从组织样品中提取mRNA的操作方法
植物mRNA的提取方法及具体步骤
植物mRNA的提取方法及具体步骤mRNA的分离方法较多，其中以寡聚（dT）-纤维素柱层析法最为有效，已成为常规方法。
此法利用mRNA 3‘末端含有Poly（A+）的特点，在RNA流经寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱，经过两次寡聚（dT）纤维柱后，即可得到较高纯度的mRNA。
寡聚（dT）纤维素柱纯化mRNA：试剂试剂：1、3M醋酸钠（pH 5.2）2、0.1M NaOH3、1×上样缓冲液：20mM Tris-HCl（pH 7.6）；0.5M NaCl;1M EDTA（pH 8.0）；0.1%SLS（十二烷基氨酸钠。
配制时可先配制Tris-HCl（pH 7.6）、NaCl、EDTA（pH 8.0）的母液，经高压消毒后按各成分确切含量，经混合后再高压消毒，冷却至65℃时，加入经65℃温育（30min）的10%SLS至终浓度为0.1%.4、洗脱缓冲液：10mM Tris-HCl（pH 7.6）；1mM EDTA（pH 8.0）；0.05% SDS5、无水乙醇、70%乙醇6、DEPC试验步骤：1、将0.5-1.0g寡聚（dT）-纤维悬浮于0.1M的NaOH溶液中。
2、用DEPC处理的1ml注射器或适当的吸管，将寡聚（dT）-纤维素装柱0.5-1ml,用3倍柱床体积的DEPC H2O洗柱。
3、使用1×上样缓冲液洗柱，直至洗出液pH值小于8.0.4、将RNA溶解于DEPC H2O中，在65℃中温育10min左右，冷却至室温后加入等体2×上样缓冲液，混匀后上柱，立即收集流出液。
当RNA上样液全部进入柱床后，再用1×上样缓冲液洗柱，继续收集流出液。
5、将所有流出液于65℃加热5min,冷却至室温后再次上柱，收集流出液。
6、用5-10倍柱床体积的1×上样缓冲液洗柱，每管1ml分部收集，OD260测定RNA含量。
mRNA提取浓缩
1.4 mRNA的提取按照StarSpin 动物mRNA提取试剂盒中提取mRNA的方法，分别从美洲大蠊神经索、秀丽隐杆线虫中分离纯化mRNA，分离步骤如下：1.根据样品数量，将适量裂解液A（RA）和裂解液B（RB）按1：1混合，配成新鲜的裂解液。
2.新鲜组织：将剪碎的新鲜组织或液氮保存的组织放入10ml或15ml塑料离心管中，每50-100g组织加1ml新鲜配置的裂解液，用匀浆器匀浆30s左右。
3.小心将一裂解物转移至一新的1.5ml离心管中，加入0.2倍体积的氯仿，振荡器上充分震荡混匀30s。
4.室温12,000rpm离心3-5min。
5.小心吸取无色透明的水相（约600-800μl）并转移到离心吸附柱中，避免触及两相交界面处的DNA和蛋白质6.室温12,000rpm离心30s，弃除收集管中的废液。
7.向离心吸附柱中加入500μl通用漂洗液（WB），室温12,000rpm离心30s，弃除收集管中的废液。
8.再向离心吸附柱中加入500μl通用漂洗液（WB），室温12,000rpm离心30s，弃除收集管中的废液。
9.再次离心30s，弃除残留液体。
10.将离心吸附柱转移到一新的1.5ml RNase-free离心管中，加入50μlR NA洗脱液（RE）.11.室温12,000rpm离心30s，收集RNA溶液。
12.立即使用或适量分装后置于-80℃保存使用。
从总RNA中提取mRNA1.用离心管称取1mg Oligo（dT）纤维素，加入500μl结合液，混匀后室温放置5分钟。
2.室温200-2,000rpm离心30秒钟，小心吸取上清液。
3.取100μl 总RNA样品，65℃加热5分钟，如RNA体积不够，用RNase-free水补足。
4.加入等体积的结合液混匀，冷却到室温后，全部转移到装有Oligo（dT）纤维素的离心管中。
5.混匀后室温放置5分钟，期间颠倒混匀数次。
6.4℃200-2,000rpm离心5分钟，小心将不含mRNA的总RNA上清液转移到一个新的离心管中，冷冻保存作为阴性对照。
组织mRNA提取方法
组织mRNA提取方法（一）总RNA提取-Trizol法Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。
用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA 污染。
RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交， Poly(A)+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。
1、将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。
2、研磨液室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。
