抗登革病毒人源单克隆抗体研制

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治疗性全人单克隆抗体_抗体研发的后起之秀

58中国处方药 2010.12 No.105推广Market治疗性全人单克隆抗体，抗体研发的后起之秀截至目前，全球共批准上市21个抗体药物，其中治疗性全人单抗药物占据了1/3，全人单抗是所有抗体药物中获批数量、研发速度和研发数量增长最快的一类。

在1997～2008年之间，一共有131个全人单克隆抗体候选产品进入临床研究，2001～2008年更是每年至少有11个候选产品进入临床研究。

在这131个候选产品中，88个候选产品在临床研究中进展顺利，而其他33候选产品终止了研究。

在这88个候选产品中，有7个候选产品处于Ⅲ期临床研究中，有51个候选产品处于Ⅱ期临床研究中，其他30个处于Ⅰ期临床研究。

获批成功率欠佳成功概率（POS）的计量指标包括单克隆抗体在美国的累积获批量以及临床分期间的转化率。

但是由于进入临床研究中的全人单克隆抗体在所有单克隆抗体中所占的比率太大，所以这个全人单克隆抗体的POS值也有局限。

1996年后一共有131个全人单克隆抗体进入临床研究，其中7个获批，33个终止了研究，仅仅只有20个候选产品进入Ⅲ期临床研究。

但是POS作为风险投资的关键指标，所以对其进行预先的评估非常重要。

根据目前的数据，全人单克隆抗体的累积获批率为17.5%（7/40，7为获得批准的产品数，40为获得批准的产品数加上终止研究的产品数）。

与人源化单克隆抗体的累积获批率相比，全人单克隆抗体略高（17.5% vs . 15%）。

但是由于目前全人单克隆抗体获在进入临床研究的单克隆抗体中，治疗性全人单克隆抗体是发展最快的一类。

尽管在20世纪70年代早期用于制备鼠型单克隆抗体的技术也可以用来制备全人单克隆抗体，但是由于生产条件的限制，当时很少有全人单克隆抗体能进入临床研究。

相对而言，鼠型单克隆抗体更容易进行大规模的生产，但是由于其具有免疫原性的鼠源性蛋白序列，其安全性和有效性都不尽如人意。

到了20世纪80年代中期，科学家们获得了各种小分子抗体、嵌合抗体、人源化抗体以及全人抗体，抗抗体的反应得到了明显的改善。

单克隆抗体研制最详细步骤

单克隆抗体研制最详细步骤一、单克隆抗体的概念抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。

常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。

一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。

即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。

因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。

由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。

因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。

随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。

1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤。

这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。

通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody），简称单抗。

与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。

单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次革命，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。

Kohler和Milstein两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。

二、杂交瘤技术（一）杂交瘤技术的诞生淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。

人源化单克隆抗体制备工艺

优点：其一是可以获得具有人体性质的单克隆抗体, 其二是分离抗体的
速度极快, 最快在1 周内即可完成抗体的分离工作。
核糖体展示技术
1997 年Hanes 等在Mattheakis 等的多聚核糖体展示技术的基础上进行改进建立了核糖体展示技术。
基本ne,September 26, 2012
一、Molecular Modeling and Structural Analysis of D9 Fv
D9 VH and VL mRNA was extracted from D9 hybridoma cells, amplified by Reverse Transcription-PCR and then sequenced. The deduced amino acid sequences are shown here.
抗体药物市场销售额增势不减，世界各国纷纷投入巨资开发这座“金矿”，全球医药巨头，如辉瑞、罗氏、诺华等更是不惜重金开发抗体药物。国内方面，成都康弘的郎沐表现出色，2014年上市8个月实现销售额1亿元，2015年销售额约3亿元。
在临床实践中，抗体药物也呈现愈发活跃的状态。美国詹森研究开发有限责任公司副总裁威廉·R·斯特罗尔表示，过去十年间，多种抗体治疗方法和新平台已被设计研发，未来抗体治疗的范围将进一步扩大。 “目前一些针对免疫肿瘤学的抗体已被研发，即将进入临床，为癌症患者、免疫功能紊乱、代谢障碍等患者提供更多治疗方法。”
抗体的现状
从1992年首个抗体药物Orthoclone上市以来，截至2016年03月，欧美日等主要市场共上市了61个抗体药物。2014年上市了6个抗体药物，2015 年上市了9个抗体药物，连续两年打破历史记录。2015年，61个抗体药物合计销售额达到906亿美元，与2014年相比增长了8.2%。从销售数据来看，前21位的抗体药物都超过了10亿美元。

登革热检测方法

附件1：免疫荧光法（IFA）检测IgG抗体试验材料：（1）DV1～4型抗原片：DV标准毒株感染C6/36或BHK21细胞制备，低温干燥保存；（2）对照：登革热患者恢复期血清（阳性对照），非登革热患者血清阴性对照）；（3）羊抗人（或兔抗人）IgG荧光素标记抗体；（4）常用稀释液：pH7.2～7.4PBS、伊文思兰等；（5）荧光显微镜。

检测步骤：（1）用pH7.4，0.02mol/LPBS稀释待检血清，从1：20开始做4倍连续稀释至需要的稀释度。

（2）取出抗原片，用蒸馏水漂洗后，冷风吹干。

（3）用加样器依次从高稀释度到低稀释度逐个加入已稀释的待检血清，加入量以覆盖细胞抗原面为准（若为双份血清，最好上排为急性期血清，下排为恢复期血清），在37℃水浴箱湿盒孵育30分钟（每次试验设阳、阴性对照）。

（4）用PBS震荡洗涤3次，每次5分钟，再用蒸馏水洗涤1次脱盐，冷风吹干。

（5）用含1：3万的伊文思兰PBS按工作浓度稀释荧光结合物，滴加各孔（以覆盖细胞抗原面为准），在37℃水浴箱湿盒孵育30分钟，然后同（4）洗涤、漂洗、吹干。

（6）荧光显微镜观察结果。

结果判断：细胞内病毒特异性荧光为黄绿色颗粒，分布在感染细胞的胞浆内。

根据特异性荧光颗粒多少、荧光亮度、阳性细胞在细胞总数中所占比例，可将免疫荧光反应大致区分为1～4个“＋”。

检测抗体滴度时，以能观察到明显特异性荧光反应（＞“＋”）最高血清稀释度的倒数表示。

意义：阳性结果，表明曾受到DV感染，＞1：80有诊断参考意义；恢复期血清抗体滴度比急性期抗体滴度有4倍或4倍以上升高则可确诊。

附件2：酶联免疫吸附试验（ELISA）检测单份和/或双份血清IgG抗体试验材料：（1）抗原：阳性抗原：采用C6/36细胞感染登革病毒培养物为阳性抗原。

阴性抗原：未接种病毒的正常C6/36细胞为阴性抗原对照。

（2）辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体；（3）缓冲液：包被液：pH9.6碳酸缓冲液；稀释液：pH7.4PBS（含5%脱脂奶）洗涤液：pH7.4PBS－T（0.05％吐温－20）；（4）显色液：A/B液（5）终止液：4NH2SO4 （6）酶标板、酶标仪。

