细胞实验12 绒毛细胞培养与染色体制备

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12染色体标本的制备

实验十二染色体标本的制备一、实验目的1.了解利用动物骨髓进行细胞染色体制片的一般方法，2.掌握细胞收集、低渗、滴片等技术手段。

3.观察和了解小鼠染色体的数目及形态特征。

二、实验原理染色体上的基因决定了一个物种生长发育的全部信息。

因此通过染色体分析，可以了解某一物种最基本的遗传指标。

进行染色体标本的制备一般取自细胞分裂旺盛的组织，如骨髓、淋巴细胞以及通过人工培养的悬浮液。

将秋水仙素注射到动物的腹腔内，经肠系膜吸收可转运到骨髓，使正在分裂的细胞不能形成纺锤体，染色体停在中期状态，经过处理和制片后就可以清楚地观察到染色体。

这种制片方法是属于侵害性的，因此这种方法适用于动物来源丰富、动物个体较小的材料。

对于大型动物可以采取骨髓穿刺术获得红骨髓，在临床上用于一些血液疾病的研究分析。

对于一些珍稀的鸟类可采用羽髓来制片，方法基本一样。

人类的染色体分析可采用外周血培养的方法来获得大量的细胞材料。

骨髓细胞具有丰富的细胞质和高度分裂能力，因此不必经体外培养，也不需要植物血球凝集素（PHA）的刺激，可直接观察到分裂细胞。

经秋水仙素处理后，分裂的骨髓细胞被阻断在有丝分裂中期，再经离心、低渗、固定、滴片等步骤，便可制作出理想的染色体标本，是研究动物细胞遗传学的好材料。

骨髓细胞染色体标本的制备，具有取材容易，方法简单易行等优点，设备也简单，在一般的实验室均可进行。

三、实验仪器、材料和试剂：1.仪器、用具天平，离心机，光学显微镜，恒温水浴锅，试管架，烧杯，离心管，刀片，镊子，解剖盘，解剖剪，镊子，注射器，纱布，冰冻载玻片，吸水纸，吸管，镜头纸。

2.材料体重20克左右的小鼠。

3.试剂(1)0.075mol/L KCl低渗液(2)Carnoy固定液（甲醇：醋酸＝3:1）(3)0.1%秋水仙素(4)Giemsa染色液【方法与步骤】1. 秋水仙素处理：在做实验前3~4小时，按每克体重2-4μg的量，向小鼠腹腔注射0.1％的秋水仙素。

