实验 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
实验8考马斯亮蓝法测蛋白质的含量
对实验条件进行优化，如调整PH值、反应时间、温度等，以提高实验
结果的稳定性。
03
应用拓展
进一步研究考马斯亮蓝法在特殊蛋白质或不同来源蛋白质测定中的应用，
拓展其应用范围。同时，可以探索与其他蛋白质测定方法的比较研究，
为蛋白质定量分析提供更多选择。
THANKS
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标准曲线的绘制
加样
将标准蛋白溶液分 别加入相应的试管 中。
测定光密度值
在特定波长下测定 各试管的光密度值， 记录数据。
准备标准蛋白溶液
制备一系列不同浓 度的标准蛋白溶液。
显色反应
向每个试管中加入 适量的考马斯亮蓝 溶液，混合均匀。
绘制标准曲线
根据测得的光密度 值与标准蛋白浓度 绘制标准曲线。
加样
样品稀释
根据实验需求，将蛋白质 样品进行适当稀释，以便 后续测量。
样品标记
对每个样品进行标记，以 便后续结果分析时能够准 确对应。
考马斯亮蓝溶液的配制
准备试剂
储存与使用
按照实验要求准备考马斯亮蓝溶液所 需的试剂。
将配制好的考马斯亮蓝溶液储存于棕 色瓶中，避免光照，使用前摇匀。
配制溶液
将各试剂按比例混合，制备出考马斯 亮蓝溶液。
影响因素
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量时，PH值、反应时间、温度等因素 可能影响实验结果。
适用范围
考马斯亮蓝法适用于大多数蛋白质的定量测定，但对于某些特殊蛋 白质或不同来源的蛋白质可能存在一定误差。
对实验的改进建议与展望
01
标准化操作
为提高实验准确性，建议对实验操作进行标准化，减少人为误差。
02
优化条件
考马斯亮蓝与蛋白质结合的机制
实验七-考马斯亮蓝G250法测定的蛋白质含量
实验七-考马斯亮蓝G250法测定的蛋白质含量实验目的本实验的目的是通过考马斯亮蓝G250法测定蛋白质的含量，并了解该方法的基本原理。
实验原理蛋白质含量的测定方法有很多，其中比较常用的是考马斯亮蓝G250法。
该方法的基本原理是：靶蛋白质与染料考马斯亮蓝G250反应生成蓝色沉淀，通过比色法测定沉淀的吸光度，即可计算出蛋白质的含量。
具体来说，该方法的操作步骤如下：1.将待测蛋白质样品制备成一定的浓度，并加入一定体积的考马斯亮蓝G250试剂。
2.在一定时间内使反应到达平衡，将反应液离心沉淀。
3.由于考马斯亮蓝G250和蛋白质的结合比较强，一般可以近似认为反应液中大多数考马斯亮蓝G250都与蛋白质结合在一起。
因此，剩余的考马斯亮蓝G250浓度可以通过测定上清液的吸光度得到。
4.根据标准曲线（一般为已知浓度的蛋白质样品的吸光度与浓度的对应关系），可以将上清液的吸光度转化为蛋白质的含量。
实验步骤实验前准备准备工具和试剂，包括：•96孔微孔板•分光光度计•移液器、吸头•加样器•蒸馏水•NaOH溶液（1mol/L）•BSA标准品（2mg/mL）实验操作1.准备5个稀释比例的BSA标准品，分别为0.1、0.2、0.5、1.0和2.0mg/mL。
2.将标准品和待测样品分别加入96孔板中，每个样品重复3次。
3.加入一定体积（如200μL）的考马斯亮蓝G250试剂，混匀。
4.在室温下暗置约5min，使反应充分发生。
5.离心沉淀至液面完全透明。
6.将上清液吸取到另一个96孔板中。
7.加入100μL NaOH溶液，混匀。
8.制备一条标准曲线，测量各标准品和待测样品的吸光度。
数据处理根据标准曲线计算待测样品中蛋白质的含量。
实验注意事项•操作时要注意洁净卫生，避免交叉污染。
•要精确控制试剂的使用量，避免误差。
•每项操作要根据标准程序认真进行，做到数据准确可靠。
实验结果分析通过考马斯亮蓝G250法测定了不同浓度的BSA标准品和待测样品中的蛋白质含量，得到了标准曲线和待测样品的吸光度值。
实验1考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量
蛋白质含量的测定
微量凯氏定氮法 Folin-酚试剂法（Lowry法） 双缩脲法（Biuret法） 紫外光吸收法 考马斯亮蓝法（Bradford法）
▪ 实验类型——基础验证型
实验目的
掌握和学习考马斯亮蓝G-250染色法 测定蛋白质含量的基本方法。
五 思考题
测定蛋白质含量还有哪些方法， 测定原理有哪些不同？
移液枪的使用方法
量程的调节 枪头（吸液嘴）的装配 移液的方法 移液器的正确放置 维护保养时的注意事项
吊钩 手柄