3、取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟。
4、弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟。
5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。
然后将RNA溶于水中，必要时可55℃-60℃水溶10分钟。
RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。
[注意]1、整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。
2、加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。
（二）mRNA提取由于mRNA末端含有多poly(A)+，当总RNA流径oligo(dT)纤维素时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA可被洗下，经过两次oligo(dT) 纤维素柱，可得到较纯的mRNA。
1、用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g oligo(dT)纤维素。
2、将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床体积为0.5-1.0ml，用3倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床。
提取mRNA与反转录
m RNA 提取：1、准备：1．0.1%的DEPC: 1mL DEPC 加1L纯水，搅拌，溶解（常温）。
（浸泡前分装200mL, 高压115℃，25 min）2. 镊子锡纸包裹200℃，4 h, 干热灭菌3．玻璃仪器干热灭菌4．枪头、Ependorf管需0.1%的DEPC浸泡过夜去除RNA酶。
2、mRNA 提取：1．6孔培养板中加入1ml/孔Trizol裂解细胞，并用枪头反复吹打。
2．4℃，12000rpm离心10min,以去除不溶性物质。
3．转移上清至Ependorf管中，15－30℃放置5 min, 以充分裂解核蛋白复合体。
4．按每1mL Trizol加入0.2 mL氯仿，剧烈振荡15s, 15－30℃放置2-3 min, 12000rpm 4℃离心15min。
5．小心转移上层水相至另一离心管中，每1mL Trizol加入0.5 mL异丙醇，充分缓慢混匀溶液后，15－30℃放置2-3 min沉淀mRNA, 12000rpm 4℃离心10min。
6．弃尽上清，加1 mL 75％乙醇，洗涤mRNA沉淀。
用涡旋振荡器短暂涡旋数秒，7500rpm 4℃离心5 min。
7．干燥RNA沉淀（注意不要完全沉淀），如还有溶液，可再离心一次。
加入适量DEPC 水溶解（看不清沉淀加20µL,看的到沉淀加30－40µL），于55－60℃水浴中孵育10 min, -70 ℃保存备用。
3、mRNA定量：紫外分光光度法：260nm 和280 nm两处读数的比值（A260/A280），可反映mRNA的纯度。
纯的mRNA的A260/A280为2.0，若低于次值，则有可能有蛋白质或酚的污染。
若是纯的mRNA，其含量＝A260 ×40µg/ml, (A260=1的溶液mRNA 含量约为40µg/ml)。
4、mRNA反转录：(Promega反转录酶)1.取样品RNA 2µg(3-4 µL), OligodT 2µL，DEPC水（高压灭菌）至15 µL。
mrna定位的方法
mrna定位的方法一、介绍mRNA定位是指确定细胞内mRNA分布的过程，它对于理解基因表达和蛋白质合成的调控机制非常重要。
本文将介绍几种常见的mRNA 定位方法。
二、原位杂交法原位杂交法是最早被使用的mRNA定位方法之一。
该方法利用互补配对的原理，在组织切片或单个细胞中检测目标mRNA的位置。
具体操作步骤如下：1. 制备探针：首先需要合成与目标mRNA互补的核酸探针，通常使用荧光染料或放射性同位素标记以便检测。
2. 样品处理：将组织切片或单个细胞进行固定和透明化处理，以便探针能够穿透进入样品内部。
3. 探针杂交：将标记有探针的核酸溶液加入样品中，让其与目标mRNA发生互补配对。
4. 检测信号：通过显微镜观察样品，并使用相应仪器检测荧光或放射性信号，确定目标mRNA在样品中的位置。
三、免疫组化法免疫组化法是一种利用特异性抗体来检测目标蛋白质或mRNA的方法。
该方法可用于检测单个细胞中的mRNA，但对于组织切片的应用更为广泛。
具体操作步骤如下：1. 制备抗体：首先需要制备特异性抗体，可以是单克隆或多克隆抗体。
2. 样品处理：将组织切片或单个细胞进行固定和透明化处理。