良好小鼠染色体标本的关键步骤

良好小鼠染色体标本的关键步骤染色体标本制备是进行细胞遗传学与基因组学研究的重要步骤之一，尤其在小鼠模型中。

良好的染色体标本可以为后续的染色体分析提供准确可靠的数据基础，因此染色体标本的制备过程至关重要。

本文将介绍良好小鼠染色体标本制备的关键步骤。

1. 细胞培养与预处理在开始染色体标本制备之前，首先需要对小鼠细胞进行培养和预处理。

细胞应该在无菌条件下培养，以确保细胞的健康状态和纯度。

同时，在细胞培养的过程中，应加入适量的细胞分裂抑制剂，如科林霉素或染色体解旋酶抑制剂，以防止染色体的损伤和断裂。

2. 细胞采集与固定经过适当的培养和预处理后，可以开始进行细胞采集与固定的步骤。

通常采用离心沉淀法或原位固定法进行细胞的采集。

离心沉淀法适用于大规模采集细胞，而原位固定法适用于对特定细胞进行选择性标本制备。

无论采用哪种方法，细胞在采集后应立即进行固定以避免细胞结构的变形和损伤。

3. 细胞裂解与染色体释放细胞固定后，接下来需要进行细胞的裂解与染色体释放。

常用的裂解方法有加入低渗透压缓冲液或高渗透压缓冲液，使细胞膜破裂释放染色体。

此外，还可以通过超声波处理或机械剪切等方法促进细胞的裂解和染色体的释放。

裂解后的细胞溶液应进行离心，以分离出染色体。

4. 染色体的固定与染色离心后的染色体需要进行固定与染色，以保持其形态结构和增强对染色体的观察。

常用的固定方法包括加入甲醛或醋酸乙酯等，固定时间需根据实验需求进行调整。

染色体的染色可以通过Giemsa染色、DAPI染色等方法进行。

染色后的染色体应进行洗涤以去除多余染料。

5. 染色体的显微观察与分析经过固定和染色的染色体标本可以进行显微观察与分析。

通常使用光学显微镜或荧光显微镜进行观察，并可以利用图像分析系统对染色体进行计数、测量和分析。

在观察和分析过程中，应注意保持显微镜和标本的清洁，以避免杂质的干扰和误判。

良好小鼠染色体标本的制备是一个复杂的过程，需要经过细胞培养与预处理、细胞采集与固定、细胞裂解与染色体释放、染色体的固定与染色以及染色体的显微观察与分析等关键步骤。

人类染色体标本的制备及G显带核型分析

9. 弃上清，重复固定1次。 10.弃上清，根据沉淀量多少加入适量滴数新鲜固定
液，轻轻混匀，制成磨砂状悬液。 11.制片：取上述悬液1～2滴，滴至沾有冰水或干燥的
洁净载玻片上，吹散，过火，空气干燥。 12.37℃温箱放置3～4天或70℃烘烤2 h进行老化处
理，以备显带分析用。
【(二实)人验类染方色法体和的G步显带骤】
染色体的带纹是染色体标本经过特殊处理后，每条染色体上沿纵轴显示出的一定数量、着色程度不同、宽窄不等的横纹。染色体带是染色体固有的、稳定的特征。染色体G显带是多种显带技术中的一种，是将染色体标本经胰蛋白酶处理后再用吉姆萨（Giemsa）染液染色。G显带技术因其方法简便，重复性好，带纹清晰且可长期保存而应用最为广泛。
2. 超净工作台内将抗凝血加入RPMI-1640培养液中，
每瓶加0.3～0.5 ml全血。轻轻混匀。 3. 37℃恒温培养箱静置培养72 h左右（培养24 h后水平轻摇培养瓶一次，以悬浮混匀血细胞）。 4. 培养至68～72 h（即终止培养前2～4 h），每瓶加秋水仙素(20 μg/ml)至终浓度0.1～0.2 μg/ml，轻摇培养瓶混匀，继续培养2～4 h。 5. 终止培养，将培养物吹打混匀后转移到10 ml玻璃离心管，配平，1800 rpm 离心6 min。
2. G显带过程中的关键因素包括胰蛋白酶的作用时间、温度、pH等。其中胰蛋白酶溶液应37℃充分预热，溶液pH应维持在6.8～7.2，以保证酶活性的发挥。另外消化要适度，消化不足则带纹不清晰或不显示，消化过度则带纹模糊甚至损失。
[作业与思考题]
1.简述人类染色体制备的操作过程和基本原理。 2.总结人类染色体制备过程中的关键步骤及注意
植物血凝素（PHA）、秋水仙素(20μg/ml)、 0.075 mol/L氯化钾低渗液、0.85%生理盐水、固定液（甲醇:冰醋酸=3:1，现配现用）、 Giemsa原液、0.25%胰蛋白酶溶液、磷酸盐缓冲液。

关于21三体综合症的综述

关于21三体综合征的综述性论文三体综合征又称唐氏综21合征或者先天愚型或Down综合征，是活产胎儿中最常见的21三体综合征是人类最罕见的一种染色体病。

据报道，新生儿中21三体综合征的发病率为1/800，母亲年龄愈大，本病的发病率愈高，60％患儿在胎儿早期即夭折流产。

按染色体核型分析可将21-三体综合征患儿分为3型：21三体型/标准型（95%），易位（2.5%-5%）和嵌合型（2%-4%），21三体综合征患者的主要临床表现为：1.明显的智力障碍，智力低下，智商在20-25之间，生长发育迟缓，出生时身长.体重低于正常儿，骨龄常落后于年龄，出牙延迟且常错位。

