精选第八章+酶免疫技术资料
酶免疫技术原理
酶免疫技术原理酶免疫技术是一种常用的实验技术，其原理是将酶标记的抗体与待检测物相互作用，通过检测酶标记的反应产物来间接检测待检测物的存在或浓度。
酶免疫技术可以用于检测抗体、蛋白质、核酸等生物分子，也可以用于定量或半定量分析。
酶免疫技术的步骤通常包括以下几个步骤：1.抗原或抗体的加样和固定将待检测物加入到试剂盒中的孔洞中，然后使其在盒子表面固定。
2.疫苗抗体的反应将已知的疫苗抗体加入到试剂盒孔洞中，使其与待检测物结合。
3.标记酶的加入将用于标记酶的物质加入到试剂盒孔洞中，使其可以与疫苗抗体结合。
4.洗涤用冷凝水或其他方式，将未结合的物质从孔洞中提取出来，以保证准确性。
5.色素反应加入染料或颜料，使得待检测物和标记酶协同反应，产生色素反应。
6.结果的读取和分析根据产生的颜色和染料的浓度，来分析待检测物的浓度和质量。
酶免疫技术通常有两种形式：1.间接ELISA间接ELISA是酶免疫技术中最常用的一种方法。
它利用酶标记的二抗与待检测物的一抗结合，通过检测酶标记反应产物来间接检测待检测物的存在或浓度。
间接ELISA具有灵敏度高、特异性好、反应快、操作简便等特点。
2.竞争ELISA竞争ELISA是利用酶标记的抗体与水相抗原或待测物相竞争结合的一种方法。
当待测物或水相抗原与标记抗体竞争时，标记抗体附着在固定物上的数量姗姗而后，细胞内的信号会变弱或消失。
通过测定标记抗体的数量，可以计算出被测物质的含量。
酶免疫技术是一种有效的生物分析技术，其通过简单的实验流程和基于酶反应的原理，可以快速准确地检测分析生物分子的存在和浓度。
酶免疫技术在生物医学、环境科学、食品质量检测等领域有广泛的应用。
1.免疫学研究酶免疫技术在免疫学研究中有着重要的作用。
利用酶免疫技术，可以检测和定量各种免疫球蛋白、细胞因子和细胞表面标志物，研究它们在疾病状态和治疗方案中的作用。
2.临床诊断酶免疫技术在临床诊断中也有很重要的应用。
可以用于检测肿瘤标志物、气道标志物和血液蛋白等，帮助诊断癌症、哮喘和重症肌无力等疾病。
第八章酶免疫技术
酶放大免疫分析技术 示意图
克隆酶供体免疫分析示意图
克隆β-D半乳糖苷酶的两种片段： 酶受体（EA）和酶供体（ED）
二、异相酶免疫测定
与均相不同 之处
需分离游离与结合的酶标记物
分类：液相酶免疫测定 固相酶免疫测定
Ag+Ab-E
AgAb-E+Ab-E
物、激素等）
1、已知抗体包 被于载体表面
1、已知抗体包 被于载体表面
+
竞争法测抗原
-
E
E
E
3、加酶作用 的底物不显色 或显色弱
E
E
E
2、加待检物 抗原与酶标抗 原竞争与抗体 结合
2、加待测物 和酶标抗原， 酶标抗原与抗 体结合
E
E
3、加酶作用 的底物显色
ELISA检测抗体的方法
间接法
方法
用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗 抗体或二抗）加底物显色。
底物显色
1、固相化抗人 IgM 2、加待测物 特异性IgM与 非特异性IgM 和抗人IgM结合
1、固相化抗人 IgM
2、加待测物 只有非特异性IgM 和抗人IgM结合
3、加特异性 抗原，与特异 性抗体结合
E E E
3、加特异性抗 原，不能与非 特异性IgM结合
+
E
E
4、加酶标抗体 与特异性抗原结 合，加底物显色
原理
酶标记物与相应的抗原或抗体结合后， 标记酶的活性会发生改变，不用分离结合 和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性 的改变，而确定抗原或抗体的含量。
均相酶免疫测定
最具代表性的两种技术
酶免疫技术
酶活（高比活性）：RZ值 与酶活性无关，酶活性单 位比RZ值更为重要 .