3. 抗体反应：将抗体加入样品中，与目标mRNA结合形成复合物。
4. 信号检测：使用荧光染料或酶标记等方法检测复合物，并通过显微镜观察样品，确定目标mRNA在样品中的位置。
四、转录后修饰技术转录后修饰技术是一种利用分子生物学技术来检测mRNA在细胞内分布的方法。
该方法可用于检测单个细胞中的mRNA，但对于组织切片的应用更为广泛。
具体操作步骤如下：1. 构建报告基因：首先需要构建一个包含报告基因和目标mRNA结合序列的载体。
2. 转染：将构建好的载体转染到细胞中，使其能够表达报告基因。
3. 检测信号：通过荧光显微镜或流式细胞仪等方法检测报告基因的表达情况，确定目标mRNA在细胞内的位置。
五、结论mRNA定位是一项非常重要的实验技术，它可以帮助我们更好地理解基因表达和蛋白质合成调控机制。
mRNA提取注意事项
对于需要低温保存的试剂，应确 保储存环境的温度稳定，避免反
复冻融或温度波动。
在使用试剂时，应遵循试剂说明 书上的操作步骤和注意事项，避
免因误操作导致安全事故。
废物处理安全
对于实验过程中产生的废弃物，应按照规定分类存放，避免交叉污染和 危险品的混合。
对于有害废弃物，应按照规定进行无害化处理，确保不会对环境和人体 健康造成危害。
响其质量和稳定性。
对于长期保存的提取产物，应定 期进行质量检测，以确保其质量
和稳定性。
05
常见问题与解决方案
提取效率低
总结词
提取效率低可能是由于样品处理不当、试剂配比不合适或操作过程不规范等原 因导致的。
详细描述
为提高提取效率，应确保样品新鲜且保存得当，避免反复冻融；根据试剂盒说 明书合理配比试剂；严格按照操作步骤进行实验，避免不必要的误差。
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安全注意事项
实验操作安全
实验操作时应佩戴一次性手套，以防止直接接触试剂和样品，降低交叉污染的风险。
在实验过程中，应保持工作台面的整洁，及时清理废弃物，确保实验室的卫生和安 全。
在使用离心机时，应确保平衡放置，避免因不平衡导致机器震动或倾倒。
试剂储存与使用安全
对于易燃、易爆、易腐蚀的试剂， 应按照规定存放于阴凉、干燥、 通风良好的地方，远离火源和热
04
mRNA提取后的处理
提取产物的保存与运
提取产物应尽快进行低温保存，以防 止降解和污染。
在保存和运输过程中，应避免反复冻 融和剧烈震荡，以免影响提取产物的 质量。
提取产物应使用专用的RNA运输缓冲 液进行运输，以保持其稳定性和完整 性。
提取产物的质量检测
提取产物应进行完整性检测， 以确保RNA的完整性和无降解。
细胞提取mrna的方法
细胞提取mrna的方法细胞提取mRNA的方法一、引言mRNA（messenger RNA）是一种在细胞中起着基因表达调控和蛋白质合成的重要角色的核酸分子。
提取细胞中的mRNA能够帮助研究人员更深入地了解基因表达和调控的机制。
本文将介绍几种常用的细胞提取mRNA的方法。
二、离心法离心法是一种常用的细胞提取mRNA的方法。
该方法通过细胞的离心分离来获得纯净的mRNA。
具体步骤如下：1. 收集待提取mRNA的细胞样品，并进行细胞裂解，使细胞中的内容物释放出来。
2. 使用高速离心将细胞裂解液离心，将细胞碎片和细胞核沉淀下来。
3. 收集上清液，其中包含了mRNA。
4. 使用RNA提取试剂盒将mRNA从上清液中提取出来。
离心法的优点是操作简单，适用于大规模样本处理。
然而，离心法提取的mRNA含量可能较低，需要进一步纯化。
三、磁珠法磁珠法是一种高效的细胞提取mRNA的方法。
该方法利用磁性珠子上的寡聚核苷酸与mRNA互补配对，通过磁性分离来纯化mRNA。
具体步骤如下：1. 将细胞裂解液与磁性珠子混合，使磁性珠子与mRNA结合。
2. 使用磁场将磁性珠子与结合的mRNA沉淀下来。
3. 除去上清液，洗涤磁性珠子以去除杂质。
4. 使用RNA溶解液将mRNA从磁性珠子上洗脱下来。
磁珠法的优点是操作简便、迅速，并且能够提取高纯度的mRNA。
然而，该方法的成本较高，需要使用特殊的磁性珠子和设备。
四、硅胶柱法硅胶柱法是一种常用的细胞提取mRNA的方法。
该方法利用硅胶柱上的离子交换和亲和吸附原理来纯化mRNA。
具体步骤如下：1. 将细胞裂解液与硅胶柱混合，使mRNA与硅胶柱上的离子交换基团结合。
2. 通过洗涤步骤去除杂质。
3. 使用高盐溶液将mRNA从硅胶柱上洗脱下来。
硅胶柱法的优点是能够提取高质量的mRNA，适用于大规模样本处理。
然而，该方法对裂解液中的酶和盐浓度要求较高，操作相对繁琐。
五、直接反转录法直接反转录法是一种常用的细胞提取mRNA的方法。
简述mrna纯化的流程
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血清mrna提取方法
