2014+干细胞移植规范化治疗失代偿期肝硬化的专家共识

・专家共识・干细胞移植规范化治疗失代偿期肝硬化的专家共识中华医学会医学工程学分会干细胞工程专业学组一、概述失代偿期肝硬化是指各种慢性肝脏损害所导致的肝病晚期阶段，主要表现为门脉高压、肝功能减退和不能满足人体的生理需求。

肝硬化最常见的病因为慢性病毒性肝炎。

我国是一个肝炎大国，人群乙型肝炎病毒携带率高达7.18﹪，丙型肝炎病毒感染率达3.2﹪。

此外，酒精性肝病、药物性肝病、自身免疫性肝病、遗传代谢性肝病等多种肝病的发病率逐年升高。

我国每年新增肝硬化病例数超过600万。

代偿期肝硬化患者多无临床症状，肝功能检测也在正常范围。

而失代偿期肝硬化患者多出现乏力、腹胀、纳差、腹水及黄疸，严重者常发生感染、水电解质或酸碱平衡紊乱、肝性脑病、肝肾综合征等多种并发症。

肝硬化一旦发展到失代偿期阶段尤其是并发大量腹水或上消化道出血时，患者的一年死亡率高达20﹪~57﹪。

据统计，我国每年有近100万人死于失代偿期肝硬化及其并发症。

目前对失代偿期肝硬化的治疗主要依靠保肝药物、输注白蛋白、利尿等内科常规方法以及针对出血的内镜和血管介入治疗，针对腹水的浓缩回输和腹腔穿刺抽放腹水等手段。

这些治疗措施虽能暂时改善临床症状，却不能逆转肝细胞数量日益减少导致的肝功能逐渐减退。

人工肝支持治疗是治疗急性、亚急性及慢加急性肝功能衰竭的有效方法之一，它为肝脏自身的再生及等待移植供肝争取了时间。

然而，人工肝支持治疗对于失代偿期肝硬化引起的慢性肝功能衰竭疗效却不尽人意。

目前，只有原位肝移植是治疗失代偿期肝硬化的有效手段，但由于供肝来源缺乏，只有少数患者能得到移植治疗。

即使成功接受了肝脏移植，术后的抗移植排斥反应、以及术后移植肝并发肝炎、肿瘤等问题，也是困扰医生及患者的难题。

因此，临床上迫切需要一种经济且有效的手段来治疗肝硬化失代偿期的患者。

近年来，干细胞移植作为促进肝功能恢复的一项新技术为失代偿期肝硬化患者提供了一种新的治疗选择。

肝脏自身具有一定的再生能力。

对于轻度的损伤，肝细胞通过增殖即可修复；对于较重或持续的损伤，肝脏干细胞被激活并参与到损伤修复中；当损伤程度超过肝细胞和肝脏干细胞修复能力时，骨髓干细胞（包括造血干细胞、间充质干细胞和内皮祖细胞等）被募集至损伤部位并发挥重要的修复功能。

骨髓干细胞可转分化为肝细胞以增加功能肝细胞的数量，也可通过与肝细胞融合促进损伤肝细胞的修复和功能的恢复[1-3]。

更多的研究认为，骨髓干细胞通过分泌多种细胞因子改变了肝脏局部的免疫微环境，进而促进了肝细胞的损伤修复和功能恢复[4-7]。

此外，大量的研究表明，低免疫原性的脐血干细胞和脐带间充质干细胞可用于异体移植并促进受体肝脏损伤修复[8]。

将骨髓来源的干细胞、脐血干细胞或脐带间充质干细胞通过肝动脉或外周静脉输注给失代偿期肝硬化患者，可增加干细胞在肝脏的富集与定植，进而促进患者肝功能的恢复。

根据干细胞的不同性质和不同来源，目前临床上干细胞移植治疗失代偿期肝硬化的方式分为6种：自体骨髓干细胞移植、自体外周血干细胞移植、自体造血干细胞移植、自体骨髓间充质干细胞移植、异基因脐血干细胞移植和异基因脐带间充质干细胞移植。

自体干细胞移植由于不存在异基因免疫排斥和胚胎干细胞的伦理学问题而应用前景广阔。

但对于部分患者，由于其自身遗传背景存在某些缺陷，自体干细胞移植治疗效果欠佳，异基因的干细胞移植可适用于此类患者。

有学者认为，对于肝炎病毒引起的失代偿期肝硬化，造血干细胞甚至巨噬细胞的治疗效果会较好；而对于酒精性肝病、药物性肝炎、自身免疫性肝病引起的失代偿期肝硬化，间充质干细胞的治疗效果较好[9-10]。