辣根过氧
化物酶
RZ值：403nm（辅基） 与275nm（主酶）OD值之比
底物为H2O2：催化物无色 还原型染料生成有色氧化
型染料
1.3 酶和酶作用底物
辣根过氧化物酶（HRP）的底物
HRP
DH2+H2O2
D+2H2O
H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高
酶
辣根过氧化物酶 （HRP）
底物
邻苯二胺 四甲基联苯胺 氨基水杨酸 2,2‘-胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺 酸-6)铵盐 (ABTS)
显色反
应
橘红色 黄色 棕色 蓝绿色
测定波长 （nm）
492 460 449 642
碱性磷酸酯酶（AP） 4-硝基酚磷酸盐(PNP) 萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐
葡萄糖氧化酶
通过化学反应或免疫学反应，让酶与抗体或 抗原形成的结合物
2.1 酶标记抗原或抗体条件
抗原或抗体
❖ 抗原要求纯度高，抗原性完整。 ❖ 抗体需要特异性好、效价高、亲合力强以
及比活性较高，能批量生产，易纯化。
制备方法要求 ❖ 技术方法简单、产率高，重复性好。 ❖ 标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性。 ❖ 酶标记物稳定 ，不形成聚合物 。
ABTS+HRP+葡萄糖 葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰
β-Ｄ－半乳糖苷酶
甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG) 硝基酚半乳糖苷(ONPG)
黄色 红色 黄色 深蓝色
荧光 黄色
400 500 405 420
360,450 420
2. 酶标记抗原或抗体
酶免疫技术的核心组成部分
酶免疫技术
4.酶催化底物并显色。
用特异性抗原进行包被和制备酶 结合物。此法中受检标本不需稀 释，可直接用于测定，因此其敏 感度相对高于间接法。
抗原的两个以上的位点， 因此不能用双抗体夹心法进行测定，可采用竞争法模式
HRP常用底物
邻苯二胺（OPD）:反应后显橙黄色，酸终止后 呈棕黄色,最大吸收峰275nm。灵敏度高，比色 方便。但配成应用液后稳定性差,显色过程需避 光，且有致变异性.
四甲基联苯胺（TMB）:反应后显蓝色，目测鲜 明，酸终止后呈黄色，最大吸收峰450nm.稳定 性好，显色过程无需避光，无致变异性.
碱性磷酸酶（AP）：是一种磷酸酯的水解 酶，不易透入细胞内，但因其敏感性高， 空白值低，也较常用。底物常用的有对-硝 基苯磷酸酯(PNP)，产物为黄色的硝基酚， 测定波长为405nm。
ß-半乳糖苷酶（ ß-Gal）：来源于大肠埃希 氏菌，不受内源性酶干扰，底物为4-甲基 伞形酮--D-半乳糖苷，产物为高强度荧光 物4-甲基伞形酮，敏感性较HRP者高30-50 倍，测量时需用荧光计。
酶标记物的制备
一般要求 •技术方法简单、标记效率高、重复性好 •标记反应易控制，标记后不改变活性 •酶标记物较稳定，不聚合
改良过碘酸钠标记法
•只适用于HRP •过碘酸钠将HRP分子表面的多糖羟基氧化为 醛基，醛基可与抗体蛋白的游离氨基结合
•形成HRP-CH2-NH-IgG复合物 •再用硼氢化钠还原（终止反应） •优点是产率高
均相酶免疫测定
固相酶免疫测定
异相酶免疫测定
（ELISA）
液相酶免疫测定
酶的选择要求：
•活性高 •专一性好 •易与抗原、抗体偶联 •底物易得、易保存无毒害 •产物易测量 •酶与底物成本价廉
免疫学--酶免疫技术
Enzyme Immunoassay
❖ 酶免疫技术：
是用酶作标记物标记抗原或抗体，将抗 原抗体反应的特异性和酶高效催化反应的专 一性结合在一起的一种免疫检测技术。