2.特殊面容，且常呈现嗜题和喂养困难，小头，耳位低，眼距宽，外眼角上斜，鼻梁低平，口常张开，舌大且常伸出口外，又称''伸舌样痴呆''。

3.多发畸形，四肢短，由于韧带松弛，关节可过度弯曲，手指粗短，小指向内弯曲。

4.随着年龄增长，其智能低下表现逐渐明显，动作发育和性发育部延迟。

5.因免疫功能低下，易患各种感染，白血病的发生率也增高10～30倍。

如存活至成人期，则常在30岁以后出现老年性痴呆症状。

约5%为先天性心脏病，也有胃肠道畸形，趾距宽，通惯掌频率高。

6.皮肤纹理特征通贯手，atd角增大；第4、5指桡箕增多；脚趾球胫侧弓形纹，第5趾只有一条指横纹。

一、21三体综合征的发病机理：21号染色体多了一条，即21三体。

最新研究发现母亲年龄与减数分裂中2l号染色体改变的重组类型相关。

母亲年龄是影响发病率的重要原因。

根据国外资料，如果一般人群出生时的母亲年龄平均为28.2岁，则唐氏患儿的母亲年龄平均为34.4岁。

随年龄的增长，分娩出患儿的风险逐渐增高。

临床上生育期的高龄妇女指年龄在35岁以上的妇女，其生育的子女中痴呆儿和畸形儿的发生率明显增高。

因为产妇年龄过大，卵细胞可能会发生变化，同时人体（包括卵巢）受各种有害物质和射线的影响也越来越大。

流产绒毛细胞培养及染色体核型分析155例

参考文献
1 乐杰，主编．妇产科学［M］．北京：人民卫生出版社，2008．
2 向阳，王凤云，郝娜，等．早孕绒毛细胞直接植被染色体方法的改进［J］．中国实用妇科与产科杂志，1998，14（ 5）： 273．
3 冯丽云，杨晶，等．自然流产患者绒毛组织的细胞遗传学分析［J］．中国优生与遗传杂志，2002，10（ 6）： 53．
4 易翠兴，潘敏．广州地区 97 例自然流产绒毛细胞培养及核型分析［J］．中国优生与遗传杂志，2007，15（ 9）： 41 － 42．
5 Qumsiyeh MB，Kim KR，et al． Cytogenetics and mechanisms of spontaneous abortions： increased apoptosis and decreased cell proliferation in chromosomally abnormal villi［J］． Cytogenet Cell Genet，2000，88 （ 3 － 4 ）： 230 － 235．
样过程污染及胚胎死亡时间长等有关。因此无菌方式选择适当孕周及非死亡时间过长的胚胎进行绒毛细胞染色体核型分析有助于提高培养成功率。
采用酶消化绒毛法结合干贴壁法，可以弥补后者染色体分裂相形态不佳、不利于正确分析的缺点，提高了产前诊断质量。根据流产绒毛的核型结合孕妇的自然情况作出风险评估，以期为其下次妊娠进行指导［7］。
巧克力囊肿的 MRI 诊断：认为巧克力囊肿 MR 表现具有如下特征： ①病灶可单发或多发，呈囊状生长［3］。卵巢巧克力囊肿的多房及分隔常见，且呈大囊外多个囊肿聚集即“卫星囊”为卵巢巧克力囊肿的特征性表现之一［4，5］。② MRI 信号表现多种多样，主要由于脉冲序列和病灶内成分的不同，如急性、亚急性、慢性血肿、反复出血可至血肿内成分复杂、铁含量不同以及纤维组织增生等因素造成。主要表现为均匀信号的短 T1 长 T2 类圆

