NGS测序技术与分析流程图

合集下载

ngs高通量测序流程

英文回答：

NGS (Next-Generation Sequencing) is a high-throughput sequencing technology that has revolutionized the field of genomics. It allows for the rapid and cost-effective sequencing of large amounts of DNA or RNA samples. The NGS workflow involves several steps, including sample preparation, library construction, sequencing, and data analysis.

The first step in the NGS workflow is sample preparation. This involves extracting DNA or RNA from the biological sample of interest. The quality and quantity of the extracted nucleic acids are crucial for the success of downstream steps. Various extraction methods and kits are available depending on the sample type.

NGS测序技术与分析

去除低质量数据
去除测序过程中产生的低质量序列，以提高数据分析的准确性。
去除污染数据
去除可能存在的样本交叉污染、试剂污染等数据，确保后续分析的可靠性。
序列比对与基因注释
序列比对
将测序得到的序列与参考基因组进行比对，确定每个序列在基因组上的位置。
基因注释
根据序列比对结果，对基因进行注释，包括基因名称、基因功能、表达水平等信息。
感谢您的观看
农业与环境基因组学应用
农业育种
利用NGS技术对农作物进行基因组测序，有助于快速鉴定优良性状基因，加速育种进程和提高农作物的产量与品质。
VS
生态与环境监测
通过NGS技术对环境微生物群落进行检测和分析，有助于了解环境变化和生态系统的稳定性，为环境保护和可持续发展提供科学依据。
THANKS FOR WATCHING
靶向治疗
通过NGS技术检测肿瘤基因突变，为患者提供针对性的靶向治疗，降低毒副作用和提高治疗响应率。
生物信息学研究与基因组学发展
基因组学研究
NGS技术为基因组学研究提供了强大的工具，有助于深入了解人类基因组结构和功能，推动生命科学领域的发展。
疾病机制研究
通过NGS技术对疾病相关基因进行深入研究，有助于揭示疾病发生、发展的分子机制，为新药研发和疾病治疗提供理论支持。
变异检测与基因组组装

NGS高通量基因测序技术原理及应用案例

随着科技的迅猛发展，高通量基因测序技术（Next-Generation Sequencing, NGS）在基因研究领域中扮演着举足轻重的角色。该技术的出现极大地促进了基因研究的进展，为我们揭示了生命的奥秘。本文将介绍

NGS高通量基因测序技术的原理，并通过应用案例来展示其在不同领域中的重要性和广泛应用。

NGS高通量基因测序技术原理

NGS高通量基因测序技术通过在DNA或RNA序列中逐个测定碱基的顺序，从而获得完整的基因组或转录组信息。它与传统的Sanger测序技术相比，具有高通量、高准确性、高灵敏性和较低成本等优势。其基本原理可以分为

样本制备、测序和数据分析三个步骤。

首先，样本制备是整个测序过程中的关键步骤。传统的基因测序需要使

用大量的DNA或RNA样本，而NGS技术则能够通过PCR扩增或纯化等方法，从少量的样本中获取足够的DNA或RNA。样本制备的目标是将DNA

或RNA片段连接到测序芯片上的适配器，以便在测序过程中进行DNA或RNA的扩增和固定。

接下来是测序过程，NGS技术采用并行测序原理，即通过分割DNA或RNA样本为许多小片段，然后同时生成多个序列。常见的测序方法有Illumina、Ion Torrent和PacBio等。其中，Illumina技术是目前应用最广泛的

高通量测序技术。它利用DNA或RNA的片段在特定的适配器上进行扩增，并在测序芯片上进行固定。然后，测序仪器会逐个测定每个适配器上的碱基，并生成对应的测序图谱。

最后是数据分析。测序过程中生成的测序图谱需要通过计算机算法进行

NGS测序流程文库定量工作小结

前言:

温馨小提示：

本篇文档是通过查阅资料精心整理编制的，希望能帮助大家解决实际问题，文档内容不一定完美契合各位的需求，请各位根据需求进行下载。文档下载后可自己根据实际情况对内容进行任意改写，确保能够帮助到大家。除此之外，本店铺还提供各种文档材料，涉及多个领域例如活动文案、工作方案、读后感、读书笔记等，大家按需搜索查看！

Warm tip:

This document is prepared by consulting information carefully. Hope to help you solve practical problems. The content of the document is not necessarily perfect to match your needs. Please download according to your needs. Then you can rewrite the content according to the actual

situation to ensure that we can help. In addition, the store also provides a variety of documents and materials, covering areas such as copywriting for activities, work plans, reflections, reading notes, etc.