本章主要内容
1.酶 标记物的制备 2.酶联免疫吸附试验 3. 酶免疫印迹试验 4. 生物素放大酶免疫技术
第一节 概述
一、技术原理 二、酶免疫技术的类型
是一种以膜为载体的酶免疫技术，以膜为载 体吸附抗原，加入抗体和酶标二抗，反应后 在膜表面形成免疫复合物，加底物显色进行 检测。
类型： 斑点酶免疫试验
（dot immunoenzyme filtration assay） 免疫印迹试验
（immuno-blotting test）
（一）斑点-酶联免疫吸附试验
❖ 生物素亲和素系统酶联免疫吸附试验 Biotin-Avidin System ELISA
一、生物素-亲和素系统
❖ 生物素： Biotin ❖ 亲和素： Avidin
生物素
➢维生素H ➢动、植物组织中广泛分布,
卵黄和肝含量高,现可人工合成 ➢MW 244.31kD ➢结构：咪唑酮环＋噻吩环（图）
PAP:
过氧化物酶(P)-抗过氧化物酶(AP)复合物
Ag-Ab1-桥Ab2-PAP-桥Ab2B-ABC-S
第六节均相酶免疫测定
❖ 酶放大免疫测定技术 ❖ 克隆酶供体免疫测定技术
第七节 酶免疫测定的应用
1. 病原体及其抗体测定 2. 蛋白质测定 3. 非肽类激素测定 4. 药物和毒品测定
思考题： 1. 酶免疫技术的类型。 2.ELISA的基本原理。
二、技术类型
（一）酶免疫测定技术与酶免疫组化技术 1. 酶免疫组织化学技术:
简述酶免疫技术的分类
酶免疫技术：分类及应用
酶免疫技术是许多生化分析和医学诊断中重要的一种工具。
它基于抗原与抗体间的特异性反应，将酶标记的抗体或抗原作为探针，通过检测其酶反应产物来检测并定量目标分子。
酶免疫技术种类繁多，主要分为以下几类：
1.酶联免疫吸附测定法(ELISA)
这是一种常用于诊断感染性疾病、肿瘤和免疫相关疾病的方法。
它利用酶标记的抗体或抗原作为探针，检测血清、尿液、唾液等生物样品中的分子。
ELISA可以快速、准确地检测出细菌和病毒感染的抗体和抗原，是一种常见的诊断方法。
2.免疫斑点法
由于其简单和方便的特点，这种技术常用于检测微透镜膜穴、肺结核和疱疹病毒的感染。
免疫斑点法也可用于检测各种细胞因子，如白细胞介素（IL）-2、干扰素（IFN）-γ等。
3.免疫层析技术
免疫层析技术也称为免疫固相卡，利用固相化学材料吸附抗体或抗原，将它们与待测分子结合，从而完成检测。
该技术可以快速完成检测，广泛用于检测激素、蛋白质等分子结构查询。
4.F快速诊断技术
该技术可用于基于解离测试的负压移位检测，可检测多种微生物、各种传染病以及不同种类的癌症。
快速诊断技术可以快速、准确地检测出更多感染疾病的标记分子，是一种非常灵敏的定量技术。
酶免疫技术已经广泛应用于医学诊断、药物开发和基因工程。
通过不同的酶免疫技术，可以检测、分析和探索多种分子的生物学特性，有助于促进科学研究和临床医学的进步和发展。
酶免疫技术
1、酶标记抗体免疫组化技术类型： （1）直接法：■-Ag + Ab*E → ■-Ag-Ab*E
优点：简单、快速、特异 缺点：一种酶标抗体只能测一种抗原，敏感性较差
（2）间接法：■-Ag + Ab1 + Ab2*E → ■-Ag-Ab1-Ab2*E
优点：一种酶标抗体能测多种抗原，实用性敏感性 较直接法好 缺点：敏感性低于非标记抗体酶法与三步法
（一）斑点-酶联免疫吸附试验 （dot-ELISA ）
原理：似ELISA，但载体为硝酸纤维素 （NC）膜。更灵敏、节约、简便，易 保存 以检测抗体为例：
Ag
Ab1？
Ab2-E
底物
（二）斑点-酶免疫渗滤试验 Immunofiltration Assay，IFA
原理：以NC膜为载体，利用微孔滤膜 的可滤过性，使抗原抗体反应和洗涤在 一特殊渗滤装置上以液体渗滤过膜的方 式迅速完成。以胶体金为标记物的金免 疫渗滤试验省却了酶对底物的反应，更 加简便快速。
（二）类
型
