的质量保证一、肿瘤标志物的定义肿瘤标志物（tumor marker，TM）是指在肿瘤的发生和增殖过程中，由肿瘤细胞本身所产生的或者是由机体对肿瘤细胞反应而产生的，反映肿瘤存在和生长的一类物质，包括蛋白质、激素、酶（同工酶）、多胺及癌基因产物等。

肿瘤患者血液或体液中肿瘤标志物的检测，对肿瘤的辅助诊断、鉴别诊断、疗效观察、病情监测以及预后的评价具有一定的价值。

肿瘤标志物存在于细胞浆和细胞核中，与细胞表面膜相连，在血液中进行循环。

肿瘤标志物可以在血清、血浆、其他体液、组织提取物或石蜡固定的组织中检测到。

大多数肿瘤标志物可以用免疫学的技术进行检测。

二、影响肿瘤标志物检测的因素1.样本采集对检测的影响如前列腺按摩、前列腺穿刺、射精、导尿和直肠镜检查后，血液PSA和PAP值可升高；肝、肾功能异常和胆道排泄不畅、胆汁淤滞等均可造成肿瘤标志物如 CEA、ALP、GGT、细胞因子等浓度增高；某些药物影响肿瘤标志物的浓度，如抗雄激素治疗前列腺癌时可抑制PSA产生，导致 PSA 假阴性结果；唾液和汗液污染标本可使SCC升高。

由于红细胞和血小板中也存在神经元特异性烯醇化酶（NSE），因此，样本溶血或放置时间过长（且未分离血清保存）可使血液中NSE浓度增高。

采血管内的促凝剂或抗凝剂，对某些项目的测定有干扰。

2.样本保存对检测的影响血液标本采集后应及时离心,分离血清或血浆尽快测定,或保存于4℃冰箱中；若在2～3个月内测定,则应低温冰冻保存,防止反复冻融。

酶类和激素类TM不稳定,如fPSA和HCG,半寿期短,易降解,应及时测定。

3.肿瘤病人自身状况的影响肿瘤患者自身的状况影响肿瘤标志物的检出及血液中肿瘤标志物的浓度，包括：①肿瘤的大小和肿瘤细胞的数目：肿瘤越大、肿瘤细胞的数目越多，血液中TM越高。

②肿瘤细胞自身的分化程度：肿瘤细胞的分化程度越差，恶性程度越高，血液中TM越高。

③肿瘤的分期不同：肿瘤越晚期，血液中TM越高。

④肿瘤细胞表达和合成肿瘤标志物的程度：肿瘤细胞表达和合成的TM程度越高，血液中TM 越高，反之，血液中TM较低。

⑤肿瘤细胞的坏死和坏死程度：肿瘤细胞坏死后，释放出TM，使血液中TM升高，坏死程度越大，血液中TM升高越明显。

⑥TM在体内的降解和排泄：若肝脏、肾脏功能差，排泄速度慢，则TM在体内明显升高。

⑦假阳性和假阴性；有些疾病如炎性疾病，结缔组织病和生理变化如妊娠时，有些标志物的表达也升高，可导致假阳性；而有些肿瘤标志物较少或肿瘤细胞被封闭，抗原抗体形成免疫复合物，血循环差等都可导致肿瘤标志物不能被检出，导致假阴性。