简介单克隆抗体技术及其人源化技术

简介单克隆抗体技术及其人源化技术摘要：单克隆抗体从问世到目前广泛应用于临床，经历了一段曲折的发展历程，其中人源化抗体是一个重要的里程碑。

鼠源性mAb由于可引起免疫反应而削弱其疗效，因而逐渐被人源化mAb所取代，甚至出现全人mAb取代人源化mAb的趋势。

本文主要介绍了全人mAb的生产方法之一，转基因小鼠技术，并对该项技术的应用作了些展望。

关键词：单克隆抗体；人源化；转基因小鼠；Cre/LoxPAbstract:After its advent, monoclonal antibody has gone an uneven way to its present wide applications in clinical practices, during which the humanized antibody set an important milestone. Murine mAbs are trended to be replaced by humanized mAbs or even human mAbs as murine mAbs’ immuno-side effects may reduce therapeutic effects. The paper briefly introduces tansgenic mice technology as one of generating human mAbs methods as well as share some prospects.Key Words:Monoclonal Antibody(mAb); Humanization; Transgenic Mice; Cre/LoxP一、单克隆抗体背景介绍从1975年英国学者Milstein和德国学者Kohler利用小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞融合[1]，形成了可产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，该细胞既能产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。

单克隆抗体制备实验过程

单克隆抗体制备实验过程
抗体制备实验一般分为抗体克隆、筛选、纯化和表征四个步骤，其中
抗体克隆是抗体制备实验的前提步骤，克隆抗体是从雌配子小鼠体内得到
其对抗原的单克隆抗体，是抗体制备的关键步骤。

1. 合成抗原或者从天然资源中获取抗原：合成抗原包括多肽抗原
（如biotin-GSH等）和糖蛋白抗原（如活性细胞皮质激素等）；从天然
资源中获取抗原则包括病毒样本和免疫原，比如结核分枝杆菌的血清浆及
其他微生物。

2.接种抗原：根据抗原的不同，采用不同的接种方法，比如多肽抗原，可以采用皮下或肌肉注射的方法将抗原接种于雌配子小鼠身上，以致于小
鼠体内产生对抗原的抗体。

3.分离抗体：通过血液和胸腺组织中抗体的分离筛选，获取单克隆抗体。

4. 抗体克隆：从抗体分离所获得的抗体，经过细胞学的方法进行抗
体克隆。

克隆过程中，可以利用多肽抗原，利用细胞杂交的方法进行对单
克隆抗体的从cloned。

5.筛选单克隆抗体：利用免疫染色的方法进行抗体筛选和确认，以确
定抗体株。

6.抗体纯化：经过单克隆抗体筛选和确认后，可以利用离子交换柱等
方法进行抗体纯化，从而获得高纯度的抗体制剂。

人源化单克隆抗体的制备方法

人源化单克隆抗体的制备方法人源化单克隆抗体的制备方法1. 引言人源化单克隆抗体作为一种重要的生物药物，在医学诊断和治疗上发挥着重要的作用。

它们能够通过特异性结合目标物质，如病毒、癌细胞等，以识别、中和或破坏它们，具有广泛的应用前景。

人源化单克隆抗体通过将小鼠源的初始抗体进行改造和人源化，弥补了小鼠抗体在人体内产生反应的缺陷，进而提高了其临床应用的安全性和有效性。

2. 人源化单克隆抗体的制备方法2.1 选择目标抗原在制备人源化单克隆抗体之前，首先需要明确目标抗原。

这是指研究人员要制备对特定疾病或病原体具有高度特异性的抗体。

目标抗原的选择对于后续的实验设计和结果分析至关重要。

2.2 制备小鼠源的初始抗体为了制备人源化单克隆抗体，通常需要使用小鼠或其他动物作为初步制备抗体的源头。

研究人员通过免疫注射小鼠来激发其免疫系统产生特定抗原的抗体。

之后，从小鼠体内提取抗体进行初步鉴定和筛选。

2.3 克隆筛选通过克隆和筛选的过程，选择那些对目标抗原具有高度特异性的抗体克隆。

这一步骤的目的是从小鼠源的初始抗体中挑选出性能最佳的抗体克隆，为后续的人源化操作打下基础。

2.4 人源化改造人源化改造是将小鼠源的初始抗体转化为具有人源特性的抗体。

在这一步骤中，研究人员会通过基因工程技术将小鼠源抗体的大部分小鼠特异性区域替换为人源的同源区域，以减少人体对外源蛋白的免疫反应。

这可以通过重组DNA技术，将人源抗体的DNA序列嵌入到小鼠源抗体的DNA序列中，使其具有人源性。

2.5 生产和纯化经过人源化改造的抗体需要进行大规模的生产和纯化。

这通常通过基因工程的方法，在合适的细胞系中表达和生产抗体。

随后，使用各种纯化技术，如亲和层析、离子交换层析等，将抗体从混合物中纯化出来，以获得高纯度的人源化单克隆抗体。

3. 个人观点和理解人源化单克隆抗体的制备方法是一项复杂的过程，其中涉及到多个关键步骤和技术。

通过人源化改造，可以将小鼠源的初始抗体转化为具有人源特性的抗体，从而提高其在人体内的安全性和有效性。

人源化单克隆抗体技术路线

人源化单克隆抗体技术路线
人源化单克隆抗体技术是一种用于制备治疗性抗体的方法，其基本技术路线如下：
1. 抗原选择：选择目标抗原，即希望产生抗体针对的特定蛋白质或分子。