根据检测目的和操作步骤不同： 双抗体夹心法 间接法 竞争法 捕获法 dot-ELISA BAS-ELISA
双抗体夹心法
此法常用于测定抗原，适用于多价大分 子抗原的检测，而不能用于测定半抗原 等小分子物质。
双抗体夹心法
间接法
此法是测定抗体最常用的方法。
酶免疫标记用于抗原检测
（一）基本原理
酶标记抗体或抗原： 抗体或抗原的免疫学反应特异性 ＋ 酶活性 酶是一种有机催化剂： 使底物基质水解而呈色 使供氢体由无色还原型变为有色氧化型 ∴ 可用呈色反应显示酶的存在。 很少量的酶即可导致大量的催化过程， 所以极为敏感。
酶免疫技术讲义
激素等）
ELISA检测抗体的方法
间接法：用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人
IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。
双抗原夹心法（也可采用一步法）：用已知抗原包
被，加入待测血清，再加酶标抗原，加底物显色。应用：乙 型肝炎表面抗体
竞争法：用已知抗原包被，加入待测血清同时加酶标抗体，
2．双位点一步法
• 在双抗体夹心法基础上，进一步发展了 双位点一步法。该法使用针对抗原分子 上两个不同且空间距离较远的决定簇的 两种单克隆抗体，即包被使用一种单抗 ，酶标记使用另一种单抗。测定时将含 待测抗原标本和酶标抗体同时加入进行 反应，两种抗体互不干扰，经过一次温 育和洗涤后，即可加入底物进行显色测 定。
比色结果的表达以往通用光密度（optical density，OD），现按规定用吸光度 （absorbence，A），两者含义相同。
通常的表示方法是，将吸收波长写于A字母的 右下角，如OPD的吸收波长为492nm，表示方法 为"A492nm"或"OD492nm"。
How we will detect: read absorbance at 450 nm
第三节、酶联免疫吸附试验
( enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)
ELISA understanding the acronym
• EL
Enzyme-linked
– An enzyme’s activity is used as a “reporter” to test for the presence/amount of a proteis already adsorbed added to the wells and a second antibody with our enzyme will be added in the type of ELISA we will perform today.
免疫酶技术
包被浓度：0.1~100g/ml，一般常用 10 g/ml
包被时间、温度：4 ℃过夜或37 ℃
1-3h
包被量：100ul
封闭(blocking)：用1%~5% 牛血清 白蛋白或5%~20%小牛血清或脱脂牛 奶缓冲液浸泡 1~2小时
2.抗原抗体反应的条件
（1）微碱性有利于抗原抗体结合，故用 pH 7.4 PBS(phosphate buffer saline)洗涤
包被已知Ab
洗涤 加待测
标本（测Ag？）
洗涤 加
酶标Ab 洗涤
加底物
加终止液
观察结果
双抗体夹心法的基本实验过程
洗涤三次
终止液
• 该法主要用于检测抗原
• 包被的抗体与酶标抗体属同一种类 抗体
• 每检测一种抗原就需制备相应的酶 标抗体，较麻烦
（二）间接法测抗体
• 步骤：
• 包被已知Ag＋待测标本（测Ab？）
化学发光免疫技术是将发光
系统与免疫反应相结合，来检测 抗原、或抗体的方法。
化学发光免疫分析的类型
一.化学发光酶免疫测定
试验前部分与ELISA一样，使用 HRP或ALP来标记已知的Ab(或Ag)，与 待测标本中相应的Ag(或Ab)反应后，经 洗涤加入底物（发光剂），酶催化、分 解底物发光，用仪器检测发光强度，判 断结果。
