增强免疫力功能评价方法(征求意见稿)及修订说明

附件1：增强免疫力功能评价方法（征求意见稿）保健食品评价试验项目、试验原则及结果判定Items, Principles and Result Assessment1 试验项目1.1 动物实验1.1.1 体重1.1.2脏器/体重比值测定：胸腺/体重比值，脾脏/体重比值1.1.3细胞免疫功能测定：小鼠脾淋巴细胞转化实验，迟发型变态反应实验1.1.4体液免疫功能测定：抗体生成细胞检测，血清溶血素测定1.1.5单核—巨噬细胞功能测定：小鼠碳廓清实验，小鼠腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球实验1.1.6 NK细胞活性测定2 试验原则2.1 所列的指标均为必做项目2.2分为正常动物实验方案和免疫功能低下模型动物实验两种方案, 可任选其一进行实验.2.3采用免疫功能低下动物模型实验方案时需做外周血白细胞总数测定3 结果判定3.1采用正常动物实验，受试样品具有增强免疫力作用。

在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核－巨噬细胞功能及NK细胞活性四个方面测定中，任两个方面试验结果为阳性，可以判定该受试样品具有增强免疫力作用。

其中细胞免疫功能测定项目中两个实验的结果均为阳性，判定细胞免疫功能试验结果阳性。

体液免疫功能测定项目中两个实验的结果均为阳性，判定体液免疫功能试验结果阳性。

单核—巨噬细胞功能测定项目中两个实验的结果均为阳性，判定单核—巨噬细胞功能试验结果阳性。

NK细胞活性测定实验的一个以上剂量结果阳性，判定NK细胞活性结果阳性。

正常动物实验需进行四个方面的测定。

3.2 采用免疫功能低下动物实验，受试样品对免疫功能低下者具有增强免疫力作用。

在免疫功能低下模型成立条件下，血液白细胞总数、细胞免疫功能、体液免疫功能、单核－巨噬细胞功能及NK细胞活性五个方面测定中，任两个方面试验结果为阳性，判定该受试样品对免疫功能低下者具有增强免疫力作用。

其中细胞免疫功能测定项目中两个实验的结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定细胞免疫功能试验结果阳性。

体液免疫功能测定项目中两个实验的结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定体液免疫功能试验结果阳性。

单核—巨噬细胞功能测定项目中两个实验的结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定单核—巨噬细胞功能试验结果阳性。

NK细胞活性测定实验的一个以上剂量结果阳性，可以判定NK细胞活性结果阳性。

血液白细胞总数测定的二个以上剂量结果阳性，可以判定血液白细胞总数结果阳性。

免疫功能低下模型动物实验至少需进行三个方面的测定。

同时在各项实验中，任何一项测试都不出现加重免疫抑制剂作用的结果。

增强免疫力功能检验方法Method for the Assessment of Enhancing Immune Function1.原理：免疫系统主要包括中央和外周淋巴器官、淋巴组织和全身各处的淋巴细胞、抗原呈递细胞等，还包括血液中的白细胞。

淋巴细胞经血液和淋巴使各处的淋巴器官和淋巴组织连成一个功能整体。

胸腺属中央淋巴器官，主要功能是确保T淋巴细胞的产生和成熟。

外周淋巴器官包括血液、淋巴管和免疫活性细胞；脾脏对抗原发生免疫应答作用，脾窦的巨噬细胞具有清除功能，脾白髓含有记忆B细胞，产生对T依赖抗原的体液免疫应答。

淋巴细胞是特异性免疫应答的主要细胞群，按其表面标志物，分为T细胞、B细胞和天然杀伤细胞（NK）三大类，T细胞又分为CD4+（Th）细胞和CD8+T淋巴细胞。

B淋巴细胞转化为浆细胞后能合成和释放抗原特异抗体，所有抗体都是免疫球蛋白，但并非所有的免疫球蛋白分子都具有抗体功能。

免疫系统可产生特异性免疫和非特异性免疫功能，检测上述免疫系统的各种代表性指标的改变可对增强免疫力作用的功能做出相应判定。

2. 实验动物选择推荐用近交系小鼠，如C57BL/6J、BALB/C等，6～8周龄，18～22g（BALB/C 种可16-18g），单一性别，雌雄均可，每组10～15只。

3. 剂量分组及受试样品给予时间实验设三个剂量组和1个阴性对照组。

以人体推荐量的10倍为其中一个剂量，另设二个剂量组。

必要时设阳性对照组。

选做免疫低下模型法时，应设模型对照组。

受试样品给予时间四周或30天。

4．免疫功能低下动物模型可选用环磷酰胺、氢化可的松或其他合适的免疫抑制剂进行药物造模。

4.1 造模原理：4.1.1环磷酰胺主要通过DNA烷基化破坏DNA的合成而非特异性地杀伤淋巴细胞，并可抑制淋巴细胞转化；环磷酰胺对B细胞的抑制比T细胞强，一般对体液免疫有很强的抑制作用，对NK细胞的抑制作用较弱。

4.1.2氢化可的松主要通过与相应受体结合成复合物后进入细胞核，阻碍NF-κB 进入细胞核，抑制细胞因子与炎症介质的合成和释放，达到免疫抑制目的。

氢化可的松还可损伤浆细胞，抑制巨噬细胞对抗原的吞噬、处理、和呈递作用，所以氢化可的松对细胞免疫、体液免疫和巨噬细胞的吞噬、NK作用都有一定的抑制作用。

4.2 免疫抑制剂剂量选择环磷酰胺可选择40mg／kg，腹腔注射，连续两天，末次注射给药后第5天测定各项指标；氢化可的松可选择40mg／kg，肌内注射，隔天一次，共5次，末次注射给药后次日测定各项指标。