早期自然流产胎儿绒毛细胞培养及染色体核型分析

早期自然流产胎儿绒毛细胞培养及染色体核型分析梁彩红禤洁甜汤丽霞杨光（广东省佛山市第一人民医院临床医学研究所，佛山市528000）【摘要】目的探讨早期自然流的原因及流产胎儿绒毛染色体核型检查的意义。

方法应用长期培养法对60例早期自然流产的胎儿绒毛组织进行绒毛细胞培养，并对培养成功的绒毛细胞制备染色体及核型分析。

结果60例自然流产的绒毛组织中绒毛细胞培养成功56例（93．3%），56例中检出异常核型32例（57．1%），其中常染色体三体16例、多倍体6例、嵌合体6例、性染色体单体2例、结构异常2例；正常核型24例（42．9%），其中男性核型5例、女性核型19例。

结论胚胎染色体异常是早期自然流产的主要原因，早期流产胎儿绒毛染色体检查有利于查明流产的原因，合理指导下次妊娠。

【关键词】流产；绒毛细胞；染色体；核型分析【中图分类号】R714．21【文献标识码】A【文章编号】0253-4304（2011）06-0691-03Chorionic Villus Cell Culture and Analysis on Chromosomal Karyotype in Early Spontaneous AbortionLIANG Cai-hong，XUAN Jie-tian，TANG Li-xia，YANG Guang（Institute of Clinical Medicine，the First People＇s Hospital of Foshan City，Guang dong，Foshan528000，China）【Abstract】Objective To study the cause of early spontaneous abortion and the value of chromosomal karyotype analysis of the chorionic villus samples．Methods The chorionic villus specimens that were obtained through60cases of early spontaneous abortion were cultured for karyotype analysis．Results Of the60cases，chorionic villus was successfully cultured in56cases（93．3%），and abnormal embryo karyotypes were identified in32cases（57．1%）．16cases were antosomal triploid，6case were multiplod，6cases were mosaic，2cases were sexual chromosome abnormalitie，and2 cases were structural aberrations；normal karyotypes were identified in24cases（42．9%），5cases were males and19 cases were females．Conclusion Embryo chromosomal abnormality is a major cause of early spontaneous abortion，and karyotype analysis of the villus helps identify the causes of abortion and ensure the success of the next pregnancy．【Key words】Abortion；Chorionic villus；Chromosome；Karyotype analysis自然流产是临床妊娠最常见的并发症之一，且流产绝大部分是发生在怀孕早期（孕15周以内）［1－2］。

外周血淋巴细胞培养和染色体标本制备

乙液：一水磷酸二氢钠,1/15M溶液含9.2g/L 甲液：二水磷酸氢二钠,1/15M溶液含 11.864g/L 根据要求的PH值,取X毫升甲液与Y毫升乙液, 混合均匀即得.
实验步骤
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1培养液的分装:在无菌室或接种罩内,用移液管将培养液和其它各试剂剂分装入玻瓶,每瓶量为 :
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完全培养基3ml
PHA 20ul
外周血淋巴细胞培养和染色体标本制备,染色体组型分析
实验目的
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1、了解动物细胞培养的方法。掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备。 2、熟悉人类染色体的镜下检查和核型分析方法。
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实验原理
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人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板，其中红细胞和血小板不能离体培养。每1ml 外周血中一般含有约1～3×106 个小淋巴细胞，几乎都处于G1期或G0期的非增殖状态，一般情况下是不再分裂的。但当在培养液中加入植物凝血素（PHA）后，淋巴细胞受刺激便转化为淋巴母细胞，重新进入增殖周期，进行有丝分裂。经过66～72小时(三个周期)的短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂相细胞，从而进行染色体标本制备和核型分析。
•
9制片:留固定液 0.5毫升, 用滴管小心冲打成悬液。从冰箱的冰格中或冰水中取出载玻片,每片滴加悬液 1~3滴,吹散,在酒精灯火焰上过火。室温过夜。
11染色:用磷酸缓冲液（PH7.4）稀释后的姬姆萨染色液染色 20分钟,然后倒去染液,用蒸馏水轻轻冲洗 . 12镜检:待稍干后,在显微镜下观察,先用低倍镜寻找良好的分裂相,然后再用高倍油镜观察。
人染色体组型及其特征
实验材料
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1.1试验材料:人外周血淋巴细胞 1.2试验用具:离心管、吸管，量筒、载玻片，常规清洗烘干，培养瓶、、1ml/5ml移液枪,灭菌处理，天平、离心机、恒温培养箱、显微镜、普通冰箱，酒精灯。 1.3试剂药品完全培养基凝血素(PHA ) 5mg/ml