2. 免疫动物：给动物（通常是小鼠）注射目标抗原，以诱导免疫反应。

3. 杂交瘤技术：从免疫动物的脾脏中分离出 B 淋巴细胞，并与骨髓瘤细胞进行融合，形成杂交瘤细胞。

4. 抗体筛选：对杂交瘤细胞进行筛选，以找到能够产生针对目标抗原的特异性抗体的细胞株。

5. 抗体人源化：通过基因工程技术，将鼠源抗体的互补决定区（CDR）移植到人源抗体的框架区，从而构建出人源化抗体。

6. 表达和纯化：将人源化抗体基因导入适当的表达系统（如哺乳动物细胞、酵母或细菌）中进行表达，并通过纯化步骤获得高纯度的人源化单克隆抗体。

7. 功能和质量评估：对人源化单克隆抗体进行生物学活性、亲和力、特异性等方面的评估，以及进行质量控制和安全性测试。

8. 临床试验和批准：经过临床前研究后，将人源化单克隆抗体进行临床试验，以评估其安全性和有效性。

如果试验结果良好，该抗体可能获得监管机构的批准，用于临床治疗。

人源化单克隆抗体技术的发展使得治疗性抗体能够更好地应用于人类疾病的治疗，减少了免疫原性反应的风险，并提高了抗体的治疗效果。

这一技术在肿瘤治疗、自身免疫疾病治疗等领域具有重要的应用价值。

登革热病毒(DENV)包膜蛋白特异性人源抗体筛选与鉴定

中国人兽共患病学报C h i n e s e J o u r n a l o f Z o o n o s e s㊀２０１８,３４(１０)D O I :１０．３９６９/j．i s s n ．１００２－２６９４．２０１８．００．１９５实验研究登革热病毒(D E N V )包膜蛋白特异性人源抗体筛选与鉴定高㊀博１,２,郑㊀晖２,李㊀枢２,谢联辉３福建省重点项目(N o ．２０１３Y ０００２),国家质检总局科技计划项目(N o ．２０１６I K ０３２)通讯作者:谢联辉,E m a i l :x i e l h ＠f a f u ．e d u ．c n作者单位:１．福建农林大学生命科学院,福州㊀３５０００１;２．福建国际旅行卫生保健中心,福州㊀３５０００１;３．福建农林大学病毒所,福州㊀３５０００１摘㊀要:目的㊀建立自外周血快速筛选识别登革热病毒衣壳的人源抗体的方法,从病毒感染者外周血记忆B 细胞中筛选出特异性抗体并进行性质分析.方法㊀通过流式细胞术分选得到外周血中登革热病毒包膜蛋白特异性的单个记忆B 细胞,结合高效单细胞P C R 技术获得抗体基因序列,对重组表达的单克隆抗体进行结合活性及中和活性检测.结果㊀成功筛选到识别D E N V Ｇ１包膜蛋白的６株人源单克隆抗体,其中４株抗体均具有很强的结合活性以及中和活性.结论㊀成功的通过流式细胞术对D E N V 特异性记忆B 细胞进行分选,并结合单细胞P C R 技术,实现了对D E N V 特异性人源单克隆抗体的高效筛选.通过该平台有希望筛选得到D E N V 的广谱中和抗体,用于登革热的预防和治疗.关键词:登革热病毒;衣壳蛋白;人源抗体;流式细胞术;单细胞P C R中图分类号:R ３７３．２㊀㊀㊀文献标识码:A ㊀㊀㊀文章编号:１００２－２６９４(２０１８)１０－０９２０－０７S c r e e n i n g a n d i d e n t i f i c a t i o no f h u m a na n t i b o d i e s a ga i n s t d e n g u e v i r u s (D E N V )e n v e l o pe p r o t e i n G A OB o １,２,Z H E N G H u i ２,L I S h u ２,X I EL i a n Ｇh u i３(１．S c h o o l o f L i f eS c i e n c e ,F u j i a nA g r i c u l t u r e a n dF o r e s t r y U n i v e r s i t y ,F u z h o u ３５０００１C h i n a ;２．F u ji a nI n t e r n a t i o n a lT r a v e lH e a l t hC e n t e r ,F u z h o u ３５０００１C h i n a ;３．I n s t i t u t e o f P l a n tV i r o l o g y ,F u j i a nA g r i c u l t u r e a n dF o r e s t r y U n i v e r s i t y ,F u z h o u ３５０００１,C h i n a )A b s t r a c t :W e a m i e d t oe s t a b l i s ham e t h o d f o r r a p i ds c r e e n i n g o fh u m a na n t i b o d i e sa g a i n s t d e n g u ev i r u s (D E N V )c a ps i d s f r o m p e r i p h e r a l b l o o d ,a n dt os c r e e ns p e c i f i ca n t i b o d i e sf r o m p e r i p h e r a lb l o o d m e m o r y Bc e l l so fv i r u s Ｇi n f e c t e d p a t i e n t sf o r q u a l i t a t i v e a n a l y s i s ．B y f l o wc y t o m e t r y ,D E N Ve n v e l o p e p r o t e i n Ｇs p e c i f i c m e m o r y Bc e l l s i n p e r i p h e r a lb l o o d w e r es i n g l e Ｇc e l l s o r t e d ．T h e g e n e s e q u e n c eo f a n t i b o d y w a sa m p l i f i e du s i n g e f f i c i e n t s i n g l e Ｇc e l lP C R．W ed e t e r m i n e dt h eb i n d i n g a c t i v i t y an d n e u t r a l i z a t i o n p o t e n c y o f r e c o m b i n a n t f u l l Ｇl e n g t ha n t i b o d i e s ．S i xh u m a n m o n o c l o n a l a n t i b o d i e sr e c o g n i z i n g D E N V Ｇ１e n v e l o p e p r o t e i nw e r e s u c c e s s f u l l y s c r e e n e d ,a n d f o u r o f t h e mh a d s t r o n g b i n d i n g a c t i v i t y a n dn e u t r a l i z i n g a c t i v i t y ．D E N V Ｇs pe c if i cm e m Ｇo r y Bc e l l sw e r e s u c c e s s f u l l y s o r t e db y f l o wc y t o m e t r y ,a n dD E N V Ｇs p e c i f i ch u m a n m o n o c l o n a l a n t i b o d i e sw e r ee f f i c i e n t l y ob Ｇt a i n e du s i n g s i n g l e Ｇc e l l P C R．T h e r e s u l t s r e v e a l ed t h a t i t i s h o pef u l t oo b t a i nD E N V Ｇs p e c i f i c a n t i b o d y w i t hb r o a d l y n e u t r a l i z i ng a c t i v i t y f o r th e p r e v e n ti o na n d t r e a t m e n t o f d e n gu e f e v e r ．K e yw o r d s :d e n g u e v i r u s ;c a p s i d ;h u m a na n t i b o d y ;f l o wc y t o m e t r y ;s i n g l e Ｇc e l l P C R S u p p o r t e db y t h eK e y P r o j e c t so fF u j i a nP r o v i n c e (N o ．２０１３Y ０００２)a n dt h eT e c h n o l o g y P r o j e c to fG e n e r a lA d m i n i s t r a t i o no f Q u a l i t y S u pe r v i s i o n (N o ．２０１６I K ０３２)C o r r e s p o n d i n g a u t h o r :X i eL i a n Ｇh u i ,E m a i l :x i e l h ＠f a f u ．e d u ．c n ㊀㊀登革病毒(D E N V )属于黄病毒属的单股正链R N A 病毒,以埃及伊蚊和白纹伊蚊为传播媒介.D E N V 基因组全长约１０~１１k b,只有１个开放读码框,共编码３个结构蛋白:衣壳蛋白(C )㊁膜蛋白(M )㊁包膜蛋白(E )和７个非结构蛋白(n o n Ｇs t r u c Ｇt u r a l pr o t e i n ,N S １~N S ５)[１Ｇ２].D E N V 包膜(E )蛋白０２９由３个结构域组成:E蛋白结构域１(E D１)是中心结构域,E D２是二聚化结构域并含有保守的融合环, E D３是推定的受体结合结构域[３].E蛋白占据病毒表面的大部分并且是体液免疫应答靶向的主要抗原[１,４].使用小鼠单克隆抗体进行的表位研究已经在E蛋白的表面上鉴定了至少１２个不同的表位,其中E D３上的表位能够激发起有效的中和抗体[４].其中４种血清型(D E N V１Ｇ４)的感染可导致患者出现轻度登革热发热㊁严重的登革热出血热和登革热休克综合征等症状,有些则成为无症状感染者[５Ｇ６].D E N V感染主要在热带和亚热带地区流行,在美洲㊁东地中海㊁东南亚和西太平洋地区报告的发病率最高.大多数登革热流行都是由单一血清型病毒引起的,偶有报道由两种或更多血清型引起流行[７].D E N V的４种血清型也可以在同一地区引起登革热流行病,已有报道我国广东省暴发过４种D E N V 血清型的流行,其中以D E N VＧ１流行为主[８Ｇ１０].