血清mrna提取方法英文回答：Serum mRNA extraction is a crucial step in many molecular biology experiments, as it allows researchers to analyze gene expression patterns in the blood. There are several methods available for extracting mRNA from serum samples, each with its own advantages and limitations.One commonly used method is the phenol-chloroform extraction method. This method involves the addition of phenol and chloroform to the serum sample, which helps to separate the different components of the sample. The phenol helps to denature proteins, while the chloroform helps to separate the aqueous and organic phases. After centrifugation, the mRNA is present in the aqueous phase and can be further purified using ethanol precipitation.Another method that is frequently used is the column-based RNA extraction method. This method utilizes a silica-based column that selectively binds RNA molecules, allowing for their purification from other cellular components. The serum sample is first lysed, and the RNA is bound to the column while contaminants are washed away. The purified RNA can then be eluted from the column and used for downstream applications.Both of these methods have their own advantages and disadvantages. The phenol-chloroform extraction method is relatively inexpensive and can yield high-quality RNA. However, it requires the use of hazardous chemicals and can be time-consuming. On the other hand, the column-based RNA extraction method is more user-friendly and less time-consuming. However, it can be more expensive and may not yield RNA of the same quality as the phenol-chloroform method.In summary, there are multiple methods available for serum mRNA extraction, including the phenol-chloroform extraction method and the column-based RNA extraction method. Each method has its own advantages and limitations, and the choice of method depends on factors such as cost,time, and desired RNA quality.中文回答：血清mRNA提取是许多分子生物学实验中的关键步骤，它使研究人员能够分析血液中基因表达模式。
mrna提取工艺 -回复
mrna提取工艺-回复Mrna提取工艺，一步一步回答引言：mRNA（即messenger RNA）是一种重要的生物分子，它在细胞内起着信息传递和蛋白质合成的关键作用。
提取mRNA是许多生物学和医学研究的关键步骤之一。
本文将介绍一种常用的mRNA提取工艺，并详细阐述每个步骤的操作方法和注意事项。