《NGS基础培训》课件

基因组编辑与基因治疗
总结词
NGS技术可以用于基因组编辑和基因治疗，为遗传疾病和癌症等难治性疾病的治疗提供了新的思路。
详细描述
利用NGS技术，我们可以对人类基因组进行精确编辑，纠正致病的基因突变。此外，基因治疗也可以利用NGS技术对疾病进行精准治疗，提高治疗效果并减少副作用。
05
ngs测序常见问题及解决方案
数据质量控制与处理
数据质量评估
采用FASTQC等工具对数据质量进行评估，确保数据质量符合要求。
数据过滤与去噪
使用Trimmomatic、Novoalign等工具进行数据过滤和去噪，以提高数据质量。
基因变异检测与注释
基因变异检测方法
采用SOAPsnp、GATK等工具进行基因变异检测，并依据SNP位点在基因组上的位置进行注释。
《ngs基础培训》课件
xx年xx月xx日
目录
• ngs基本概念及发展历程 • ngs工作原理及测序技术 • ngs在临床医学中的应用 • ngs在生物科学研究中的应用 • ngs测序常见问题及解决方案 • ngs新技术与未来趋势
01
ngs基本概念及发展历程
ngs定义与特点
下一代测序技术(NGS)是一种高通量的生物学技术，可以对基因组进行大规模、并行、快速、准确的测序。
VS
详细描述
序列组装是将测序得到的数千至上百万条序列拼接成较大片段的过程，需要使用高效的算法和计算资源。基因组构建是在序列组装完成后，利用生物信息学手段将获得的基因组组装成完整的图谱。这些步骤对于研究生物体的基因组变异、基因结构和功能等具有重要意义。

二代测序(NGS)实验方案和应用

这里为您介绍二代测序的相关流程和应用.之迟辟智美创作

随着人类基因组工程的完成，对低花费的测序技术的需求增进了高通量二代测序技术的发展.这些新的测序平台允许进行高通量测序，具有广泛的应用：

•全基因组从头测序或者重测序

•目标序列重测序

•转录组分析

•微生物组研究

•基因调控研究

NGS 序列

二代测序仪器有很多种组合，在通量、片段长度、准确

度、每一轮测序本钱、每百万碱基对测序本钱、初始本

钱、规格和技术方面存在存在不同.

从规格和初始本钱的角度而言，二代测序仪器可轻松地分类为更窄的范围，也就是所谓的“台式测序仪”和高通量仪器.

台式测序仪使得任何实验室都可以像使用real-time PCR一样，自己进行测序.这些仪器可以和一些靶标序列富集技术

相结合，用在一些临床的应用中，其中：选定的靶标基因

用于深度分析，以检测稀有的突变，或者检测多样样本中（比如癌症样本）中的突变.目前，这些仪器的通量在10 Mb到7.5 Gb之间，可是随着硬件，软件和试剂的继续改善，通量也在稳步增加.

高通量测序仪非常适合于年夜量的，基因组范围的研究，

每次测序能测定600 Gb的序列.一些这样的高通量和高精度的平台，能测定的片段长度相对较短，这对高重复性的序

列和未知基因组的从头测序就可能成为问题.与此相反，也有一些仪器能测序的片段较长（到达2500 bp），可是其精度和测序能力（90 Mb）要低很多.还有一些测序能力位于两者之间的仪器（~800 bp，700 Mb）.

因此，应用决定了哪一种仪器是最合适的.