在过去的几十年,全球约有４亿人每年感染登革热病毒,其中约有１亿人出现不同程度的症状[１１].在医疗保健系统发达的国家中,登革热的死亡率非常低.然而,登革热的经济负担很高,最近估计登革热治疗的全球成本为每年８０亿至９０亿美元[１２]四价减毒活疫苗(D e n g v a x i a)已经成在许多国家获得许可[１３].然而,登革热血清阴性的接种人群,在之后的登革热感染时会出现明显的病情加重,事实上,这种疫苗现在已在菲律宾停止使用.因此,需要针对该病毒的有效治疗方法.抗体治疗正在成为一种针对病毒感染的潜在治疗方法.例如帕利珠单抗,其是人源化的小鼠单克隆抗体,基于儿童的临床试验,发现其显着降低由于R S V感染而住院的风险[１４].目前,多种技术手段都可应用于人源单克隆抗体筛选,其中记忆B细胞分离后培养及单细胞P C R技术应用最为广泛[１５Ｇ１７].此外,记忆B细胞永生化技术也发展的十分迅速,已经成功应用到肿瘤特异性抗体的筛选中.近期的研究中,通过应用登革热疫苗接种者或病毒天然感染者的浆细胞进行单细胞P C R,成功筛选得到多种人源登革热病毒特异性单克隆抗体,具有应用于临床治疗的潜力[１８Ｇ１９].在本研究中,我们使用流式细胞分选技术(F A C S)筛选得到登革热感染者外周血单核细胞中的抗原特异性记忆B细胞,通过单细胞P C R技术获得抗体基因序列,在此基础上纯化表达获得了６株特异性人源抗体.对获得的抗体性质进行了初步的鉴定,为开发高效的登革热检测方法及治疗药物提供了技术支持.１㊀材料与方法１．１㊀材料１．１．１㊀病例㊀该感染者在２０１４年广州市登革热暴发流行中被确诊,于确诊后４０d采集外周血样本１０m L于抗凝采血管中.通过梯度密度离心分离外周单核细胞(P B M C),储存于液氮中备用.４种型别重组E蛋白为本实验室生产.１．１．２㊀主要试剂㊀常用质粒p M D１８ＧT㊁p T TＧ５为实验室保存,其中p T TＧ５载体已构建抗体轻重链恒定区,用于抗体表达;常用菌株如D H５α㊁T o p１０购自T i a n g e n公司;细胞株B H KＧ２１㊁２９３E x p i购自A T C C;D M E M培养基㊁胎牛血清㊁P B S磷酸盐缓冲盐溶液㊁青霉素㊁链霉素均购于美国H y c l o n e公司.样品的核酸和质粒提取试剂购自Q I A G E N公司;羊抗人I g G H R P(F a bs p e c i f i c)购自P I E R C E公司; L i v e/d e a dＧA q u a㊁C D３ＧP e C y７㊁C D２０ＧF I T C㊁C D２７ＧP E㊁I g GＧB V４２１及链亲和素偶联的A P C等染色用荧光抗体购自B D公司,D E N VＧ１E蛋白生物素化试剂购自T h e r m o公司.抗体纯化介质购自G E公司;D N A㊁P r o t e i n M a r k e r购自T h e r m o公司.１．１．３㊀N e s t e dＧP C R引物㊀本研究所涉及的引物均由I n v i t r o g e n公司合成,具体引物设计方案参照文献[１６].１．２㊀方法１．２．１㊀单细胞分选㊀采集２０１４年广州市登革热暴发流行中被确诊的感染者外周血１０m L,采用常规F i c o l lＧP a q u e密度梯度离心,获得外周血单核细胞(P B M C).采用L i v e/d e a d㊁C D３㊁C D２０㊁C D２７㊁I g G㊁I g M和D E N VＧ１EＧb i o t i n这６个指标对抗原特异的记忆B细胞进行特异性标记,经B D A r i aⅢ分选型流式细胞仪进行数据采集和单细胞分选,用９６孔U 底细胞板进行细胞收集.１．２．２㊀逆转录P C R㊀在９６孔P C R板中进行逆转录操作.配置１４μL逆转录体系,各组分加入量为:１５０n g随机引物(p d(N)６,G E H e a l t h c a r e)㊁０．５μL d N T P(I n v i t r o g e n)㊁０．５％I g e p a l C AＧ６３０(S i g m a)㊁４U R N A s i n(P r o m e g a)㊁６U P r i m eR N A s e I n h i b i t o r (E p p e n d o r f)和５０US u p e r s c r i p tʻR I I I r e v e r s e t r a nＧs c r i p t a s e(I n v i t r o g e n),４２ħ,１０m i n;２５ħ,１０m i n;５０ħ,６０m i n;９４ħ,５m i n.逆转录结束后,将P C R板保存于－８０ħ冰箱.１．２．３㊀N e s t e dＧP C R㊀通过N e s t e dＧP C R对I g H,I gλ和I gκ可变区基因进行扩增,扩增体系为４０μL,各组分够成为:c D N A３．５m L㊁２０n m o l/L各引物㊁３００n M d N T P(I n v i t r o g e n)和１．２UH o t S t a rʻR T a q１２９１０期高㊀博等:登革热病毒(D E N V)包膜蛋白特异性人源抗体筛选与鉴定D N A p o l y m e r a s e(Q i a g e n).N e s t e dＧP C R反应条件为:９４ħ,３０s;５８ħ(I g H/I gκ)或者６０ħ(I gλ),３０s;７２ħ,５５s(第一轮P C R)或者４５s(第二轮P C R);循环数５０.应用２％琼脂糖核酸电泳,对N e s t e dＧP C R产物进行鉴定及回收.１．２．４㊀P C R产物纯化和克隆鉴定㊀N e s t e dＧP C R产物片段大小为５００b p,使用T I A N GE N回收试剂盒纯对鉴定为阳性的P C R产物进行回收,然后克隆至p M D１８ＧT载体.每个P C R产物挑取５个菌斑进行菌液P C R验证,提取阳性克隆质粒进行基因测序.１．２．５㊀抗体基因序列分析㊀将测序结果用M E G A ７读取,并将测序结果正确的序列在I MG T数据库中进行重链以及轻链的家系及突变情况等分析.１．２．６㊀抗体的表达及纯化㊀对纯化得到的重链及轻链可变区分别构建酶连位点,将来自每个单细胞的抗体可变基因的扩增c D N A克隆到含有人I g G１或I gκ恒定区的表达载体中,构建不同轻重链表达克隆,重组表达I g G１亚型抗体[２０].使用L i p oＧf e c t a m i n e T M２０００转染试剂盒(１１６６８Ｇ０１９,I n v i t r oＧg e n),用等量的编码重链和轻链的质粒转染２９３E x p i细胞.培养５d后,收集含有抗体的细胞上清,并使用P r o t e i nA介质(１７Ｇ１２７９Ｇ０３,G E H e a l t hＧc a r e)进行纯化.１．２．７㊀抗体结合活性测定㊀通过不同型别重组E 蛋白的酶联免疫吸附试验(E L I S A),对单克隆抗体与不同血清型D E N V的结合活性进行检测.包被E蛋白(D E N VＧ１:２２８Ｇ１１６８８,D E N VＧ２:２２８Ｇ１１６８９, D E N VＧ３:２２８Ｇ１１６９０,D E N VＧ４:２２８Ｇ１１６９１;R a yＧB i o t e c h)２００n g每孔于E L I S A板,４ħ过夜保存.然后每孔中加入２００μL５％脱脂奶粉,３７ħ下孵育２h进行封闭.呼吸道合胞病毒(R S V)特异性人源单克隆抗体作为阴性对照抗体,其与待检测单克隆抗体以初始浓度为３０μg/m L进行４倍倍比梯度稀释,然后加入１００μL各浓度,并在３７ħ下孵育１h. P B SＧT w e e n洗涤３次,加入羊a n t iＧ人I g G抗体(１ʒ５０００,v/v),３７ħ下孵育１h,P B SＧT w e e n洗涤３次.加入显色底物,３７ħ孵育１５m i n,终止显色并读取吸光度参数.根据读值,计算其抗体与抗原的结合活性.１．２．８㊀蚀斑减少中和试验(P R N T)测定抗体中和活性㊀将B H KＧ２１细胞(５ˑ１０５细胞/m L,２m L培养基)接种于６孔板中,３７ħ５％C O２条件下培养过夜.然后加入单克隆抗体Ｇ病毒混合液于B H KＧ２１细胞单层中,３７ħ下孵育１h.弃去培养上清液,加入８００μL１．２％营养甲基纤维素,３７ħ下培养４~５d.空斑形成后,用０．１％结晶紫染色３０m i n,观察斑块形成.汇总数据分析不同抗体中和活性.２㊀结㊀果２．１㊀D E N VＧ１特异性记忆B细胞分选㊀为了获得天然的轻重链抗体配对,本研究应用流式细胞分选系统,实现单个B细胞高效分选.本研究中分析的样本来源于２０１４年广东省登革热感染者,应用C D３㊁C D２０㊁C D２７㊁I g G㊁I g M及D E N VＧ１E蛋白等指标实现对P B M C中B细胞亚群的具体分析.记忆B细胞作为体液免疫应答的重要组成,成熟记忆细胞表面的B C R具有很强的抗原结合能力且长期存在于外周血中,因此本研究也选择记忆B细胞作为获得D E N V抗原特异性单克隆抗体基因的来源.分析结果表明,外周血中成熟记忆B细胞(A q u a－/C D３－/C D２０＋/C D２７＋/I g G＋)中D E N V E 蛋白特异性成熟记忆B细胞占比为０３２％,如图１.从１０m L外周血的单核细胞中共分选得到１１０个特异性单B细胞,用于后续的单细胞P C R.２．２㊀抗体表达与结合活性检测㊀抗体轻重链可变区为抗原特异性识别区域,通过获取该区域基因序列信息实现对抗体的序列进行分析及表达鉴定.已经广泛使用的单细胞P C R技术能够对I g H㊁I gλ和I gκ的可变区基因进行高效扩增.研究中单细胞P C R产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后,显示在分选得到的１１０个D E N V特异性B细胞中成功调取重链的有５５个,成功率为５０％,轻链的有７０个(４８个K a p p a型,２２个l a m b d a型),成功率为６３．６％.共得到２４株抗体轻重链基因配对,配对成功率为２１８％.采用G i b s o n装配方法将配对抗体轻重链可变区序列构建到含有人源I g G１或I gκ恒定区的表达载体中.经过酶切鉴定及序列比对,最终成功构建２４株抗体的表达克隆.配对抗体轻重链表达质粒等量转染到２９３E x p i真核表达细胞,悬浮培养５d后收集细胞培养上清.经过酶联免疫吸附试验(E L I S A)鉴定,其中６株为D E N V特异性单克隆抗体.通过P r o t e i nA介质对I g G１抗体进行纯化,纯化产物经离心浓缩后进行S D SＧP A G E电泳鉴定.结果如图２,各抗体的轻重链均可很好的表达,重链分子量大小为５０k D左右,轻链分子量大小为２５k D左右,与正常大小相符合.２２９中国人兽共患病学报２０１８,３４(１０)图１㊀D E N V 特异I g G＋记忆B 细胞群分析F i g ．