第一步：细胞溶解mRNA存在于细胞核内，我们首先需要将细胞溶解以释放细胞器和RNA 分子。
有两种常用的细胞溶解方法：化学溶解和机械溶解。
化学溶解方法一般使用细胞裂解液，如TRIzol、RNeasy等，将细胞裂解并释放RNA。
机械溶解方法则是通过高速离心、超声波或球磨等手段将细胞裂解。
第二步：RNA捕获一旦细胞裂解并释放RNA，我们需要选择合适的方法来捕获并富集目标RNA（即mRNA）。
常用的RNA捕获技术包括磁珠法、凝胶过滤法和固相萃取法。
其中，磁珠法是最为常用的一种方法，其原理是在磁性珠子上固定寡聚腺苷酸（poly dT），利用poly dT与mRNA中多聚腺苷酸序列的互补配对，将mRNA选择性地结合到磁珠上。
第三步：去除DNA、蛋白质和rRNA在捕获到mRNA后，我们需要去除其他不需要的RNA分子，如DNA、rRNA以及可能存在的蛋白质污染物。
这个步骤可以通过酶切、酸性沉淀和RNA结合柱等方法实现。
一种常用的去除DNA的方法是利用RNase-Free DNase对样品进行DNA酶切。
对于rRNA的去除，可以使用rRNA消除试剂盒，其中含有一系列的寡聚核苷酸探针，特异性结合rRNA，从而将其去除。
第四步：RNA洗涤和纯化经过前面的步骤，我们已经成功得到了富含目标mRNA的RNA样品。
为了去除残余的污染物和杂质，我们需要进行RNA洗涤和纯化。
常用的方法包括酒精沉淀法、硅胶柱纯化法和超滤法。
其中，酒精沉淀法是一种简单有效的方法。
通过加入合适的酒精溶液，使RNA沉淀下来，然后用70乙醇洗涤沉淀物，最后溶解RNA。
目的基因mrna提取
目的基因mrna提取目的基因mRNA提取技术在生物学研究和药物研发方面起着重要的作用。
本文将目的基因mRNA提取技术按照类别进行划分，介绍其原理、方法和应用。
第一类：反义转录法提取目的基因mRNA反义转录法是一种有效提取目的基因mRNA的方法。
该方法通过合成反义链DNA探针与目的基因mRNA互补结合，形成反义转录复合物。
然后加入RNase H酶，在反义链DNA上切割掉互补链表现，从而提取出目的基因mRNA。
这种方法具有高效、灵敏、特异性强的优点，适用于从复杂样本中提取单个mRNA的需要。
它已经应用于基因表达分析、基因调控研究和疾病诊断等领域。
第二类：亲和法提取目的基因mRNA亲和法也是一种常用的目的基因mRNA提取方法。
该方法利用有特异结合能力的亲和分子或分子印迹材料与目的基因mRNA进行结合，然后通过洗脱和离心等步骤，将目的基因mRNA提取出来。
亲和法的优点是选择性强，可以针对性地提取某个具体基因的mRNA，而不受其他RNA的干扰。
它已经被广泛应用于基因组学研究、蛋白质组学研究和药物研发等领域。
第三类：PCR法提取目的基因mRNAPCR法是一种快速、高效的DNA复制和扩增技术，也可以应用于目的基因mRNA提取。
该方法利用逆转录酶将目的基因mRNA反转录成cDNA，然后进行PCR扩增，最终得到所需的目的基因mRNA。
PCR法的优点是简单、灵活，可以快速提取目的基因mRNA，适用于大规模的高通量分析。
它已经广泛应用于基因表达定量、转录组学研究和药物敏感性筛选等领域。
目的基因mRNA提取技术在生物学研究中具有重要的应用价值。
它可以帮助我们了解基因的表达调控机制，揭示基因功能和诊断疾病的机制，甚至在精准医学中开发新的治疗方法。
随着生物学技术的不断发展和创新，相信目的基因mRNA提取技术将会更加完善和广泛应用。
在今后的研究实践中，我们应该不断深化对目的基因mRNA提取技术的理解，探索更多的方法和技术改进，以提高提取效率和提取纯度，为生命科学研究的进一步发展做出更大的贡献。
简述一种mrna检测方法
简述一种mrna检测方法
一种常用的mRNA检测方法是借助聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术。
该方法可通过复制和扩增RNA分子，从而得到足够多的mRNA可供检测。
下面是该方法的简要步骤：
1. RNA提取：从细胞或组织中提取RNA分子，可以使用RNA提取试剂盒或其他方法。
2. 反转录：使用反转录酶（reverse transcriptase）将RNA转录成cDNA（互补DNA）模板。
这一步骤使得mRNA转变为相对稳定的cDNA分子，便于后续PCR扩增。
3. 扩增：使用PCR技术，引物（primer）的选择应基于目标mRNA序列，将cDNA模板进行多轮扩增。
PCR反应的核心是通过多次循环进行DNA的变性（denaturation）、引物结合（annealing）和DNA合成（extension），从而扩增目标mRNA序列。
4. 分析：分离PCR产物，可以使用凝胶电泳等方法，核酸束缚染料（例如SYBR Green）可使扩增产物显示出荧光信号。
可通过与已知大小的DNA标记物比较PCR产物的迁移距离，确定目标mRNA的存在与否。