有一种新的方法被称作“纳米孔测序”.这种技术中，根据一个DNA链通过一个合成的或者卵白纳米孔道所引起的电流的改变，可以确定通过这个孔道的碱基.这理论上可以仅用一步就测序一个完整的染色体，而不需要生成新的DNA链.

ngs二代测序方法描述

NGS（Next Generation Sequencing）又称为二代测序技术，是一种高通量测序技术，能够快速、准确地测定DNA或RNA序列。相比传统的Sanger测序方法，NGS具有更高的测序速度、更低的成本以及更高的测序深度，广泛应用于基因组学、转录组学、表观遗传学等领域。

NGS的工作原理是将待测DNA或RNA样本进行适当的处理，如文库构建、PCR扩增等，然后将其分成短片段，并固定在测序芯片上。接下来，通过引物依赖的扩增和合成反应，在芯片上进行大规模的平行测序。测序过程中，每个碱基的加入都会释放出荧光信号，通过检测这些信号并记录，可以得到原始的测序数据。

NGS技术的一大特点是其高通量性能，能够同时测序数百万条DNA或RNA片段，大大加快了测序速度。此外，由于NGS技术的可扩展性，可以同时测序多个样本，从而节省时间和成本。此外，NGS还具有高灵敏度和高分辨率的优势，能够检测到低频突变、拷贝数变异等细微的变化。

NGS技术的应用非常广泛。在基因组学研究中，NGS可以用于全基因组测序、外显子测序、全基因组甲基化测序等，有助于揭示基因组变异与疾病之间的关系。在转录组学研究中，NGS可以用于RNA测序、全转录组甲基化测序等，有助于了解基因的表达和调控

机制。在表观遗传学研究中，NGS可以用于染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）、全基因组亲缘关系测序（WGS）等，有助于研究基因的表观修饰和遗传变异。

NGS技术的发展也带来了一些挑战。首先，由于NGS产生的数据量庞大，对数据存储和处理能力提出了更高的要求。其次，由于NGS技术的特点，如测序错误、测序偏差等，对数据的准确性和可靠性要求较高。此外，由于NGS技术的应用范围广泛，对操作人员的技术要求也较高，需要具备丰富的实验经验和数据分析能力。

【规范与指南】血液样本微生物游离DNA的NGS检测原理与应用

【规范与指南】⾎液样本微⽣物游离DNA的NGS检测原理与应⽤京港感染论坛

早诊快诊，助⼒精准防治

已知可引起⼈类疾病的微⽣物多于1000种，病原学的探寻始终是感染性疾病诊治的重要环节，

对于⼀些类型的感染性疾病，病因的探求仍然存在很⼤的困难，尤其对于⾎流感染，超过50%

尚不能明确病因。随着病原NGS的⼴泛应⽤和不断成熟，已成为感染检测的重要⼿段。本⽂将

以⾎液样本的病原微⽣物NGS检测为主要内容，对其检测流程、特征、临床应⽤、阈值、性能

验证与质控进⾏介绍与分享。

病原mNGS检测的原理如左图所⽰，相对于⾮感染⼈群，患者的临床标本中如果某种微⽣物核

酸⼤量检出，⽽⾮感染⼈群中该微⽣物核酸量未检出或明显低于感染患者，则意味着该微⽣物

是感染病原体的可能性较⾼。

病原mNGS检测流程包括标本采集、运输、核酸提取和富集、建库测序、⽣信分析以及可疑病

原菌报告。检测流程受到众多的因素影响。标本的优化选择、快速的转运、恰当的保存、⼈源

背景的处理、合理提取及建库试剂盒的选择、测序的平台、深度、测序序列长度、数据库分

析、合理化报告都会直接影响到报告的质量。

整个mNGS检测的过程，就好⽐这样的⼀个过程：样本就像⼀个上了锁的书箱，箱⼦⾥的书本

就是⼈与微⽣物的基因组。由于受限于⽬前的技术，⽆法轻松的打开箱⼦获取其中的完整信

息，因此我们采⽤⼀系列湿实验的⽅法，把这个箱⼦摧毁，这时书本已经被损坏，变成了⼀张

张碎纸条，这些碎纸条就是所谓的DNA⽚段，经测序后变成了我们说的reads。

碎纸条上由四种字符组成-“ATCG”，基于这些碎掉的⽚段，我们去图书馆查找出处，这⾥的图书

NGS系列讲座——NGS基本原理

NGS（Next-Generation Sequencing）是一种高通量的DNA测序技术，也是现代生物学研究中重要的工具之一、NGS的出现极大地推动了基因组学、转录组学、蛋白质组学等领域的研究进展。本文将重点介绍NGS的基