１㊀A n a l y s i s o fD E N V Ｇs p e c i f i c I g G＋m e m o r y Bce l ls 图２㊀S D S ＧP A G E 凝胶电泳分析抗体轻重链表达F i g ．２㊀A n t i b o d i e sw e r e c h a r a c t e r i z e db y SD S ＧP A GE ㊀㊀通过重组E 蛋白的酶联免疫吸附试验(E L I S A ),对单克隆抗体与不同血清型D E N V E 蛋白的结合活性进行了检测,对E C ５０进行统计分析.结果如图３,这６株单克隆抗体具有D E N V 结合活性,其均为D E N V Ｇ１E 蛋白特异性单克隆抗体,在高浓度下与D E N V Ｇ２E 蛋白具有很弱的结合.在６株单克隆抗体中,４株单抗N Ｇ１㊁N Ｇ２㊁N Ｇ３和N Ｇ６具有与D E N C Ｇ１E 蛋白相近的结合活性,E C ５０分别为０．００６９μg /m L ㊁０．００６８μg /m L ㊁０．００５４μg/m L 和０．００６５μg /m L .此外,N Ｇ４与N Ｇ５的结合活性较差,N Ｇ５的E C ５０为２．０６μg/m L ,这应该与其识别表位的差异性或者抗体成熟度不够有关.２．３㊀抗体中和活性检测㊀通过蚀斑减少中和试验(P R N T )测定各抗体中和活性,结果如图４.因为筛选得到的单克隆抗体为D E N V Ｇ１特异性单克隆抗体,所以其只对D E N V Ｇ１病毒具有中和活性,对其他亚型均无中和能力.普遍认为中和活性与结合活性之间具有一定的相关性,本研究的中和结果也说明了这一观点.６株抗体中强结合活性的N Ｇ１㊁N Ｇ２㊁N Ｇ３和N Ｇ６均表现出很强的中和D E N V Ｇ１病毒３２９１０期高㊀博等:登革热病毒(D E N V )包膜蛋白特异性人源抗体筛选与鉴定图３㊀应用E L I S A 方法对抗体反应性进行检测F i g ．３㊀R e a c t i v i t y t e s t o fD E N V Ｇs pe c if i c a n t i b o d i es 图４㊀测定各抗体对不同亚型D E N V 的中和活性F i g ．４㊀N e u t r a l i z a t i o n t e s t o fD E N V Ｇs pe c if i c a n t i b o d i e s 的能力,其P R N T ５０分别为０．０１μg /m L ㊁０．０１４μg /m L ㊁０．０１４μg /m L 和０．０２３μg /m L .结合活性最差的N Ｇ５单克隆抗体P R N T ５０为２１．２４μg/m L .２．４㊀抗体可变区基因分析㊀配对抗体轻重链可变区基因序列上传至I MG T 数据库进行比对并分析.２４株抗体轻重链V 区基因与人源抗体原始家系一４２９中国人兽共患病学报２０１８,３４(１０)致性均达到９０％以上,说明调取的抗体基因未出现其他物种基因污染.验证为D E N VＧ１E蛋白特异性的６株单克隆抗体的轻重链基因序列分析结果见表１,其重链V基因家系为１Ｇ６９㊁５Ｇ５１和４Ｇ３０,轻链V基因家系来源为２Ｇ１４㊁３Ｇ１５㊁１Ｇ５１㊁１Ｇ３９和１Ｇ４７.与结合活性结果共同分析可以发现,高结合活性的NＧ１㊁NＧ２㊁NＧ３和NＧ６４株单抗均来源于１Ｇ６９家系.同时这４株单抗均有相似的C D R３氨基酸序列,可能识别相同的E蛋白抗原表位,且通过结合该表位能够高效的抑制病毒对细胞的感染.表１㊀不同抗体的轻重链V D J基因家系及C D R３氨基酸序列分析T a b．１㊀A n a l y s i s o fV D J g e n e f a m i l y o f l i g h t a n dh e a v y c h a i n sw i t hd i f f e r e n t a n t i b o d i e s,w h i c hw a s a c c e s s i b l e f r o mI M G TAB㊀㊀A:重链分析;B:轻链分析３㊀讨㊀论治疗性单克隆抗体的商业开发在２０世纪８０年代初开始,目前单克隆抗体药物已经被批准用于治疗多种疾病,范围从呼吸道合胞病毒感染,到某些癌症和多发性硬化症,甚至哮喘和类风湿性关节炎等疾病[２１Ｇ２３].在过去２５年,超过３０种I g G及其衍生物已被批准用于临床应用[２４].随着研究者对治疗性单克隆抗体研究的不断深入,其在治疗多种病毒的感染中发挥越来越重要的作用,尤其在呼吸道合胞病毒的治疗应用中[２５Ｇ２６].近几年,新兴的单个B 细胞抗体制备技术是一种体外克隆和表达单个抗原特异性B细胞抗体基因技术,这种方法保留了轻重链可变区的天然配对,具有基因多样性好㊁效率高㊁全人源㊁需要的细胞量少等优势[１５,１７,２７].本研究主要通过应用抗原特异I g G＋记忆B细胞流式筛选平台,对D E N V感染者P B M C中的E 蛋白特异I g G＋记忆B细胞进行分选.通过单细胞P C R共得到２４对轻重链配对抗体基因,经过表达后鉴定,其中６株单克隆抗体为E蛋白特异性的人源单克隆抗体.筛选得到的单克隆抗体与４种亚型的E蛋白结合活性存在明显差异,与D E N VＧ１E蛋白的结合活性最强.蚀斑减少中和试验检测结果表明,筛选得到的单克隆抗体对D E N VＧ１均具中和活性.其中NＧ１㊁NＧ２㊁NＧ３和NＧ６的D E N VＧ１病毒中和能力最强,该４株均来源于１Ｇ６９基因家系,具有相似的C D R３氨基酸序列,识别D E N VＧ１E蛋白上某一表位发挥很强的病毒中和能力.本研究在抗原特异性记忆B细胞中,成功筛选出具有高中和活性的抗D E N VＧ１人源单克隆抗体.这些抗体不仅能够作为开展D E N V研究的重要工具,而且也可能成为用于开发诊断及临床治疗的重要单克隆抗体.参考文献:[１]K u h nR J,Z h a n g W,R o s s m a n n MG,e t a l．S t r u c t u r eo f d e n g u e v i r u s:i m p l i c a t i o n 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I:１０．１０１６/S０１４０Ｇ６７３６(０７)６１６８７Ｇ０[６]S i mm o n sC P,F a r r a rJ J,v a n V i n hC h a u N,e ta l．D e n g u e[J]．N e wE n g l JM e d,２０１２,３６６(１５):１４２３Ｇ１４３２．[７]M o r e n sD M,R i g a uＧPér e z J G,Lóp e zＧC o r r e aR H,e t a l．D e n g u e i n p u e r t o r i c o,１９７７:p u b l i ch e a l t hr e s p o n s e t oc h a r a c t e r i z e a n d c o n t r o l a ne p i d e m i co f m u l t i p l es e r o t y p e s[J]．T h e A m e r i c a n J o u r n a l o fT r o p i c a lM e d i c i n ea n d H y g i e n e,１９８６,３５(１):１９７Ｇ２１１．D O I:１０．４２６９/a j t m h．１９８６．３５．１９７[８]W u W,B a i Z,Z h o uH,e t a l．M o l e c u l a r e p i d e m i o l o g y o f d e n g u e v i r u s e s i n s o u t h e r nC h i n a f r o m１９７８t o２００６[J]．V i r o l J,２０１１,８:３２２．D O I:１０．１１８６/１７４３Ｇ４２２XＧ８Ｇ３２２[９]J i a n g T,Y uX D,H o n g WX,e t a l．C oＧc i r c u l a t i o no f t w o g e n oＧt y p e s o f d e n g u e v i r u s s e r o t y p e３i nG u a n g z h o u,C h i n a,２００９[J]．V i r o l J,２０１２,９:１２５．D O I:１０．１１８６/１７４３Ｇ４２２XＧ９Ｇ１２５[１０]Z h a o H,D e n g Y Q,H o n g WX,e ta l．C o m p l e t e g e n o m es eＧq u e n c eo f d e n g u e v i r u s s e r o t y p e２C o s m o p o l i t a n g e n o t y p e s t r a i n i n G u a n g d o n g,C h i n a[J]．J V i r o l,２０１２,８６(２４):１３８０８Ｇ１３８０９．D O I:１０．１１２８/J V I．０２５６２Ｇ１２[１１]B h a t t S,G e t h i n g P W,B r a d y O J,e t a l．T h e g l o b a l d i s t r i b u t i o na n db u r d e n o f d e n g u e[J]．N a t u r e,２０１３,４９６(７４４６):５０４Ｇ５０７．D O I:１０．１０３８/n a t u r e１２０６０[１２]S h e p a r dD S,U n d u r r a g aE A,H a l a s aY A,e t a l．T h e g l o b a l e c oＧn o m i cb u r d e n o f d e n g u e:a s y s t e m a t i c a n a l y s i s[J]．T h eL a n c e tI n f e c t i o u sD i s e a s e s,２０１６,１６(８):９３５Ｇ９４１．D O I:１０．１０１６/s１４７３Ｇ３０９９(１６)００１４６Ｇ８[１３]H a d i n e g o r o S R,A r r e d o n d oＧG a r c i a J L,C a p e d i n g M R,e t a l．E fＧf i c a c y a n d l o n gＧt e r m s a f e t y o faD e ng u ev a c c i n e i nr e g i o n so fe n d e m i cd i s e a s e[J]．NE n g l JM e d,２０１５,３７３(１３):１１９５Ｇ２０６．D O I:１０．