技术类型：双抗体夹心法（测Ag)；
间接法(测Ab)
二.斑点免疫层析试验
（dot immunochromatographic assay， DICA)
以硝酸纤维素膜为载体，利用微孔膜毛细 管作用，使膜一端的液体慢慢向另一端渗移， 犹如层析
HCG金标试纸
带条中均匀含有胶体金 标记的鼠抗人HCG单抗
临床检验主管检验师临床免疫学和免疫检验-酶免疫技术 复习资料汇编
临床检验主管检验师临床免疫学和免疫检验酶免疫技术复习资料汇编概念：酶免疫技术是将抗原抗体反应的特异性和酶高效催化反应的专一性相结合的一种免疫检测技术。
既保留了抗体或抗原的免疫学活性，又保留了酶对底物的催化活性和生物放大作用。
可通过酶对底物的显色反应，对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析，提高了抗原抗体反应的敏感性。
一、酶免疫技术的特点既保留了抗体或抗原的免疫学活性，又保留了酶对底物的催化活性和生物放大作用。
可通过酶对底物的显色反应，对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析，提高了抗原抗体反应的敏感性。
（一）酶的要求一个酶蛋白分子每分钟可催化103～104个底物分子转变成有色产物，用酶标记抗体或抗原建立酶免疫测定法，可使免疫反应的结果得以放大，保证测定方法的灵敏度，为此用于标记的酶应符合下列要求：1.酶的活性要强，转化率高，纯度高。
2.易与抗体或抗原偶联，活性保持稳定。
3.作用专一性强，无内源性酶或抑制物。
4.易于判断或测量，方法简单、敏感和重复性好。
5.无害，易得。
（二）常用的酶1.辣根过氧化物酶（HRP）；HRP来源于蔬菜植物辣根中，分子量40kD，是由无色的糖蛋白（主酶）和亚铁血红蛋白（辅基）结合而成的复合物。
辅基是酶活性基团，最大吸收峰在波长403nm处；而主酶则与酶活性无关，最大吸收峰在275nm。
HRP的纯度用RZ表示，它是以HRP分别在403nm和275nm处的吸光度比值来表示的。
用于酶免疫技术的HRP，其RZ值应大于3.0。
RZ值仅说明血红素基团在HRP中的含量，并非表示HRP制剂的真正纯度，而且RZ值高的HRP并不意味着酶活性也高，RZ值与酶活性无关。
2.碱性磷酸酶（AP）AP是一种磷酸脂水解酶，可以从大肠杆菌或小牛肠黏膜提取，但两种来源的AP理化性质有所不同：菌源性AP分子量80kD，酶作用最适pH为8.0；肠黏膜AP分子量为100kD，最适pH为9.6；后一种AP的活性高于前者。
酶免疫技术
酶免疫技术（Enzyme Immunoassay，EIA）了解：1.酶免疫技术中相关技术环节2.酶免疫测定的应用理解：1.酶免疫技术的分类、测定原理及主要类型2.酶免疫技术的特点掌握：ELISA的基本原理、主要类型、方法、步骤、结果判断一、酶免疫技术概述（一）基本原理：利用酶催化底物反应的生物放大作用，提高特异性抗原-抗体反应的检测敏感性的一种标记免疫技术。
EIA：抗原抗体反应的特异性、酶高效催化的专一性（二）基本特点：1.①标记后保留酶和抗原(抗体)的活性2.②酶促反应专一性，保证特异性3.③底物反应放大作用，提高敏感性4.④酶标试剂保存稳定5.⑤操作简便，安全易行（三）主要试剂的制备与要求：1.酶与酶作用底物(1)用于标记酶的要求：①酶活性高②标记后酶活性稳定,不影响抗原抗体的免疫反应性③酶催化底物后信号易判定或测定④酶活性不受样品中其他成分的影响⑤酶、辅因子及底物理化性质稳定,安全无害、价廉2.酶标记抗体或抗原(1)通过化学反应或者免疫学反应，让酶与抗体或抗原形成结合物，也称酶标志物或酶结合物。