本原理，并对相关技术进行简要的说明。

NGS技术的基本原理可以简单概括为将待测DNA大分子序列分割成小

片段，然后通过并行进行大规模的测序，并最后将这些小片段的测序结果

进行拼接，以获取原始DNA序列。具体的步骤包括DNA样本的制备与库构建、DNA片段的文库构建、测序、数据处理与分析等。

首先，NGS技术需要将待测DNA样本进行处理和制备，一般包括DNA

的提取、纯化和断裂。断裂后的DNA片段可以通过两种不同的方式进行文

库构建。一种是通过PCR（聚合酶链式反应）扩增的方式构建文库，该方

法适用于高测序深度的应用，例如全基因组测序。另一种方式是利用适应

性文库构建方法，如特定酶切、连接适配体、聚合酶链式反应等。这种方

法适用于低测序深度的应用，例如RNA-seq、甲基化测序等。

接下来，构建好的文库会经过芯片装片和测序前处理，测序前处理一

般包括DNA片段的扩增、芯片上的密集排列和相应的预处理过程。然后，

测序过程会根据所使用的技术进行不同的处理。目前常见的测序技术包括Illumina/Solexa、Roche/454和Ion Torrent等。Illumina/Solexa技术

是目前最主流的NGS测序技术之一，它基于测序-by-synthesis的原理，

ngs hla分型流程

NGS（下一代测序）HLA分型是通过高通量测序技术对人类白细

胞抗原（HLA）基因进行分型的过程。HLA基因编码了人体免疫系统

中的重要蛋白质，对于器官移植、疾病易感性和药物治疗反应等方

面具有重要意义。下面是NGS HLA分型的流程：

1. 样品准备，首先需要从受试者的血液或组织样本中提取DNA。这可以通过标准的DNA提取方法来实现。

2. 文库构建，提取的DNA样本需要通过文库构建过程进行准备，这包括DNA片段的制备、末端修饰和连接DNA测序接头等步骤。

3. 文库质控，对构建好的DNA文库进行质控，确保文库中的DNA片段长度和浓度符合测序要求。

4. 下一代测序，将文库进行高通量测序，通常采用Illumina

或Ion Torrent等平台进行测序。在测序过程中，通过对DNA片段

进行大规模的并行测序，可以获得大量的测序数据。

5. 数据分析，得到的测序数据需要进行生物信息学分析，包括

序列比对、HLA基因的定量和定性分析等步骤。这一步通常需要借

助专业的生物信息学软件和数据库进行。

6. 结果解读，最后，根据数据分析的结果进行HLA基因型的解

读和分型。这包括确定HLA基因的等位基因，即确定受试者的HLA

基因型。

总的来说，NGS HLA分型是一个复杂的过程，涉及到样品准备、文库构建、高通量测序、数据分析和结果解读等多个环节。通过这

一流程，可以准确地确定受试者的HLA基因型，为临床诊断和治疗

提供重要的信息。

高通量测序技术(NGS)