PCR方法具有高灵敏度和高特异性，能够检测和定量不同的mRNA分子。
此外，
也可以结合其他技术如定量PCR（qPCR）、实时荧光PCR等进行mRNA的定量、定位和表达研究。
mrna测序流程
mrna测序流程
mRNA测序流程主要包括以下几个步骤：
1. 总RNA提取：从细胞或组织中提取总RNA。
提取后的总RNA要进行纯度、浓度、完整性的质量检查。
不同样品的total RNA中mRNA含量差异较大，若total RNA起始投入量过低，不能保证有足够的mRNA用于后续建库，因此建议RNA起始量为1～4μg。
2. mRNA分离：由于总RNA中混杂着多种不同的RNA分子，需要通过逆转录反应将mRNA转化为cDNA。
3. cDNA文库构建：将cDNA连接到适当的接头上，并克隆到文库载体中，从而构建cDNA文库。
4. 文库质量检测：对构建好的文库进行质量检测，包括插入片段大小分布、阳性克隆比例等指标。
5. 高通量测序：将文库中的cDNA分子进行高通量测序。
6. 数据分析：对测序得到的数据进行质控及过滤，然后进行比对、表达量分析等生物信息学分析。
mRNA的获取
蛋白基因的获取——mRNA的获取原核表达必须要先获取基因，通常有以下几个途径：●从物种mRNA提取反转录到cDNA模板，通过引物特异性扩增获取。
●直接从质粒或提取的基因组扩增获取。
●基因合成：不易获取或者需要密码子优化的基因可以考虑基因合成。
1.mRNA的获取：动物组织及细胞mRNA的提取制备1.1准备工作1.1.1新鲜标本/-80冻存样本/液氮储存的标本（保证样品mRNA不降解）。
1.1.2购买无RNA酶耗材/器材或器材（匀浆器，离心管及枪头）作RNA酶清除处理：0.1%的DEPC水浸泡过夜后用蒸馏水清洗，126灭菌30min，或用蒸馏水浸泡清洗，灭菌三次。
1.2.1动物组织mRNA提取将组织样本转入匀浆器中，每100mg组织样本加入1ml Trizol提取液, 磨匀至无块状物【匀浆液】。
1.2.2细胞RNA提取●提取单层贴壁生长细胞RNA：吸尽培养液后，每5～10×106个细胞加入1ml的Trizol，室温放置5～10 min，每隔2min晃动一次裂解细胞。
●提取悬浮生长细胞的RNA：离心沉淀细胞，每5～10×106个细胞加1ml的Trizol，反复用枪吹打或剧烈震荡以裂解细胞。
注意事项：1.加入Trizol前应避免洗涤细胞而增加mRNA降解的可能性。
2.细胞充分裂解无团块。
1.3 将匀浆液转移至离心管中，室温放置5min。
1.4按匀浆液/氯仿=5:1的体积比加入氯仿，剧烈震荡15s后室温放置5min。
1.5 12,000rpm，4离心15min，吸取水相上清至新离心管中，加入等体积预冷的异丙醇，充分混匀后置-20 1～2h或室温0.5h。
1.6 12,000rpm，4离心10min弃上清，管底沉淀为RNA。
1.7 加入0.5～1ml 75%乙醇重悬洗涤RNA，12,000rpm离心5min。
1.8 小心吸净液体，加入50μl ddH2O，55 5～10min即可完全溶解。
液氮研磨提取mrna
液氮研磨提取mrna步骤如下：
1.将样品、收集管、勺子放在液氮中预冷。
2.将液氮小心加入并浸满研钵，浸泡预冷研杵与研钵（加入液氮
时，缓慢加入，防止液氮飞溅），一般加两次液氮就很好的预冷
了。
3.放入组织将组织迅速转移至液氮内，确保组织全部浸没在液氮
中。
4.破碎使用研杵在液氮中轻轻敲打组织，将组织打碎成小块，要
注意切勿用力过度，要防止组织块飞溅出研钵；在液氮即将挥
发完时，使用研杵对组织样本进行碾压研磨。
注意研磨过程要
朝着一个方向研磨。
5.中途补充液氮待液氮挥发完后，立即加入1/3研钵体积的液氮
（注意，加入液氮速度要缓慢，切勿使得液氮冲击力过大，将
组织样本冲出研钵）。
6.充分研磨2-3次迅速用研杵研磨组织，根据组织状态的变化程
度，在确保组织始终处于冰冻状态下，及时补充液氮进行研磨，
直至组织被研磨成粉末状。
7.收集聚拢样品最后再补充一次液氮聚拢粉末，用勺子搅拌粉末，
待液氮挥发完全粉末泛白。
mrna的分离与纯化
mrna的分离与纯化mRNA的分离与纯化引言：mRNA（messenger RNA）是一种重要的核酸分子，它在基因转录过程中起着关键的作用。
分离和纯化mRNA是生物学研究中常见的步骤，它可以帮助我们更好地理解基因表达调控、疾病发生机制等方面的问题。
本文将介绍一些常见的mRNA分离与纯化方法，并探讨它们的优缺点。
一、离心法离心法是最常用的mRNA分离与纯化方法之一。
它利用了mRNA与其他RNA分子的差异性，通过离心的方式将mRNA从总RNA中分离出来。
这种方法操作简单，适用于大多数样品类型。
然而，离心法无法完全去除DNA和rRNA的污染，因此在后续实验中可能会产生误差。
二、磁珠法磁珠法是一种高效的mRNA分离与纯化方法。