１０５６/NE J M o a１５０６２２３[１４]U t i d j i a nL H,H o g a n A,M i c h e l J,L o c a l i oA R,e ta l．C l i n i c a ld e c i s i o n s u p p o r t a n d p a l i v i z u m a b:am e a n s t o p r o t e c t f r o mr eＧs p i r a t o r y s y n c y t i a l v i r u s[J]．A p p lC l i nI n f o r m,２０１５,６(４):７６９Ｇ７８４．D O I:１０．４３３８/A C IＧ２０１５Ｇ０８ＧR AＧ００９６[１５]G o o d w i n E,G i l m a n M S A,W r a p p D,e ta l．I n f a n t s i n f e c t e d w i t hr e s p i r a t o r y s y n c y t i a lv i r u s g e n e r a t e p o t e n tn e u t r a l i z i n ga n t ib o d i e st h a tl ac ks o m a t i ch y p e r m u t a t i o n[J]．I mm u n i t y,２０１８,４８(２):３３９Ｇ３４９．D O I:１０．１０１６/j．i mm u n i．２０１８．０１．００５[１６]T i l l e rT,M e f f r eE,Y u r a s o vS,e ta l．E f f i c i e n t g e n e r a t i o no f m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s f r o ms i n g l e h u m a nBc e l l s b y s i n g l e c e l l R TＧP C Ra n d e x p r e s s i o nv e c t o r c l o n i n g[J]．J I mm u n o lM e t hＧo d s,２００８,３２９(１/２):１１２Ｇ１２４．D O I:１０．１０１６/j．j i m．２００７．０９．０１７[１７]X i a oX,C h e nY,V a r k e y R．e t a l．An o v e l a n t i b o d y d i s c o v e r y p l a t f o r mi d e n t i f i e sa n t iＧi n f l u e n z a A b r o a d l y n e u t r a l i z i n g a n t iＧb o d i e s f r o m h u m a n m e m o r y Bc e l l s[J]．MA b s,２０１６,８(５):９１６Ｇ９２７．D O I:１０．１０８０/１９４２０８６２．２０１６．１１７０２６３[１８]L uJ,W a n g R,X i aB,e t a l．P o t e n tn e u t r a l i z a t i o na b i l i t y o f ah u m a nm o n o c l o n a la n t i b o d y a g a i n s ts e r o t y p e１D e n g u ev i r u s[J]．F r o n t M i c r o b i o l,２０１８,９:１２１４．D O I:１０．３３８９/f m i c b．２０１８．０１２１４[１９]X u M,Z u e s tR,V e l u m a n i S,e t a l．A p o t e n t n e u t r a l i z i n g a n t iＧb o d y w i t ht h e r a p e u t ic p o t e n t i a la g a i n s ta l l f o u rs e r o t y p e so fd e n g u ev i r u s[J]．N P JV a c c i n e s,２０１７,２:２．D O I:１０．１０３８/s４１５４１Ｇ０１６Ｇ０００３Ｇ３[２０]K o e l s c h K,Z h e n g N Y,Z h a n g Q,e ta l．M a t u r eBc e l l sc l a s s s w i t c h e d t o I g Da r ea u t o r e a c t i v e i nh e a l t h y i n d i v i d u a l s[J]．JC l i n I n v e s t,２００７,１１７(６):１５５８Ｇ１５６５．D O I:１０．１１７２/J C I２７６２８[２１]D e s a iN R,G i u g l i a n oR P,Z h o uJ,e ta l．AM G１４５,a m o n oＧc l o n a l a n t i b od y a g a i n s tP C S K９,f a c i l i t a te s a c h i e v e m e n to fn aＧt i o n a l c h o l e s t e r o l e d u c a t i o n p r o g r a mＧa d u l t t r e a t m e n t p a n e l I I I l o wＧd e n s i t y l i p o p r o t e i nc h o l e s t e r o l g o a l sa m o n g h i g hＧr i s k p aＧt i e n t s:a na n a l y s i s f r o mt h eL A P L A C EＧT I M I５７t r i a l(L D LＧCa s s e s s m e n tw i t hP C S K９m o n o c l o n a l a n t ib o d y i n h i b i t i o nc o mＧb i n e dw i t hs t a t i nt h E r a p yＧt h r o m b o l y s i s i n m y oc a rd i a l i n f a r cＧt i o n５７)[J]．JA m C o l l C a r d i o l,２０１４,６３(５):４３０Ｇ４３３．D O I:１０．１０１６/j．j a c c．２０１３．０９．０４８[２２]M i z u t a n iN,N a b e T,Y o s h i n oS．I g E/a n t i g e nＧm e d i a t e de nＧh a n c e m e n t o f I g E p r o d u c t i o ni sa m e c h a n i s m u n d e r l y i n g t h ee x a c e r b a t i o no fa i r w a y i nf l a mm a t i o na n dr e m o d e l l i ng i n m i c e[J]．I mm u n o l o g y,２０１５,１４４(１):１０７Ｇ１１５．D O I:１０．１１１１/i mm．１２３５５[２３]S a v i c S,D i e b o l d J,Z i mm e r m a n nA K,e t a l．S c r e e n i n g f o rA L Ki nn o nＧs m a l l c e l l l u n g c a r c i n o m a s:５A４a n d D５F３a n t i b o d i e sp e r f o r me q u a l l y w e l l,b u t c o m b i n e du s ew i t hF I S Hi s r e c o mＧm e n d e d[J]．L u n g C a n c e r,２０１５,８９(２):１０４Ｇ１０９．D O I:１０．１０１６/j．l u n g c a n．２０１５．０５．０１２[２４]B e c kA,W u r c hT,B a i l l y C,e t a l．S t r a t e g i e s a n d c h a l l e n g e s f o r t h e n e x t g e n e r a t i o no f t h e r a p e u t i c a n t i b o d i e s[J]．N a tR e v I mＧm u n o l,２０１０,１０(５):３４５Ｇ３５２．D O I:１０．１０３８/n r i２７４７[２５]H u s s m a n J M,L iA,P a e sB,e t a l．Ar e v i e wo f c o s tＧe f f e c t i v eＧn e s s o f p a l i v i z u m a b f o r r e s p i r a t o r y s y n c y t i a l v i r u s[J]．E x p e r t R e vP h a r m a c o e c o n O u t c o m e s R e s,２０１２,１２(５):５５３Ｇ５６７．D O I:１０．１５８６/e r p．１２．４５[２６]Z h a n g T Y,Y u a nQ,Z h a o J H,e t a l．P r o l o n g e d s u p p r e s s i o no fH B Vi nm i c eb y a n o v e l a n t i b o d y t h a t t a r g e t s a u n i q u e e p i t o p eo nh e p a t i t i s B s u r f a c e a n t i g e n[J]．G u t,２０１６,６５(４):６５８Ｇ６７１．D O I:１０．１１３６/g u t j n lＧ２０１４Ｇ３０８９６４[２７]T i a n M,C h e n g C,C h e nX,e t a l．I n d u c t i o no fH I Vn e u t r a l iＧz i n g a n t i b o d y l i n e a g e s i n m i c e w i t hd i v e r s e p r e c u r s o rr e p e rＧt o i r e s[J]．C e l l,２０１６,１６６(６):１４７１Ｇ１４８４．D O I:１０．１０１６/j．c e l l．２０１６．０７．０２９收稿日期:２０１８Ｇ０８Ｇ０６㊀编辑:王晓欢６２９中国人兽共患病学报２０１８,３４(１０)。