相对于从骨髓中直接分离获得的骨髓干细胞，外周血干细胞由于来自经粒细胞集落刺激因子（granulocyte-colony stimulating factor, G-CSF）动员的外周血而含有更多的造血干细胞。

因此，自体外周血干细胞移植、自体造血干细胞移植和异基因脐血干细胞移植可能更适宜于治疗DOI：10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2014.04.001作者单位：710032 西安，第四军医大学西京消化病医院由肝炎病毒引起的失代偿期肝硬化，而自体骨髓干细胞移植、自体骨髓间充质干细胞移植和异基因脐带间充质干细胞移植可能更适宜于治疗非病毒性失代偿期肝硬化。

需要指出的是，不同来源干细胞针对不同病因肝硬化的适应范围还需要进一步的临床研究以提供更高级别的循证医学依据。

干细胞移植多经肝动脉或外周静脉途径实施。

有少数研究者采用超声引导下经皮门静脉穿刺的方式，经门静脉途径移植干细胞。

但考虑到多数失代偿期肝硬化患者存在不同程度的门静脉高压和凝血机制障碍，门静脉穿刺存在较高的出血风险。

因此，一般不推荐经门静脉途径进行干细胞移植。

上述移植途径的优劣未明，但对于细胞数量较多的移植如异基因脐血干细胞和异基因脐带间充质干细胞等，多经外周静脉途径进行移植，而自体干细胞移植则多使用肝动脉途径。

二、干细胞移植的方法（一）自体骨髓干细胞移植[11-14]在层流无菌治疗室内，选患者双侧髂后上棘为采髓点，于局麻下抽取患者的骨髓血；在干细胞实验室内，从骨髓血中分离纯化获得骨髓单个核细胞；再到放射介入治疗室，借助血管介入将干细胞注射入患者的肝动脉。

骨髓血的采集量一般在150 ~ 200 ml，分离得到的骨髓单个核细胞总数在109以上。

由于失代偿期肝硬化患者通常存在不同程度凝血障碍和因脾功能亢进而引起的外周血血小板计数降低，多点骨髓穿刺存在一定的潜在出血风险。

可于术前通过改善肝功能、输注新鲜冰冻血浆等治疗措施改善患者的凝血功能。

为提高骨髓干细胞的含量，也可在采集骨髓前使用G-CSF短期动员骨髓[15-16]。

通常采用小剂量（2 ~ 4 μg/kg体重）的G-CSF动员2 ~ 3 d，之后按照上述方法进行骨髓抽取、干细胞分离和移植。

小剂量短期动员可促进骨髓干细胞的增殖，但并不促进骨髓干细胞向外周血的大量释放。

经此种方法获取的骨髓血含有更多的骨髓干细胞（数量可达1010 ~ 1012），有助于提高治疗效果。

（二）自体外周血干细胞移植[17-20]先使用G-CSF按照5 ~ 10 μg/kg体重的剂量对患者进行3 ~ 5 d的骨髓动员，将骨髓中的干细胞动员到外周血循环中，再通过专用的单个核细胞分离机从外周血中富集、分离富含造血干细胞的单个核细胞（数量通常大于109），最后借助血管介入将干细胞注射入患者的肝动脉。

骨髓动员过程中应每天监测外周血中的造血干细胞含量，当CD34+细胞数量达到106/kg体重时即可停止动员、转而进行干细胞的分离。

由于骨髓动员会使大量的有核细胞进入外周血循环、增加血液粘稠度，在正常人有增加血管内血栓形成的可能，但失代偿期肝硬化患者通常伴有凝血障碍和因脾功能亢进而引起的血小板计数降低，血栓形成的可能性并不会显著增加。