它利用表面修饰的磁性微珠与mRNA的亲和性来实现分离纯化。
相比于离心法，磁珠法可以更好地去除DNA和rRNA的污染，并且操作简便、快速。
然而，磁珠法的成本较高，需要配套的磁力分离设备。
三、凝胶电泳法凝胶电泳法是一种常见的mRNA分离与纯化方法。
它利用RNA在凝胶中的迁移速度差异来实现分离纯化。
凝胶电泳法可以有效地去除DNA和rRNA的污染，并且对样品的要求较低。
然而，凝胶电泳法需要较长的运行时间，并且对操作者的技术要求较高。
四、反向转录法反向转录法是一种常用的mRNA分离与纯化方法。
它利用反转录酶将mRNA转录为cDNA，再通过PCR扩增纯化所需的mRNA。
反向转录法可以去除绝大部分的DNA和rRNA污染，并且可以用于稀有mRNA的分离。
然而，反向转录法需要较长的实验时间，并且在PCR扩增过程中可能引入偏差。
结论：mRNA的分离与纯化是生物学研究中的重要步骤，它可以帮助我们更好地理解基因表达调控、疾病发生机制等方面的问题。
离心法、磁珠法、凝胶电泳法和反向转录法是常见的mRNA分离与纯化方法，它们各有优缺点。
选择合适的方法需要考虑样品类型、实验目的、实验时间和经费预算等因素。
随着技术的发展，相信会有更多更高效的mRNA分离与纯化方法被开发出来，为生物学研究提供更好的工具和手段。
mrna提取方法
mrna提取方法
嘿，咱今儿就来讲讲这 mRNA 提取的事儿哈！
你说这 mRNA 啊，就像是生命的密码携带者，要把它提取出来，
那可得有点小窍门呢！
先说说材料准备吧，就好比你要去打仗，总得先把武器装备准备好
不是？得有新鲜的细胞或者组织样本呀，这可是提取mRNA 的源头呢！然后呢，还得有各种试剂，就像你的得力助手。
提取 mRNA 的过程呢，有点像在一个大宝藏里找宝贝。
你得小心
翼翼地操作，不然宝贝就溜走啦！首先，得把样本处理得妥妥当当，
让它乖乖地把 mRNA 露出来。
然后呢，通过一些巧妙的方法，比如使
用特定的试剂，把 mRNA 从其他乱七八糟的东西里分离出来。
这就好比你在一堆沙子里找金子，得有耐心，还得有技巧。
比如说，有的方法就像是用一个超级大筛子，把大的杂质筛掉，留下小小的mRNA。
还有的呢，就像是用魔法棒轻轻一点，mRNA 就乖乖现身啦！
你想想啊，如果这个过程不仔细，那最后得到的 mRNA 可就不纯
净啦，就像金子里混了沙子，那可不行！所以啊，每一步都得谨慎再
谨慎。
提取出来之后呢，还得检测检测，看看咱得到的是不是真正的宝贝。
这就像是你找到了一个宝贝，得好好鉴定一下是不是真货呀！要是不
检测，万一弄错了，那不就白忙乎啦！
总之呢，mRNA 提取可不是一件简单的事儿，但只要你用心，有耐心，有技巧，肯定能把这个生命的密码顺利地提取出来。
这就像爬山
一样，虽然过程有点累，但当你爬到山顶，看到那美丽的风景，就会
觉得一切都值得啦！所以啊，加油吧，去探索这个神秘又有趣的
mRNA 提取世界！。
mRNA提取
mrna使用TRIZO L肯定没有什么好效果的，它只限于提取RNA,然后在使用Q IGEN或是PROMEGA的磁珠法试剂盒来提取1.样品一定要新鲜，对于MRNA来说首要的就是RNA的完整以及纯净，如果RNA都有所讲解的话，那么会影响MRNA的质量，如果是用来构库的话会影响库容量的。
所以小鼠我们就是一边杀，一边提取RNA，如果没有条件就带上液氮桶，然后马上提取，不新鲜的组织效果非常的差。
而且组织的量必须要足够，因为提取的MRNA是RNA的1%，而且要保证后续试验的用量。
2.选用的提取试剂盒是关键，比如Q IGEN有人说好有人说不好，这肯定和组织本身的MRNA丰度有关。
但是查阅文献大部分人用的就是QIGEN，他的基本原理还是使用纤维素。
而PROMAGE的盒子比较便宜，但是效果不如人意，它的损耗比较大，虽然磁珠法比较新颖，但是我自己试验很多次，发现起始量要很大才可以，国产上海华舜的比较不错，便宜而且纯度很好，我自己用的就是这个试剂盒。
关于提取MRNA最重要的就是组织的新鲜程度，如果是细胞就是细胞的数量，其次就是试剂盒的选择，第一次作的时候比较紧张不容易出现，总结经验慢慢就可以了我自己的程序mRNA提取(Promega,PolyATtract mRNA Isolation Sy stems)(Sy stemsⅢand Ⅳ，每次总RNA<1mg)玻璃仪器200°C烘烤过夜；塑料仪器在0.1N NaO H，1mM EDT A中彻底清洗,随后用无RNA酶水清洗；CO REX管用DEPC处理，不烘烤。