哺乳动物染色体制片与观察实验报告

哺乳动物染色体制片与观察实验报告实验目的本实验旨在通过制作哺乳动物染色体制片，观察和探索哺乳动物染色体的结构和特点。

实验材料- 哺乳动物染色体样本（例如人类、小鼠等）- 表皮组织刮片- 表皮细胞培养基- 血红素盐酸盐溶液- 醋酸（5％）- 钠苏尔法米红（0.1％）实验步骤1. 采集表皮组织刮片：使用无菌的刮片工具从待观察的部位取得表皮细胞样本，并将其转移到表皮细胞培养基中。

2. 表皮细胞培养：将表皮细胞样本转移到培养皿中，加入适量的表皮细胞培养基，放入恒温培养箱中，保持适当的温度（通常为37摄氏度）和湿度，培养一段时间，直至细胞增殖到一定数量。

3. 细胞收集：当细胞增殖到一定程度时，将培养皿中的细胞用生理盐水冲洗，以去除培养基中的残留物。

4. 染色体制片制备：将经过冲洗的细胞用生理盐水悬浮，滴于一块干净的玻璃片上，使细胞均匀分布。

然后从玻璃片的一端倾斜，使细胞均匀地涂布在玻璃片上。

待玻璃片干燥后，放入醋酸（5％）中固定细胞。

5. 细胞处理：将醋酸固定的玻璃片放入血红素盐酸盐溶液中，静置一段时间，左右观察细胞的形态。

6. 染色：将经过血红素盐酸盐处理的玻璃片转移到钠苏尔法米红溶液中，静置一段时间，使细胞染色。

7. 清洗与封片：将玻璃片转移到蒸馏水中，轻轻冲洗几次，然后用纸巾吸干水分。

在制片机上加热一段时间，待玻璃片完全干燥后，将其与载片胶片粘合在一起，制成染色体制片。

实验结果与讨论通过观察染色体制片，我们可以明显地看到哺乳动物细胞中染色体的形态和数量。

在制片过程中，醋酸的固定作用有助于细胞形态的保持，血红素盐酸盐和苏尔法米红的处理使染色体变得更加可见和易于观察。

实验结果显示，哺乳动物染色体一般为线状结构，且数量多为偶数。

根据染色体的形状、大小和着色情况，我们可以初步判断其所属的染色体类型（如性染色体、常染色体等），进一步研究染色体的特点。

这个实验不仅可以帮助我们了解哺乳动物染色体的基本结构和形态，还可以在遗传学和进化生物学研究方面提供重要的数据和信息。

生物技术遗传学实验指导

目录验一人体外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备实验二小鼠骨髓细胞染色体标本的制备实验三人类染色体G显带技术实验四人类染色体C显带技术实验五核仁形成区银染技术实验六人类染色体G显带核型分析实验七X染色质标本的制备实验八姐妹染色单体交换实验九微核检测技术实验十ABO血型的测定及其基因频率的计算实验十一苯硫脲尝味试验及其基因频率的计算实验十二人类皮纹分析实验十三遗传咨询实验十四人类基因组DNA的提取实验十五聚合酶链式反应（PCR）实验十六DNA的琼脂糖凝胶电泳实验十七PCR-RFLP技术《遗传学》实验须知一、医学遗传学实验目的和要求医学遗传学实验课是医学遗传学课程的重要内容。