⑧生物学因素的影响: 随年龄的增长PSA升高;老年人CA199、CA153、CEA 等可升高。

部分妇女在月经期CA125和CA199可增高，妊娠期血液中AFP和CA125含量明显升高；长期吸烟会使血液中CEA含量偏高。

⑨非法表达与假基因转录：非法表达指有些基因在肿瘤组织中表达，在正常组织中不应该表达而有少量表达；假基因转录，指假基因转录为mRNA，一般情况下不翻译为蛋白质。

在定性的检测mRNA和蛋白质时，这两种情况都可以影响检测的准确性和特异性，导致假阳性。

⑩患者血液中有噬异性抗体存在，可导致TM假阳性结果，要将此抗体消除后再检测。

因此，肿瘤患者的肿瘤标志物基础测定值对于观察疗效、预测复发有非常重要价值。

对肿瘤标志物检测正常的肿瘤患者，还可以做如下解释：疗效显著、未复发未转移；未选择到恰当的肿瘤标志物，提供错误信息；是一种目前还未发现的肿瘤细胞亚型。

三、肿瘤标志物检测的质量保证（一）肿瘤标志物检测前的要求对病人的信息进行充分了解，确保实验结果的准确性。

检测前样本的保存：血液标本采集后应及时离心，保存于4℃冰箱中，24小时内测定；如在短期内测定，则应-20℃保存，长期保存应置于-70℃冰箱, 标本应防止反复冻融。

酶类和激素类肿瘤标志物不稳定，易降解，应及时测定或低温保存。

（二）肿瘤标志物分析检测的要求满意的测试结果来自于符合要求的标本以及经过室内质控（IQC）和实验室间质量评价（EQA）监测评价的有效的实验方法。

室内质控和室间质评的监测评价包括实验的重复性、采用的标准、所用基质的影响、动力学范围、参考品、稳定性、分析结果的理论数据、实验方法。

肿瘤标志物测定方法很多，有放射免疫测定法，酶联免疫测定法，化学发光免疫测定法等，每种测定方法有自己的精密度和重复性，但手工操作的方法重复性较差，误差比较大，操作时要特别认真；用自动化仪器进行测定，重复性好，误差小，实验结果的分析内和分析间变异系数可以达到<5%和<10%，具有手工分析难以比拟的优势。

各实验室还应注意影响实验特异性的因素。

不同的试剂盒测定也有差异,其原因是由于使用的单克隆抗体针对抗原的位点不同所致。

有时即使使用同一抗体，也可能因抗原异质性（如原发肿瘤转移后，失去了原有的抗原性而停止分泌原有的肿瘤抗原）或基质的影响而得到不同的结果。

有研究报道，使用12种不同的CEA试剂盒检测某一混合血清中CEA的浓度，结果其差异超过100%。

导致分析间误差的主要原因是没有测定的标准化，包括缺乏统一的抗原、抗原成分、校正品和参考方法等。

因此，在工作中要尽量使用同一种方法，同一种仪器和同一厂家的试剂盒进行测定。

1.室内质量控制（IQC）的要求肿瘤标志物很少有参考方法，要坚持作室内质控图，以均值为靶值，来判断试验的稳定性和重复性。

①重复性：理想的分析批内误差应<5%；批间误差<10%。

②建立测定认可的标准：选择合适的IQC标准。

③样品与病人血清尽可能相似：仅仅采用试剂盒所附的质控品是不够的，还应包括独立来源的可靠的血清基质质控品。

④IQC样品的浓度适合临床应用：应包括肿瘤标志物的阴性和低值阳性质控品，需要较宽的浓度范围；评价高浓度样本稀释后的测定准确度。

⑤评价实验的干扰因素：要求对实验的干扰因素（嗜异性和其他抗体、血凝试管中的凝血试剂等）进行检查。

2. 实验室间质量评价（EQA）的要求①适宜浓度的EQA样本：EQA样本应具有适宜的工作浓度范围，但有时会需要较高浓度的EQA样本来评价实验的稀释步骤。

对于某些分析（如：AFP、hCG）用无分析物血清检查基线的可靠性是很重要的。

②实验“稳定性”的评价：在一定时间内（6-12个月）重复进行相同样本的测试，对实验室内实验结果的重复性进行评价。

③验证靶值的精确度和稳定性：指无现成参考方法时，需要对所使用的方法进行以下验证：稳定性：对同一样本进行重复测定；用已知浓度的相关国际标准品进行回收率实验；对不同实验室间的检测结果（参考值范围、结果累计报告等）进行比较。