(2)酶结合物（conjugate）：①酶免疫技术的核心组成部分②直接影响酶免疫技术的应用效果③它的制备是酶免疫技术中非常关键的一个环节①戊二醛交联法②改良过碘酸钠法（直接法）3.固相载体目的：分离游离和结合的酶标志物(1)基本要求①结合容量高，结合稳定②可与抗原抗体复合物等大分子蛋白结合③生物大分子固化后仍保持活性④固化方法简便易行、快捷经济(2)固相载体的种类与选择1)塑料制品（聚苯乙烯）：材料经济，操作简便，易于自动化，最常用2)微颗粒（免疫磁珠）：结合容量大，反应迅速，普遍用于自动化分析3)膜载体（western-blot）：硝酸纤维素膜（NC）、尼龙膜等微孔滤膜，广泛应用于定性或半定量的斑点ELISA (3)包被与封闭1)包被（coating）：将抗原或抗体结合在固相载体上的过程，一般采用偏碱（pH 9.6）的碳酸盐溶液2)封闭（blocking）：1％-5％牛血清白蛋白或5％-20％小牛血清，再包被以消除固相载体未覆盖位点产生的非特异干扰二、酶免疫技术的分类（一）均相酶免疫测定基本原理利用酶标抗体结合抗原形成复合物后，标记酶的活性发生改变的原理，在不将复合物与游离酶标抗体分离的情况下，直接测定系统中总的标记酶活性的改变，进而推算出待检样品中的抗原量。
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异相酶免疫测定
克隆酶供体免疫测定
固相酶免疫测定：
酶联免疫吸附试验(ELISA)
液相酶免疫测定
24
一、均相酶免疫测定法
酶蛋白与抗原或抗体结合形成酶标记物。 未与抗原（抗体）结合的标记抗体（抗原），称为游离标记物。 与抗原（抗体）结合的标记抗体（抗原），称为结合标记物。
Ag+ Ab-E AgAb-E+ Ab-E （以标记Ab检测Ag为例）
是一种磷酸酯水解酶，从大肠酸 酯（ pNPP ）
经AP作用后的产物为黄色对 硝基酚，最大吸收峰波长为 405 nm。
敏感性高于HRP,但不易获得高纯度的制品、 稳定性差，价格贵
（三）β-半乳糖苷酶
（β-galactosidase，β-Gal）
源于大肠埃希菌 ，常用于均相酶免疫测定。
β-Gal 的底物
4-甲基伞酮基β-D半乳糖苷 （ 4MUG ）
酶作用后，生成高强度荧 光物 ，用荧光计测量。
二、酶标记抗体或抗原
酶免疫技术的核心组成部分
酶结合物 酶标记物
通过化学反应或免 疫学反应，让酶与 抗体或抗原形成的
结合物
（一）酶标记抗体或抗原的制备
技术方法简单、产率高，重复性 好
标记方法要求
• 酶标抗体（抗原） 与抗原（抗体）的 特异性反应
• 酶对底物的显色反 应
• 对抗原或抗体进行 定位、定性或定量 的测定分析
酶高效催化反 应的专一性
+
抗原抗体反应 的特异性
第一节 酶免疫技术的特点
基本原理
• 酶标抗体（抗原）
抗原
底物
与抗原（抗体）的 特异性反应
酶标抗体
E
E
E
• 酶对底物的显色反
应
• 对抗原或抗体进行 定位、定性或定量 的测定分析
HRP常用底物
邻苯二胺 OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应 后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，有致 癌性。 四甲基联苯胺 TMB反应后显蓝色 ，加酸终止 反应后变为黄色,测定波长450nm ，稳定，无致 癌性，ELISA中应用最广泛的底物。
（二）碱性磷酸酶
（alkaline phosphatase，AP)
一、酶和酶作用底物
（一）标记酶的要求： ①活性高，纯度高 ②作用专一性强 ③性质稳定，易与抗原或抗体偶联 ④测定方法简便易行、敏感、精确 ⑤酶和底物对人体无害 ⑥酶和底物价廉易得
（一）常用的酶
1、辣根过氧化物酶
（horseradish peroxidase ,HRP）
国内以辣根过氧化酶最为常用
糖蛋白（主酶） 亚铁血红素（辅基） 主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心