1．探针退火1.5mlEP管中加入总RNA（0.1mg~1.0mg）加入RNase-free水使体积至500μl65°C热休克10 min加入Biotiny lated-O ligo(dT) Probe3μl和20×SSC13μl，轻柔混合，室温孵育(<=10min)直至完全cool2．0.5 ×SSC,0.1×SSC准备1.2ml 0.5×SSC: 20×SSC(30μl)+RNase-free水(1.170ml)1.4ml 0.1×SSC: 20×SSC( 7μl)+RNase-free水(1.393ml)3.清洗Streptav idin-Paramagnetic Particles（SA-PMPs）轻触/弹（flick）SA-PMPs管的底部至SA-PMPs完全分散SA-PMPs管放在磁力架（Magnetic Stand）上，至SA-PMPs聚集在管一侧（约30秒）用枪小心移去液体（SA-PMPs不能离心）取下SA-PMPs管，加入0.5×SSC300μl，轻触/弹管底至SA-PMPs完全分散。
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从组织样品中提取mRNA的操作方法
当从组织样品中提取mRNA时，应先从表1中选择适当的分离方式和容器类型。
1. 从冰箱中取出GTC Extraction Buffer,Biotinylated
Oligo(dT)Probe,Nuclease-Free Water和SSC 0.5×Solution解冻到室
温。
预热Kilution Buffer至70℃。
（注意当预热Dilution Buffer的
时候不要加热超过70℃，并要尽量缩短加热时间。
过分的加热
会导致试管变形。
）
2. 在一个合适的试管中按每毫升Extraction Buffer加入41μl的比例
加入适当量的β-巯基乙醇（48.7%），使其最终的浓度为2%。
在此过程中应使用无RNase的移液头，以减少RNase的污染。
称
重该试管，并记录其重量。
3. 最快的速度将所要使用的组织块放入装有Extraction/BME Buffer
的试管中。
匀浆破碎该组织块，直至看不到可见的组织。
4. 称重该含有组织样品的试管。
并用此次的数值减去步骤2中的数
值计算组织块的重量。
5. 查阅使用说明按照步骤4中计算得到的结果计算Biotinylated
Oligo(dT)Probe和SA-PMPs的用量。
当加入的量少于50pmol的
Biotinylated Oligo(dT)的时候，将Probe用Nuclease-Free Water按
1:10的比例稀释。
稀释后的Probe保存于4-25℃。
6. 将预热的Dilution Buffer等分至无菌的试管中，按照每毫升
20.5μl的比例加入β-巯基乙醇，使其最终浓度为1%。
将其加
入匀浆的组织样品中，颠倒混匀。
按照步骤5中计算的量加入
Probe，震荡混匀。
70℃温浴5分钟。
7. 将溶解产物转移到一个干净的、无菌的15ml的试管中。
12000g
室温离心10分钟，去除溶解产物中的细胞碎片和蛋白质沉淀。
在离心过程中轻轻颠倒混匀SA-PMPs。
注意：离心应在室温中
进行，以减少盐份和去污剂的沉淀。
样品应在匀浆液中充分的
悬浮。
按步骤5的计算结果将液体转移到50ml无菌的或其他大小
适当的螺口管中，远离磁场。
将盛有SA-PMPs的试管放于磁场
中。
缓慢的将磁场移至水平方向，直到磁珠集中到试管壁上。
小心的倾斜试管将储存液倒掉。
8. 将SA-PMPs用0.5×的SSC溶液重新悬浮到原有的体积。
用磁场
收集磁珠。
用步骤7中所述的方法倒掉SSC溶液。
重复此清洗步
骤两次或更多次。
用0.5×的SSC溶液重新悬浮到原有的体积。
注意：不要离心。
9. 当匀浆液的离心结束后，小心的用无菌的移液头将上清移出，
不要移动沉淀。
匀浆液应为褐色半透明状。
将此沉淀加入到已
经清洗好的磁珠0.5×SSC溶液中，颠倒混匀。
10. 将上述混合液在室温温浴2分钟。
将磁场水平移近，捕获SA-
PMPs，直到匀浆液澄清。
按照步骤7中的方法到去上清，将其
储存于一无菌的试管中，直到确定mRNA抽提成功。
11. 将磁珠重新用0.5×SSC溶液悬浮，轻微的旋转试管混匀。
将混
合液移到试剂盒提供的mRNA User Tubes中。
用磁场捕获磁珠。
小心的用移液头移去SSC溶液。
重复此步骤两次。
最后将SSC溶液移净。
12. 洗提mRNA。
按表2加入适当量的Nuclease-Free Water，轻微的
旋转试管，重悬磁珠。
13. 用磁场捕获磁珠。
将含有mRNA的水溶液转移到另外一个无菌
的离心管中。
用Nuclase-Free Water重新悬浮磁珠，并放置于冰浴中保存，直到确认mRNA抽提成功。
14. 乙醇沉淀。
于提取液中加入0.1倍体积的醋酸盐和1.0倍体积的异
丙醇，-20℃放置过夜。
15. >12000g离心10分钟。
用70%的乙醇重新悬浮mRNA沉淀，并离
心。
小心的移去上清。
16. 短期保存：将mRNA沉淀干燥，用RNase-free的去离子水重悬沉
淀至0.5-1.0μg/μl，保存于-70℃。
此方法保存mRNA不可超过30天。
长期保存：将mRNA的沉淀-70℃保存于70%的乙醇中。
此发保存的mRNA可超过30天。