学习感悟：近来，看到了《高通量测序揭秘中药如何杀死癌细胞》的文章，什么是高通量测序？教材中只有PCR技术扩增技术知识，查找了一些资料，获得了肤浅的理论知识。一、高通量测序技术简介高通量测序技术（High-throughput sequencing）又称“下一代”测序技术，以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。实验过程：样本准备，文库构建，测序反应，数据分析。（1）将目标DNA剪切为小片段（2）单个小片段DNA分子结合到固相表面（3）单分子独立扩增（4）每次只复制一个碱基（A,C,T,G）并检测信号（5）高分辨率的成像系统高通量测序以其高输出量与高解析度的特性，不仅为我们提供了丰富的遗传学信息，而且使得测序的费用和时间大大缩短。在高通量测序发展的过程中，也有很多的问题需要我们去解决：数据在临床诊断上的作用，测序数据的储存和分析，数据的安全和信息隐私等。二、测序行业技术发展概况自Frederick Sanger提出双脱氧核苷酸末端终止法以来，测序技术已经历了近40年的发展，根据核心技术的区别与进步，可以分为三代：第一代测序技术——始于1977 1977年，Sanger提出了双脱氧核苷酸末端终止法，同年A.M.Maxam和W.Gilber也提出了化学酶解法，两者的提出标志着第一代测序技术的诞生。第二代测序技术（NGS）——始于2005 2005年，开发出全球第一台商业化的第二代DNA测序仪GS 20，拉开了基因产业发展的序幕。之后数年NGS行业内经历了激烈的竞争，逐步形成较为稳定的格局：（1）Life Technologies于2013年被著名科研服务供应商Thermo Fisher收购，SOLiD平台逐步淡出市场，主推2011和2012年陆续发布的Ion PGM和Ion Proton两款测序设备。（2）Illumina则在全面接收Solexa的研发平台之后，开发出了著名的HiSeq平台系列。（3）2013年，Roche宣布关闭454测序业务，并决定于2016年全面终止相关服务（454测序仪逐渐退出市场）。（4）2013年华大基因全资并购Complete Genomics，全面接收研发平台后，分别于2014年推出测序仪BGISEQ-1000、BGISEQ-100，2015年推出新型桌面化测序系统BGISEQ-500。第三代测序技术——始于2008 2008年Helicos Biosciences推出了首台单分子测序仪。2011年4月PacificBiosciences推出PacBio RS。相较第二代测序，第三代测序具有速度快、读长长、可直接测甲基化的DNA 序列、不需要PCR 扩增、无

NGS结果分析流程

NGS结果分析流程
一、测序数据初步分析
√
√
√
√ √
二、结果下载，文件按要求命名
实验结果文件夹
input文件夹下的相应bam、bai、vcf 分别命成“项目名简写及样本号” 的形式（如图）
打印
1，与实验记录装订一起，为实验整体情况记录
2，与每个样本结果分析表装订一起，为每个样本分析情况记录
三、生物信息学分析
上完机，在fenziyichuan-06电脑“E/NGS_Results/NGS实验结果分析记录表”中记录实验材料编号（即上机时间）、样本号、项目等内容，如图：
欲进行结果分析者，需先到这个表中登记领取，填写“分析者”、 “领取日期”。
输入命令
√ 重点关注4个文件
√ √ √
图注：1，颜色及对应意义：黑，5’UTR;深蓝，外显子；淡蓝，内含子；灰，3‘UTR。
wenku.baidu.com
案例分享2
R ：tgaccatgtattgacatataattga TCAATTATATGTCAATACATGGTCA
二、结果解释： 1，c.11153+5G>C变异未见文献报道，对10个正常人样本的该位点进行检测未发现此变异。同时，该变异经剪接位点预测，认为其可能致病。综合分析，该变异极可能致病。 2，PKD1基因突变引起的多囊肾通常以常染色体显性的方式遗传。综合判断，受检者及其父亲和爷爷可能符合多囊肾患者的基因特征。但由于该变异未见文献报道，故不能排除大片段缺失/重复突变引起多囊肾症状，若受检者临床表现及其他检测结果强力支持多囊肾病诊断，或可考虑进行多囊肾病相关基因MLPA检测，以防漏检。

ngs二代测序方法描述

NGS（Next Generation Sequencing）是一种高通量二代测序技术，也被称为第二代测序技术。它是在传统的Sanger测序技术基础上发展而来的，通过并行测序的方式，大大提高了测序效率和产出。本文将详细介绍NGS二代测序方法的原理和应用。