实验课有助于加深和巩固基础理论知识，并进一步了解和掌握本学科的基本实验内容和操作技能。

在培养学生分析问题、综合问题和解决问题能力方面具有重要作用。

为此，要求学生做到以下几点：1、实验课前做好预习，明确实验目的、实验原理。

2、复习有关理论内容。

3、熟悉实验的主要步骤。

4、初步估计和判定实验的可能结果。

二、实验操作过程中的注意事项1、认真操作，仔细观察和综合分析实验所出现的现象与结果并及时记录。

2、如果实验结果与理论结果不一致，须及时进行科学分析，判断结果的可靠性，寻找出现误差的原因。

3、各种实验试剂用后放回原处，瓶盖封严，轻拿轻放。

4、使用微量加样器时，一定调整好取用量，按使用要求操作。

5、实验室应保持肃静，注意清洁卫生，实验中用过的废弃物品要及时清理，避免堵塞下水管道。

三、实验后的注意事项1、实验后，整理清洁所用仪器、设备，注意放回原位，以备下次使用。

2、如有仪器损坏，要及时填写破损报告，并报告老师。

3、离开实验室前，检查并关闭门、窗、水、电。

四、实验室的意外处理实验室如遇着火、烫伤等意外事件发生，必须镇静做紧急处理，并立即报告老师。

1、着火：如遇酒精灯推倒或其它原因着火，首先将一切易燃品移至远处，然后用水扑灭或者切断电源。

2、火伤：皮肤被火灼伤，用烫伤软膏涂抹，如伤势较重，立即送医院治疗。

染色体检查操作方法

染色体检查操作方法
染色体检查是一种用于检测个体的基因组结构和功能的实验方法，可用于检测染色体异常与遗传疾病。

以下是一般染色体检查的操作方法：
1. 选取样本：通常使用外周血或羊水细胞作为样本，样本采集时需要注意严格的无菌操作。

2. 细胞培养：将样本中的细胞分离出来，在一定的培养基中进行培养，使其足够增殖以供检查需要。

3. 处理细胞：将培养好的细胞进行处理，通常使用一种化学药物（如染色剂）来制备染色体悬液，使染色体充分展开。

4. 杂交：将染色体悬液滴在载玻片上，并加入探针，这些探针是特异性结合到染色体上的DNA片段。

通常会有不同颜色或荧光的荧光探针用于特定染色体区域的检测。

5. 染色：将荧光探针与染色体结合的悬液进行染色，以便测量和观察。

6. 显微镜观察：将已染色的载玻片放入显微镜下进行观察。

通过显微镜可以观察到染色体的形状、数量和结构。

7. 影像分析：进行染色体图像的分析和记录，通过计算机软件对染色体图像进行分析，以便准确识别和测量染色体异常。

总结起来，染色体检查的步骤主要包括样本采集、细胞培养、处理细胞、杂交、染色、显微镜观察和影像分析等。

不同的染色体检查方法可能会有些许不同。

绒毛细胞培养染色体分析及50例核型报道

１．病例来源
所有５０例病例均来自于皖南
医学院附属弋矶山医院妇产科门诊自然流产孕妇，在行清官术时留取标本，其中第１次自然流产
者３１例，第２次自然流产者１９例，年龄２１～３２岁之间，Ｂ超确认孕周为８～１１周之间。
文章编号：１６７３－８６４０（２０１３）０８－０７３１０－２
中图分类号：１１４４６．１１
文献标志码：Ｂ
ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３４６４０．２０１３．０８．０２１
前干预。介入性产前诊断的方法主要有绒毛、羊
技术有限公司。３．仪器ＣＯ培养箱由Ｔｈｅｒｍｏ公司生产；
超净工作台由苏州安泰空气技术有限公司生产；
ＫＸ－２１倒置显微镜、ＢＸ－５１正置显微镜均为
［３］卢兴国，沈汉超，曹越兰．系统性红斑狼疮肾损害患
著低于局限性硬皮病；肿胀期、浸润期和萎缩期患者血浆ｓＴＭ水平依次递降。我们认为硬皮病低血浆ｓＴＭ水平是一个很好的临床案例，其与血管萎缩、内皮细胞不能产生ｓＴＭ有关。参考文献
一
４．方法（１）标本留取：在孕８—１１周流产孕妇负压吸宫时，无菌操作吸取绒毛组织放入无菌培养皿，加入无菌生理盐水约５ｍＬ，清洗数遍