单克隆抗体制备注意事项

单克隆抗体(McAb)制备技术1975年Khler和Milstein首次利用杂交瘤技术生产单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb)获得成功，开创了免疫学和分子生物学研究的新纪元，被人们誉为“免疫学中的一场革命”，该项技术具有巨大生命力和发展前景，目前已被成功地用于分子生物学、免疫学、细菌学、病毒学、生物化学、遗传学、药物学等许多领域的研究。

下面以抗空肠弯曲菌共同抗原McAb的制备为例，介绍McAb的制备技术。

一、材料和方法(一) 材料1 PRMI1640培养液 PRMI1640培养基粉104g，双蒸馏水1000ml，抽滤或高压蒸气灭菌，每瓶80ml分装。

2 完全PRMI1640培养液 PRMI1640培养液80ml,1mol/L Hepes2ml,0.2mol/L谷氨酰胺1ml，青、链霉素溶液(1000u/ml)1ml，灭活小牛血清20ml。

3 次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷(HT母液×100)次黄嘌呤1361mg，胸腺嘧核苷387mg，蒸馏水加至100ml。

在45～50℃水浴中溶解，过滤除菌，分装小试管，每支5ml，置-20℃中保存。

4 氨基喋呤(A母液×100)氨基喋呤176mg，蒸馏水90ml，1mol/L NaOH 0.5ml，加蒸馏水至100ml，再加0.5ml 1mol/L HCl中和，过滤除菌，分装小试管，每支5ml，置-20℃中保存。

5 HAT选择性培养基完全PRMI1640培养液100ml,100×HT母液1ml，100×A母液1ml。

用5%NaHCO3调整pH值至7.4左右。

6 HT培养液完全RPMI1640培养液100ml，100×HT母液1ml。

用5%NaHCO3调整pH值至7.4左右。

7 50%聚乙二醇(PEG)溶液将PEG(MW4000)放在试管内加盖，121.3℃高压蒸气灭菌20min。

使用前加入等量的pH值8.2无血清培养液，置56℃混合，直至完全溶解，移置37℃备用。

国内外单克隆抗体生产工艺流程和发展趋势

国内外单克隆抗体生产工艺流程和发展趋势下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

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单克隆抗体制备流程图

单抗制备流程1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。

这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。

制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。

一、细胞融合前准备(一) 免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。

一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。

1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。

下面以细胞性抗原为例的免疫方案:初次免疫1×10７／0.5ml ip (腹腔内注射)↓2～3周后第二次免疫1×10７／0.5ml ip↓3周后加强免疫(融合前三天) 1×10７／0.5ml ip或iv(静脉内注射)↓取脾融合2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。