一、原理

NGS二代测序方法的核心原理是通过将DNA或RNA样本分离成小片段，并在微纳米级平台上进行扩增、定点合成和测序。具体的步骤如下：

1. 文库构建：将DNA或RNA样本进行加工处理，包括断裂、末端修复、连接接头等步骤，使其适用于测序。

2. 扩增：将文库中的DNA或RNA片段扩增，使其在微纳米级平台上充分复制。

3. 定点合成：将扩增的DNA或RNA片段定点固定在微纳米级平台上，并进行模板的制备，以便进行后续的测序步骤。

4. 测序：通过荧光标记的碱基，使用碱基的互补配对原则进行测序。测序过程中，通过摄像机记录荧光信号，并将其转化为碱基序列。

5. 数据分析：将测序得到的碱基序列进行数据处理和分析，包括序列比对、SNP检测、基因组拼装等步骤。

二、应用

NGS二代测序方法在生物学和医学领域有着广泛的应用，包括以下几个方面：

1. 基因组学研究：NGS可以对整个基因组进行高通量测序，从而揭示基因组的结构和功能。通过测序，可以快速、准确地获得大量的基因组数据，并用于研究基因组变异、基因表达调控等方面。

2. 转录组学研究：通过对RNA样本的测序，可以获得转录组的信息，包括基因表达水平、剪接变异等。NGS可以帮助科研人员更全面地了解基因的表达调控机制，发现新的基因和转录本。

ngs与其他检测序技术流程的对比图文PPT教案

点突变、小片段插入/缺失无法测融合、大片段以及热点测序
1、灵敏度高、特异度高 2、空间定位准确，可同时分析分裂期和间期多个细胞，并进行定量
1、可对组织和细胞中相应的抗原进行定性、定位及定量研究 2、经济快捷
1、通量低、成本高 2、对操作和判读技术要求高，不同读片者判读差异较大
1、抗体的选择 2、检测者组织的固定 3、观察者解释方面的差异
拷贝数变化、大片段插入/缺失、融合/重排。扩增的金标准
仅检测蛋白表达水平
1、测序长度 2、准确性高，灵敏度20%-30% 3、能处理的处理重复序列和多聚序列
1、大规模、高通量 2、能检测各种变异形式 3、灵敏度1%-3%
1、通量低、成本高 2、对样本中肿瘤细胞的含量和比例要求较高 3、灵敏度低
单次检测中同时发现多个基因的多种突变包括单碱基突变、碱基缺失、碱基插入和基因融合
上一代传统基因检测
技术局限，假阳/阴性错误率高
单次反应只能针对一种突变进行检测，并只能检测一种突变类型
高通量
同时对416个致癌基因进行测序展现所有突变每次反应只检测单个基因一种突变
样本需求少
周期短
全自动化的大数据分析方法
12
Sanger测序的流程
结果解读
ARMS法检测
扩增阻碍突变系统(ARMS) -又称等位基因特异性扩增（ASA），利用PCR引物的3’ 端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计等位基因特异性 PCR扩增引物。

NGS数据处理流程中医草药功能成分鉴定

在当前科学技术的发展背景下，Next Generation Sequencing (NGS) 技术

被广泛应用于生物学研究领域。其高通量、高准确性、高效率的特点使得NGS技术成为研究生物草药功能成分的有力工具。本文将主要介绍NGS数

据处理流程中医草药功能成分鉴定的方法和步骤。

NGS数据处理流程主要包括以下几个关键步骤：样本准备、DNA/RNA

提取、文库构建、高通量测序、数据质控和过滤、数据比对和变异分析、功

能注释和富集分析。

首先，在样本准备阶段，需要选择适合的医草药材料，并进行标本鉴定

和样本采集。正确的样本准备对后续的实验和数据处理非常关键，因为不同

的样本来源和质量会直接影响到数据的可靠性和准确性。

其次，DNA/RNA提取是NGS数据处理流程中的重要步骤之一。DNA可以用来研究草药药效成分的基因表达水平，而RNA可以用来研究其转录组

水平的变化。目前有许多快速、高效的DNA/RNA提取方法可供选择，选择

合适的方法可以提高提取的纯度和产量。

然后，文库构建是NGS数据处理流程中的关键步骤之一。文库构建是指

将DNA或RNA样本转化为可以进行高通量测序的文库。目前常用的文库构建方法主要包括PCR扩增文库构建、RNA序列文库构建和基于Tagmentation方法的文库构建。不同的文库构建方法选择将直接影响到后续