一种用于染色体观察的改良绒毛细胞直接制备法

痪瘤特性的鉴定，尤其适丁根癌农杆菌Ｔ－因此，改进的植物冠瘦碱合成酶活性检测ＤＮＡ离体转化细胞和转化离体无性系的鉴定，方法是一种简便有效的方法。
因为离体转化物可直接转人到预培养基上进行保温培养。参考文献
此外，由于冠廖碱样品提取液中有些化合物能千扰冠瘦碱的检测，所以将Ｏｔｔｎ等使用ｅ的电泳液比例（甲酸：乙酸：水二５１：０作了：５８）修改。修改的电泳液能更好地在电泳图谱上将冠瘦碱与其他荧光化合物分开［１１３０
｛ＭｕａｉｅＴａｄｓｏｇ１６．ｓｌＰａｔ；ｒｓｇ，ｎＦｋｏ，２Ｐｙｉ．ｎ．｛ｈ．．９ｈｏｌ
１４３４７５：７－９．
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ＮｓｒＥＷ．ａ：８．ｎＲｖＰａｔｙｅｅ，ｔ．ｅｌ１４Ａ．．ｎＰｓｔ９．ｎｅｌｈ－ｉｌ３：８－４３ｏ．５３７１．，－Ｏｔ，ＡＢＭ．ｄＡ．ｉｅｏｒ１７．ｔｎＬ．ｅ．．ａＲｎ．Ｓｈｐｒｏｔ９８ｃｌ．ＢｏｈｍＢｏｈｓＡｔ，：－５０ｉｅ．ｐｙ．ａ５７４７０．ｃｉｃ２９
ｐ．５＊ｐ．０，＜００；＊＜００１
加入１１０乙酸水溶液，ｍ６并处理２分钟，即追加纯甲醇２ｌ（）ｍ；吸取细胞悬液于离心管内离心５（５０８０ｐ；冰水滴片，１０－１０ｒｍ）（）６风干，Ｇｅｓｉａｍ染色。另一份按改良的胶原酶法制备染色体，大致如下：１弃培养液加人１ｎ／ｌ（）５ｇｍ胶原酶４ｌｍ，孵育１－２分钟（７；加人４１生理盐５０３０（）Ｃ）２ｍ