应当注意的是，骨髓动员会促进单个核细胞在脾脏的富集，这对于脾脏肿大的失代偿期肝硬化患者有发生脾破裂的潜在风险。

但临床上尚未有骨髓动员致脾破裂的报道。

（三）自体造血干细胞移植[21-22]CD34是人造血干细胞的主要标志，也有少部分造血干细胞不表达CD34但表达另一标志分子CD133。

自体造血干细胞移植即使用纯化的、自体CD34或CD133阳性的造血干细胞进行移植。

先按前述方法采集骨髓血，然后在干细胞实验室内进行造血干细胞的分离与扩增。

通常借助CD34或CD133抗体和免疫磁珠从骨髓血中分离造血干细胞，也可借助流式细胞仪分选CD34或CD133阳性的造血干细胞，之后在体外对造血干细胞进行适当的扩增，使其数量达到107以上，再收集细胞并经肝动脉途径移植回患者自身。

此方法可减少骨髓用量，但需要在体外扩增造血干细胞，具有一定的技术难度，需严格遵守相关质控标准和干细胞生物学行为状态的评估，并应在具备相应条件的干细胞实验室内进行。

（四）自体骨髓间充质干细胞移植[23-25]按前述方法制备骨髓干细胞。

在干细胞实验室内，对骨髓干细胞进行贴壁培养，藉此可去除不能贴壁生长的造血干细胞。

在培养过程中应添加间充质干细胞生长因子，并可通过流式细胞仪监测间充质干细胞表型CD34-CD45-CD105+。

当细胞数量达到107以上时，即可收集细胞并经肝动脉途径对患者进行移植治疗。

有研究表明，骨髓间充质干细胞的数量及增殖分化潜能随年龄的增长而下降，HBV 感染患者的骨髓间充质干细胞分化潜能和免疫调节功能显著降低[26-27]。

因此，不推荐对老年患者和肝炎病毒引起的失代偿期肝硬化患者进行自体骨髓间充质干细胞移植治疗。

（五）异基因脐血干细胞移植[28-29]选择健康足月产妇，并经产妇知情同意。

排除乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病、梅毒及其他传染性疾病，无病理妊娠。

胎儿娩出断脐后，消毒采血部位，应用装有血液保存液Ⅱ的一次性采血袋以封闭式采血法采血，每袋采脐血50 ~ 100 ml。

在干细胞实验室内，用负收集法分离提取脐带血干细胞。

每例提取的脐带血有核细胞总数应达107以上，以生理盐水稀释到5 ml，经肝动脉或外周静脉途径（通常采用肘正中静脉或前臂静脉）进行干细胞移植。

（六）异基因脐带间充质干细胞移植[30-32]脐带取自健康足月胎儿，并取得父母授权同意。

采用机械加酶学消化的方法将脐带分离成单个细胞。

对脐带细胞进行贴壁培养，在培养过程中应添加间充质干细胞生长因子，并通过流式细胞仪监测间充质干细胞表型CD34-CD45-CD105+。

虽然间充质干细胞在体外可被扩增至50 ~ 100代，但一般推荐使用4 ~ 6代以内的脐带间充质干细胞进行移植治疗。

移植的细胞数量应在107以上，可以经肝动脉或外周静脉途径（通常采用肘正中静脉或前臂静脉）进行移植。

三、临床应用（一）实施条件1. 技术准入：每一项移植治疗技术应当有完整的标准操作规范，申请国家或地方相关部门的审批，并经医院伦理委员会和新技术委员会批准。

2. 人员资质准入：负责骨髓、外周血、脐血、脐带采集以及干细胞分离的专业人员需要经过相关的业务培训。

患者的选择和干细胞的移植需要相关专业副主任医师以上人员负责实施。

3. 实验室设施和条件：有洁净度达1万级的实验室，需要生物安全柜、离心机和超净工作台。

拟开展外周血干细胞移植的单位要有血细胞分离机。

进行干细胞表型检测的还需要流式细胞仪。

（二）患者的选择1. 适应证：（1）各种病因导致的失代偿期肝硬化；（2）近一年内，虽经内科积极治疗，病情仍反复加重，至少因肝硬化并发症如大量腹水、自发性腹膜炎、消化道出血或肝性脑病住院1次以上；（3）需间断补充血浆白蛋白及口服利尿剂治疗；（4）血浆白蛋白小于35 g/L，总胆红素小于170 μmol/L，凝血酶原活动度大于30﹪（凝血酶原时间小于20 s），大量腹水控制到中等以下，自发性腹膜炎及肝性脑病已治愈，Child-pugh评分大于等于7分；（5）外周血血红蛋白浓度大于70 g/L，血小板大于3 × 109/L，红细胞比容大于0.25；（6）近一个月内无消化道出血病史；（7）无条件接受原位肝移植；（8）自愿签署知情同意书。