的测序结果和数据质量。

接下来是高通量测序步骤。高通量测序是NGS数据处理流程的核心环节，它可以产生大量的测序数据，并获得目标DNA/RNA序列的信息。目前常用

相关主题

1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。

2 Contig及Scaffold长度分布
3 Unigene的长度分布和功能注释，GO分类，Pathway分析，差异表达分析
4 蛋白功能预测与分类，差异表达基因GO富集和 Pathway富集分析。
1 基本数据统计，比对参考序列
2 序列在基因组上在分布
3 测序深度分析、随机性评估和基因差异表达分析
SOLiD 5500xl
ABI SOLiD测序前期制备
A 样品片段化磁珠连接
B 乳化PCR 3‘末端修饰
C 磁珠富集转到测序玻片
ABI SOLiD测序原理
ABI SOLiD荧光结合和结果示例
@SRR029969.1 VAB_5551_12_381_F3 length=35 T11.0203.3.1113211010332111302330201 +SRR029969.1 VAB_5551_12_381_F3 length=35 !36!8/8:!:!462>@6=(<8>8.<;2:*9748078 @SRR029969.2 VAB_5551_13_468_F3 length=35 T202312302.3333130131131322113203131 +SRR029969.2 VAB_5551_13_468_F3 length=35 !9),4/3)&$!(&(573(96,'7&91>)43),(95,
400 - 600 bp
25 Gb/d
20 – 30 Gb/d 400 – 600
Mb/Run
~1.5d ~4d ~8d
1d/ 1lane 7d/ 12
lane 7d/ 12
lane
10h
•50 bp 85%以上 Q30 •100 bp 80%以上 Q30
Q40
Q20
转录组测序测序流程
全转录组总RNA
• 454测序原理
测序实验流程：
• 1、文库制备：根据样品的种类和实验目的，将基因组DNA/cDNA片段化处理至400-800bp 间，经末端修复与特异性接头连接等修饰后变性处理回收单链的DNA（sstDNA）；然后和两个44个碱基长的衔接子（adaptor）A、 B进行平端连接。A、B 衔接子各自含有20个碱基的PCR 引物序列、20个碱基的测序引物序列和4个碱基的对照序列（TACG），除此之外，B衔接子的5’端还标记有一个生物素基团，供后续的分离合适的测序模板使用。
http://222.200.187.83/nongpost/linux_lecture/msg.php
知识回顾 Knowledge Review
新一代测序介绍
• 三大测序平台的前世今生
Lynx MPSS
Solexa Illumina Solexa
454 Roche 454
Polony Seq
ABI SOLiD Helicos Ion Torrent ABI Ion Torrent SMRT Pacific Biosciences
Roche-454
Solexa 的特点与主要应用
• 读长较短，100－150bp • 通量高，25G每天，120-150G每Run • 主要应用：RNA测序、表观遗传学研究
ABI SOLiD
• SOLiD Sequencing by Oligo Ligation/Detection
• Oligo连接测序：通过连接酶连接，再对 oligo上荧光基团进行检测
polyT富集mRNA
去除rRNA
转录组mRNA
Non-coding RNA
RNA片段化、纯化、检测产量
连接两端接头序列
逆转录生成cDNA
选择适当长度cDNA进行扩增
纯化扩增产物，评估产量
上机进行高通量测序
转录组主要分析内容
无参考序列转录组分析内容
有参考序列转录组分析内容
1 测序数据产量统计，数据成分和质量评估；
SOLiD 5500xl
454 GS FLX
Single-end: 1 x 35 bp Paired-end: 2 x 50 bp Paired-end: 2 x 100 bp
Single-end: 75 bp Paired-end: 75 x 35 bp Mate-pair: 60 x 60 bp
测序实验流程：
• 3、测序反应：携带DNA的珠子与其他反应物混合物，随后放入PTP板中进行后继的测序。 PTP孔的直径（29um）只能容纳一个珠子（20um）。然后将PTP板放置在GS FLX 中，测序开始。每一个与模板链互补的核苷酸的添加都会产生化学发光的信号，并被CCD照相机所捕获；
diol diol
2nd cycle denaturation
diol
diol diol