要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。

商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。

初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射│(一般0.8～1ml 0.2ml／点)↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip│(ip剂量不宜超过0.5ml)↓3周后第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip│ (5～7天后采血测其效价，检测免疫效果)↓2～3周后加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。

抗CD52人源化单克隆抗体项目简介

抗CD52人源化单克隆抗体项目简介简介：阿仑单抗Campath(Alemtuzumab，欧洲商品名:MabCampath)于2013年和2014年分别获得EMBA和FDA批准用于多发性硬化症（MS）。

国内目前临床药物仅有干扰素类药物，如利比（干扰素β），疗效普通，难以遏制MS的发展。

阿仑单抗相对于利比效果显著，相对于其他疗效好的单抗药品理论上安全性更佳。

目前国内仅有一家阿仑单抗的药物申报，且申报时间已超过十年，申报适应症为白血病。

本项目的阿仑单抗目前已完成三批次临床药品生产，在国内申报时间优势明显，预计一年内完成一期临床审批。

预计上市后就有5亿销售额，全球MS药品市场有250亿美元，未来的潜力巨大。

一、背景CD52 表达于所有B细胞、T细胞、NK细胞、多数单核巨噬细胞、部分粒细胞表面，而红细胞和造血干细胞不表达，皮肤细胞和男性生殖器细胞也表达CD52。

对类风湿关节炎患者的一用长达20年的随访数据显示，使用阿仑单抗后不改变患者的免疫应答，仅仅改变患者的免疫状态，因此感染风险相对较小，显示其卓越的安全性。

阿仑单抗Campath(Alemtuzumab，欧洲商品名:MabCampath)是利用基因重组及单克隆抗体技术生产的人源化抗细胞表面CD52抗原的单克隆抗体，由赛诺菲旗下健赞（Genzyme）开发。

目前国外已经批准的适应症有两种：2001年FDA 批准用于慢性淋巴细胞白血病；2013年和2014年分别获得EMBA和FDA批准用于多发性硬化症（MS）。

同时阿仑单抗对一些自身免疫病中也有使用，如类风湿关节炎。

此外，临床应用还包括实体器官移植及骨髓移植后移植抗宿主病（GVHD）等。

目前公司计划以biosimilar申报多发性硬化症作为CD52的申报适应症，后续上市后申报慢性淋巴细胞胞血病，以及类风湿关节炎等其他自身免疫系统疾病。

二、阿仑单抗在治疗多发性硬化症的优势2.1国内无阿仑单抗申报多发性硬化症的竞争者药品名称企业名称最新申请事项申请号申请时间状态重组抗CD52人源化单克隆抗体注射液浙江海正药业股份有限公司|海正药业(杭州)有限公司申请临床已发批件CXSL14000912014年9月10日重组抗CD52人源化单克隆抗体注射液上海张江生物技术有限公司申请临床已发批件CXSL05000392005年4月29日目前张江生物和海正药业，均以慢性B淋巴细胞白血病为适应症申报，其中海正药业已经撤回，张江生物已经转让给安徽未名生物医药有限公司。

单克隆抗体的发明过程

1962年，日本科学家发现日本血凝型病毒能引起艾氏腹水瘤细胞融合的现象。 1965年，英国科学家进一步证实了灭活的病毒在适当的抗体发明人
色萨·米尔斯坦是一位阿根廷籍和英国籍的分子生物学家。出生于阿根廷的巴伊亚布兰卡（Bahia Blanca）。他于1952年毕业于布宜诺斯艾利斯（University of Buenos Aires），并于 1957年获得了博士学位。1958年，他依靠英国议会奖学金开始在英格兰剑桥大学研究生物化学，并于1960年获得了第二个哲学博士学位。
科学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫克隆这门生物技术叫克隆技术第一个时期是微生物克隆时期第二个时期是生物技术克隆时期第三个时期是动物克隆时期克隆1890年德国学者behring贝苓和日本学者北里用白喉外毒素免疫动物时发现在被免疫的动物血清中有一种能中和外毒素的物质称为抗毒素
单克隆抗体的发明过程
单克隆抗体产生
乔治斯·克勒 1946年生于西德慕尼黑，在西德的弗莱堡大学攻读生物学。后到英国医学研究院生物学研究所的米尔斯坦研究室留学。 1976年至1984年在巴塞尔免疫研究所工作。1984年起在马克斯.普朗克免疫学研究所从事研究工作，1986年起在弗莱堡大学担任教授，1995年因肺炎逝世。享年48岁。他是最年轻的诺贝尔生理学及医学奖金得主，获奖时年仅38岁。
克隆的成熟发展
抗体产生机制的发现
细胞融合技术的逐渐成熟
克隆
1963 年J.B.S.Haldane在题为“人类种族在未来二万年的生物可能性”的演讲上采用“克隆 (Clone)”的术语。科学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫“克隆”，这门生物技术叫“克隆技术” 第一个时期是微生物克隆时期
第二个时期是生物技术克隆时期
第三个时期是动物克隆时期

登革病毒初次感染患者循环登革病毒NS1抗原和抗体的动力学分析以及非标记技术对NS1单克隆抗体亲和力的测定

登革病毒初次感染患者循环登革病毒NS1抗原和抗体的动力学分析以及非标记技术对NS1单克隆抗体亲和力的测定登革热是一种由登革病毒(DengueVirus，DENV)引起的虫媒传染病，通过蚊子（以埃及伊蚊和白纹伊蚊为主）的叮咬在人群中传播。

人类感染DENV后将产生从轻到重的很大范围的临床症候群。

尽管绝大多登革热患者显示为一种类似流感样的自限性疾病，如登革热(DengueFever，DF)，然而患者的病情有可能发展到重症登革热，如登革出血热(DengueHemorrhageFever,DHF)或登革休克综合征(DengueShockSyndrome，DSS)。

在未能得到及时、有效治疗的情况下，重症登革热将对患者的生命造成巨大的威胁。

目前，登革热被认为是世界上最为关注的公共卫生问题，其原因主要在于该病的发病率高，流行范围广，并且缺乏行之有效的防治方法。

近50年来，尽管全世界在登革热的防治方面做了很多的努力，但是登革热的发病率还是呈现出急剧上升的趋势，给流行国家的卫生防控体系以及患者的家庭带来了沉重的经济负担。

DENV属于黄病毒科，黄病毒属，是一种有包膜的单股正链的RNA病毒，基因组大约11kb 长，包含一个开放性的阅读框，编码3个结构蛋白和7个非结构蛋白。

三种结构蛋白分别是衣壳蛋白(capsidprotein，C)，膜蛋白(membraneprotein，M)和包膜蛋白(envelopeprotein，E)。

7种非结构蛋白依次为NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5。

根据不同的E蛋白基因序列，DENV可被划分为四种血清型，DENV-1～4。

各种DENV的血清型之间存在60-70％的同源序列。

DENV的初次感染可以产生针对感染血清型的终生免疫保护反应，但对其它三型DENV仅有短暂而微弱的交叉免疫保护作用。

当二次感染的血清型不同于初次感染的血清型时，患者体内存在的非中和交叉反应性抗体或亚中和浓度的中和抗体可促进DENV进入Fc受体容受细胞，增加病毒的复制，容易导致严重的DHF/DSS的发生。