固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将 游离和结合的酶标记物迅速分离的最常 用方法
（一）固相载体的要求
•结合抗体或抗原的容量大 •抗体或抗原牢固地固定在其表面 •不影响免疫反应性 •利于反应充分进行 •固相方法简便易行，快速经济
（二）固相载体的种类
1．塑料制品 由聚苯 乙烯、聚氯乙烯制成。 形状。主要有微量反应
第八章 酶免疫技术
教学目的要求： 1.掌握酶和酶作用的底物、酶标记的抗体或
抗原；熟练掌握固相载体。 2.熟练掌握酶免疫技术的分类 3.熟练掌握酶联免疫吸附试验的方法类型及
原理 4.掌握酶免疫测定的应用
三大三经大典经标记典技标术记技术
荧
放
酶
光
射
免
免
免
疫
疫
疫
技
技
技
术
术
术
第一节 酶免疫技术的特点
基本原理
第三节 酶联免疫吸附试验（ELISA）
一、基本原理
1 包被
将已知抗原或抗
体吸附在固相载 体表面
常用的纯化方法有葡聚糖凝胶层析法和饱和 硫酸铵沉淀法等。
2.酶标记物的鉴定
（1）免疫活性鉴定：常用免疫电泳或双向免疫扩 散法，出现沉淀线表示结合物中的抗体(抗原)具有 免疫活性。
（2）酶标记率测定：用分光光度法分别测定结合 物中酶和抗体(抗原)蛋白的含量，然后按公式计算 其标记率。
三、固相载体
固相抗体或抗原:就是把抗体或抗原结 合到固相载体的表面
一、均相酶免疫测定法
基本原理 酶标记物与相应的抗原或抗体结合 后，其中的酶活性将发生改变。
Ag+ Ab-E AgAb-E+ Ab-E （以标记Ab检测Ag为例）
因此，不需对反应液中结合和游离的酶标记 物进行分离，直接测定反应系统中总酶活性的变 化即可推算出被测样品中抗原的含量。
二、异相液相酶免疫测定法
基本原理：抗原抗体反应平衡后，需采用适当的 方法分离游离的和结合的酶标记物，然后对经酶 催化的底物显色程度进行测定，再推算待测样品 中抗原（或抗体）的含量。依据测定方法又可分 为液相和固相酶免疫测定。目前临床上多用固相 酶免疫测定法。
Ag+ Ab-E AgAb-E+ Ab-E （以标记Ab检测Ag为例）
纯度数（RZ）值与 酶活性无关，酶活 性单位（U）比RZ值 更为重要
辣根过氧化物酶（HRP）
RZ值：403nm （辅基） 与275nm（主酶）OD值之 比
酶的纯度并不代表 酶的活力
HRP催化的反应式为：
HRP DH2+H2O2→ → → D+2H2O
H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高 供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种
标记反应不影响酶和抗原或抗体 的活性
酶标记物稳定 ，不易发生解离
制备方法
1.戊二醛交联法
适合各种酶蛋白的标记。
2.过碘酸钠氧化法
常用于HRP标记抗体或抗原
（二）酶标记物的纯化与鉴定
1．酶标记物的纯化 标记完成后应除去反应溶液中的游离酶、游
离抗体(抗原)、酶聚合物及抗体(抗原)聚合物， 避免游离酶增加非特异显色以及游离抗体(抗原) 的竞争作用。
抗原（抗体）→用PH9.6的碳酸盐溶 液稀释 → 4ºC过夜 → 用10%的小 牛血清再包被一次，以消除固相载体表 面未吸附的位点，此过程叫做封闭。
第二节 酶免疫技术的分类
酶免疫组织化学技术 组织切片或其它标本中抗原的定位分 析
酶免疫分析技术
均相酶免疫测定
酶放大免疫测定技术
酶免疫测定技术
液体标本中抗原或 抗体的定性和定量
板、小试管和小珠三种。
微量反应板
2．微颗粒 微颗粒是由 高分子单体聚合成的微
球或颗粒。
3.微孔虑膜 是一种多孔薄膜过滤材料，包括硝酸纤 维素膜（NC）、尼龙膜和玻璃纤维素膜等。
（三）包被与封闭
将抗原或抗体固相化结合在固相载体 上的过程称为包被（coating)。
以聚笨乙烯固相载体（如制ELISA板）为 例说明免疫吸附的过程：