2nd cycle extension
diol
diol diol
2nd Байду номын сангаасycle annealing
Illumina Solexa Base Calling
T G C TAC GAT …
1
2
3
4
5
6
7
8
9
TTTTTTTGT…
测序实验流程：
• 2、Emulsion PCR：特定比例的单链DNA文库被固定在特别设计的DNA捕获磁珠上，使大部分磁珠磁珠携带了一个独特的单链DNA片断。磁珠结合的文库被扩增试剂乳化，形成油包水的混合物，每个独特的片断在自己的微反应器里进行独立的扩增，而不受其他的竞争性或者污染性序列的影响。整个片段文库的扩增平行进行。扩增后产生了几百万个相同的拷贝。随后，乳液混合物被打破，扩增后仍结合在磁珠上的片段既可被回收纯化用于后续的测序实验；
4 新基因预测，基因可变剪接鉴定和基因融合鉴定等。
小RNA测序
果蝇三种组织中MiRNA表达情况
MiRNA表达模式分析
新miRNA预测
miRNA编辑情况分析与统计
分析软件介绍
• 质量控制软件 (Quality Control) • 定位软件 (Mapping the reads) • 已知基因（差异）表达评估软件 (Differential Expression) • 新基因鉴定软件 (New gene identification) • 可视化展示软件 (Virsulization) • 基因功能注释软件 (GO term or KEGG pathway analysis)
Illumina solexa
• Solexa 测序原理
Illumina solexa
Illumina Solexa 桥式PCR
diol diol
1st cycle denaturation
diol diol
1st cycle annealing
n=35 total
diol diol
1st cycle extension
三种平台的技术差异
平台
PCR 测序载体测序方式
结果序列
454
磁珠乳化PCR 磁珠
Solexa
桥式PCR 玻片
SOLiD
磁珠乳化PCR 玻片
焦磷酸、荧光可逆终止物连接酶、荧光、荧光
FastQ
FastQ
CSFastQ
三种平台的效能参数差异
平台
读长
通量
周期
精度
Solexa HiSeq 2000
第一代测序技术
• Sanger测序
1977年，桑格测定了第一个基因组序列，是噬菌体X174的，全长5375个碱基
• Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为： ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列
Fastq 格式
数据格式示例
Color Space 格式
Phred score
质量控制
利用galaxy进行原始数据处理
https://main.g2.bx.psu.edu/
Galaxy History ' VGN FASTQ'
https://main.g2.bx.psu.edu/u/jjv5/h/unnamed-history-1
Ion Torrent 测序原理
精度
• Examples: • • 90% conﬁdence (10% error rate) = Q10 • • 99% conﬁdence (1% error rate) = Q20 • • 99.9% conﬁdence (.1% error rate) = Q30
测序实验流程：
• 4、数据分析：GS FLX系统在10小时的运行当中可获得100多万个读长，读取超过4-6亿个碱基信息，通过GS FLX系统提供两种不同的生物信息学工具对测序数据进行分析。
454 Pyrosequencing
454 的特点与主要应用
• 读长较长，400－600bp • 通量较低，1Run 1M 序列，400－600Mb • 相对成本较高 • 主要应用：de novo测序
• 454公司可谓新一代测序技术的奠基人。2005 年底，454公司推出了革命性的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统——Genome Sequencer 20 System，被《Nature》杂志以里程碑事件报道，开创了边合成边测序（sequencing-by-synthesis）的先河。之后， 454公司被罗氏诊断公司以1.55亿美元收购。
B. SOLiD 测序结果示例（Color Space)
A. SOLiD Oligo荧光基团模式图
SOLiD 的特点与主要应用
• 读长较短，50-75bp • 精度高，可达Q40 • 通量高， 20-30G每天，1Run 可达120G • 主要应用：基因组重测序、SNP检测等
Ion torrent