各指标对两种模型敏感性不同，环磷酰胺模型比较适合抗体生成细胞检测、血清溶血素测定、白细胞总数测定；氢化可的松模型比较适合迟发型变态反应、碳廓清实验、腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球实验、NK细胞活性测定，建议根据不同的免疫功能指标选择合适的模型。

4.3 受试物给予连续给予受试物4周或30天，在第3周后开始给予免疫抑制剂，进行模型与预防性给药相结合的实验。

5. 实验方法5.1血液白细胞数测定小鼠外周血白细胞总数和淋巴细胞数检测方法(仪器法)全血用EDTA·K2抗凝后经血细胞分析仪检测，可测定白细胞数量，并可对白细胞进行分分类计数。

5.1.1仪器和材料乙二胺四乙酸二钾（EDTA·K2·2H2O，MW404.47），离心管，全血细胞分析仪上样管，眼科镊子，振荡器，加样枪，冷冻离心机，全血细胞分析仪。

5.1.2实验步骤5.1.2.1试剂配制血液抗凝：EDTA·K能与血液中的钙离子结合成为螯合物，从而阻止血液凝2可阻止1ml血液凝固。

固，1.5～2.2mg的EDTA·K2加纯净水至100ml制成抗凝剂，50μl抗凝抗凝剂配制：称量8mg EDTA·K2剂可抗凝1ml小鼠全血。

5.1.2.2采血以摘除小鼠眼球的方法采集全血，采用干净无菌的眼科镊子摘取小鼠一侧或双侧眼球，让血液自由滴入装有抗凝剂的1.5ml离心管（或商品化的抗凝管）中，采血过程中不断混匀血液与抗凝剂防止血液凝固，每只动物采集抗凝全血约1ml。

5.1.2.3检测分析上机前血液颠倒混匀，注意检查是否存在凝块。

在24h内以全血细胞分析仪检测白细胞总数和淋巴细胞数。

上机操作参照仪器说明书。

5.1.3数据分析一般采用方差分析，按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算，P≤0.05，用F值，p＞0.05，结论：各组均数间差异无显著性意义；F值≥F0.05多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐性要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

受试样品组的白细胞总数显著高于阴性对照组，可判定该项实验结果阳性。

5.2 ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验可任选下列方法之一5.2.1 MTT法5.2.1.1 原理当T淋巴细胞受ConA刺激后发生母细胞增殖反应，活细胞特别是增殖细胞通过线粒体水解酶将 MTT（一种淡黄色的唑氮盐）分解为兰紫色结晶而显色，其光密度值能反映细胞的增殖情况。

5.2.1.2 仪器和材料RPMI1640 细胞培养液、小牛血清、2-巯基乙醇（2-ME）、青霉素、链霉素、刀豆蛋白A（ConA）、盐酸、异丙醇、MTT、Hank's液、PBS缓冲液（pH7.2-7.4）纱布、200目筛网、24孔培养板，96孔培养板（平底），手术器械、大号注射器内芯、二氧化碳培养箱、酶标仪、分光光度计、超净工作台、高压灭菌器、无菌滤器。

5.2.1.3 实验步骤5.2.1.3.1 试剂配制完全培养液 RPMI1640培养液过滤除菌，用前加入10％小牛血清， 1％谷氨酰胺（200mmol/L），青霉素（100U/mL），链霉素（100ug/L）及5×10－5mol/L 的2-巯基乙醇，用无菌的1mol/L的HCl或1mol/L的NaOH调pH至7.0-7.2，即完全培养液。

ConA液用双蒸水配制成100ug/mL的溶液，过滤除菌，在低温冰箱（-20℃）保存。

无菌Hank's液用前以3.5％的无菌NaHCO3调pH7.2-7.4。

MTT液将5mgMTT溶于1mL pH7.2的PBS中，现配现用。

酸性异丙醇溶液 96mL 异丙醇中加入4mL 1mol/L的HCl，临用前配制。

5.2.1.3.2 脾细胞悬液制备无菌取脾，置于盛有适量（3-5ml）无菌Hank's液平皿中，并在脾上面放置一块纱布，用大号注射器内芯轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。

经200目筛网过滤，用Hank's液洗2次，每次离心10min（1000r/min）。

然后将细胞悬浮于2mL的完全培养液中，用全自动细胞计数仪计数脾细胞，或用台酚兰染色计数活细胞数（应在95%以上），调整细胞浓度为3×106个/mL。

5.2.1.3.3 淋巴细胞增殖反应将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，一孔加75μl ConA 液（相当于7.5μg/mL），另一孔作为对照，置5％CO2，37℃CO2孵箱中培养72h。

培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT（5mg/mL）50μl/孔，继续培养4h。

培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，超声震荡（2秒）或人工吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。

然后分装到96孔培养板中，每个孔分装3孔作为平行样，用酶联免疫检测仪，以570nm波长测定光密度值。

也可将溶解液直接移入2mL比色杯中，分光光度计上在波长570nm测定OD值。

5.2.1.4 数据处理及结果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。