动物外周血淋巴细胞的培养与染色体标本的制备实验目的：实验原理：

材料器具：
人全血0.2-0.8毫升；接种箱（内装紫外灯管），恒温箱，高压手提式
灭菌锅，离心机，移液管，链霉素空瓶（代培养瓶），三角烧瓶，针筒抽滤器，0.45微米孔径的滤膜，量筒，离心管，采血针，针筒，剪刀，镊子，消毒棉球，精密pH试纸，载玻片； RPMI1640，小牛血清，肝素，PHA，青霉素，链霉素，5%碳酸氢钠溶液，2微克/毫升秋水仙素， 0.075摩尔/升氯化钾溶液，甲醇，乙酸，吉姆萨（Giemsa）染液。
2.药品（1）RPMI“1640”培养基：称取“1640”粉末10.5 克，用1000 毫升的双蒸
水溶解，如溶液出现混浊或难以溶解时，可用干冰或CO2 气体处理，如 pH 值降至6.0 时，则可溶解而透明。每1000 毫升溶液加NaHCO31.0— 1.2 克，以干冰或CO2 气体校正pH 至7.0—7.2。立即以5 号或6 号细菌漏斗过滤灭菌，分装待用。（2）肝素：作为抗凝剂使用。称取该粉末160 毫克（每毫克含126 单位），用40 毫升的生理盐水溶解，此溶液的浓度为每毫升500 单位。高压消毒8磅15 分钟。（3）秋水仙素：作为有丝分裂的阻止剂，它能改变细胞质的粘度，抑制细胞分裂时纺锤体形成，使细胞分裂停留在中期。称取秋水仙素4 毫克，用100 毫升生理盐水溶解，用6 号细菌漏斗过滤，然后放入冰箱 4℃保存。使用时用1 毫升注射器吸取该溶液0.05—0.1 毫升加入5 毫升的培养物中，其最终浓度为0.4—0.8 微克/毫升。
用3.5％NaHCO3 调pH 到7.2—7.4，分装到20 毫升的玻瓶中，用橡皮塞塞紧，待用或置于0℃条件下保藏。用前从冰箱内取出，放入37℃恒温锅中温育10 分钟。
2.采血：用2 毫升灭菌注射器吸取肝素（500 单位/毫升）0.05 毫升湿润管壁。用碘酒和酒精消毒皮肤，自肘静脉采血约0.3 毫升，在酒精灯火焰旁，自橡皮塞向培养瓶内（内含有生长培养基5 毫升）接种，轻轻摇动几次，直立37℃±0.5℃恒温箱内培养。

细胞培养2_骨髓细胞染色体标本的制备

骨髓细胞染色体标本的制备一、原理骨髓染色体标本制备通常用于白血病患者，特别是慢性或急性粒细胞性白血病，因为骨髓反映粒系统细胞增生情况，这些病人不宜用外周血。

即使是淋巴细胞性白血病，也不主张用外周血，因为加PHA刺激外周血培养，只能获得正常淋巴细胞分裂相，并不能反映那些病理淋巴细胞的染色体改变。

骨髓细胞属不断增殖的细胞，培养可分短期培养和直接制片法，无论哪种其培养液中均不需加PHA。

二、用品和试剂同外周血染色体制备。

三、操作步骤（一）短期培养法1．取材、培养：从髂骨取骨髓液0.2—0.5ml，无菌注入装有5ml培养液的培养瓶中，37℃培养23—25小时后，加入秋水仙碱（终浓度为0.07μg/ml），继续培养3—4小时，收获。

2．染色体制片：低渗、固定、制片及染色同实验一。

（二）直接制备法1．从髂骨抽取0.3—0.5ml，立即注入浓度为0.07μg/ml的秋水仙碱的生理盐水5ml中，以吸管轻轻吸动，将骨髓中脂肪颗粒充分吸掉，1000rpm离心8分钟，弃上清。

2．加入同样浓度的秋水仙碱生理盐水2—3ml，室温放置2—3小时，离心弃上清。

3．染色体制片：低渗、固定、制片及染色同外周血染色体制备。

DNA分子的限制性内切酶消化限制性内切酶可特异地结合于一段被称为限制酶识别序列的DNA序列位点上并在此切割双链DNA。

绝大多数限制性内切酶识别长度为4、5或6个核苷酸且呈二重对称的特异序列，切割位点相对于二重对称轴的位置因酶而异。

一些酶恰在对称轴处同时切割DNA双链而产生带平端的DNA片段，另一些酶则在对称轴两侧相对的位置上分别切断两条链，产生带有单链突出端（即粘端）的DNA 片段。

1个单位限制性内切酶是指在最适条件下，在50μl体积1小时内完全切开1μgλ噬菌体DNA所需的酶量。

不同的限制性内切酶生产厂家往往推荐使用截然不同的反应条件，甚至对同一种酶也如此。

但是，几乎所有的生产厂家都对其生产的酶制剂优化过反应条件，因此购买的内切酶说明书上均有其识别序列和切割位点，同时提供有酶切缓冲液（buffer，10×、5×）和最适条件，使得酶切反应变得日益简单。