3.肿瘤标志物测定的标准化问题要保证TM检测结果的准确性和各实验室之间的可比性,首先诊断产品要达到国际标准(IS),有统一的参考方法和国际参考品(IRR)。

但目前尚无公认的参考方法,能得到的国际标准品仅有AFP、CEA、HCG和PSA四种,而CA系列的TM至今还没有国际标准,这为TM测定的准确性和质量控制带来了困难。

涉及到免疫测定标准化的组织有世界卫生组织（WHO）生物学标准化专家委员会（The Expert Committee on Biological Standardization，ECBS），负责建立生物物质的国际标准及参比材料。

WHO通过国家生物学标准和质控物研究所（National Institute for Biological Standards and Control，NIBSCC）提供大多数多肽激素和一些肿瘤标志物的国际标准品。

一些地区性组织也制备标准品，如美国的疾病控制中心（Centers of Disease Control，CDC）、美国病理学家协会的国家委员会（National Committee of the College of American Pathologists）、国家卫生研究所（National Institute of Health，NIH）等提供用于研究目的的多肽激素标准品。

国际癌症生物学和医学学会（ International Society of Onco-developmental Biology and Medicine ）已启动一个肿瘤标志物抗原决定簇绘图计划。

4.抗原、抗体和基质效应对肿瘤标志物测定的影响抗原抗体反应是指抗原与相应抗体间所发生的特异性结合反应,受抗原抗体的性质、活性、效价、反应比例及环境(如电解质,pH 值,温度)等因素影响。

在TM测定中应注意:①确认样品中被检抗原和校准品中抗原的一致性。

②制备抗体时使用的抗原和样品中抗原的一致性。

③抗原过剩的识别。

④试剂使用的是多克隆抗体，则抗体的纯度很重要；试剂使用的是混合单克隆抗体则每批抗血清内各单克隆抗体的组成及相对比例很重要，并要保持恒定。

另外，很多肿瘤标志物是糖蛋白或粘蛋白，糖基化的不均一性可能导致其免疫反应性某些变化，从而引起测定结果的差异。

⑤校准品稳定、无混浊。

⑥抗原抗体反应时所处的基体（基质）状况应保持恒定和一致。

免疫反应的基质效应是指干扰抗原、抗体反应而与分析物本身无关的所有非特异性因素(即基质)对分析物反应的影响。

基质效应通常由蛋白质、电解质、补体、类风湿因子、抗人球蛋白抗体、药物、添加剂和各种污染物引起。

标准品和质控品的基质与待测血清标本不一样,标准品的基质通常是含蛋白的缓冲溶液；标准品和质控品都是经过加工处理的,如冰冻、冷冻干燥、加稳定剂或添加某些分析物等,而临检所用的测定方法、仪器、试剂等都是以人新鲜血清标本为模板的,对血清标本测定有可靠性,而对加工处理过的物质不一定可靠。

对于基质效应，需要注意以下几点：①同一基质状态的基质效应随方法及检测条件而异。

②基质效应是绝对的，只要处理过的样品和测定样品的基质状态不一，一定有基质效应；基质效应又是相对的，只要认可某一方法的基质效应可忽略不计，或者由基质效应对某方法引入的误差在可接受水平，那么衡量另一方法是否具有基质效应时，应作方法学比较。

若处理过的样品和测定样品的结果分布不同，说明基质效应明显。

反之属可接受。

也即认为“无” 基质效应。

③严格讲，不同批号试剂，它们产生的基质效应也不一致。

度量有无基质效应，或者了解不同方法间的可比性，最佳样品是人新鲜样本。

④一定要懂得单一标准液，校准品，质控品和新鲜样品间的区别，并正确使用。

不应用质控品作为校准品去校准仪器，不仅是基质差异，而且是校准品和质控品定值的水平不一。

室内质控用的质控品仅用于各检验科日常工作中重复性和精密度的控制。

由于各检验科的检验方法和厂商定值的方法不一致，不可将定值血清的靶值来定值。

⑤衡量某一方法或试剂是否准确可靠，唯一可信的方法是使用人新鲜样本进行比较，仅以控制品测定值相似或等于定值，不足以说明方法的准确度。