移液控制及调节旋纽 吸/枪头推出器
数字显示器
枪杆
移液枪的结构
1.量程的调节 ！！看清量程再调节
千万不要将按钮旋出量程， 否则会卡住内部机械装置而损坏了移液枪。
➢ 吸量管上端标有“吹”字。将所量液体全部放出后，还需要吹出 残留于管尖的溶液。此类吸量管为“吹出式”，未标“吹”字的 吸量管，则不必吹出管尖的残留液体。(0.5ml以下的都要吹）
➢ 吸量管尖应接触受器内壁，但不应插入受器内的原有液体之中， 以免污染吸量管及试剂。
➢ 吸取血液、尿、组织样品、粘稠试剂或有颜色的吸量管，用后应 及时用自来水冲洗干净。如果吸取一般试剂的吸量管可不必马上 冲洗，待实验完毕后，用自来水冲洗干净，晾干备用。
/mL
0
10
蛋白质浓度
(μg/mL)
A595
3
4
5
6
7
0.2
0.4
0.6
0.8 1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
4.0
4.0
4.0
4.0 4.0
20
40
60
考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量
蛋白质含量测定(考马斯亮蓝G-250法)一、目的考马斯亮蓝(Coomassie brilliant blue) G-250法是比色法与色素法相结合的复合方法，由Bradford于1976年建立，具有简便快捷，灵敏度高，稳定性好等特点，是一种较好的蛋白质定量测定常用方法。
通过本实验学习应用该法测定蛋白质含量的原理，复习分光光度计的使用及标准曲线的绘制等基本实验技能。
二、原理考马斯亮蓝G-250是一种染料，游离态呈红色，与蛋白质结合后转变为青色。
在0~1000μg 范围内，蛋白质-色素结合物在595 nm下的吸光度与蛋白质含量正相关，可用比色法测定。
三、仪器、试剂和材料1．仪器设备：(具塞刻度)试管吸管分光光度计2．试剂(1) 标准蛋白质溶液称取100 mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100 ml，制成 1 mg/ml溶液。
(2) 考马斯亮蓝G-250蛋白试剂称取100 mg考马斯亮蓝G-250，溶于50 ml 95%乙醇中，加入85% (m/v)的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000 ml (此溶液在常温下可放置一个月)。
(3) 样品蛋白液(10~100 μg/ml)四、操作步骤1标准蛋白质含量(μg)为横坐标、吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。
2．样品中蛋白质含量的测定取2支(具塞)试管，分别准确加入0.l ml样品蛋白液，再各加5 ml考马斯亮蓝G-50试剂，充分混合，放置2min后，以标准曲线0号试管做参比，在595 nm波长下比色，记录吸光度。
五、结果处理根据所测样品提取液的平均吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量(μg/ml)六、思考题1．考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理是什么？还有哪些蛋白质定量法？2．如何正确使用分光光度计？。
考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量
考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量
一 、实验目的
学会用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白 质含量
二、 实验原理
考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区结合，这种结 合具有高度的敏感性。考马斯亮蓝G-250的磷酸溶 液呈棕红色，最大吸收峰在465nm当它与蛋白质 结合形成复合物时呈蓝色其最大吸收峰改为 595nm，考马斯亮蓝G-250-复合物的高消光效应 导致了蛋白质定量测定的高敏感度。 在一定范围内，考马斯亮蓝G-250-复合物呈色后， 在595nm下吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故 可以用于蛋白质浓度的测定。
四、实验试剂
1、0.9％NaCL溶液。
2、标准蛋白液；牛血清白蛋白（0.1mg/ml）， 准备称取牛血清白蛋白0.2g，用0.9%NaCl溶液 溶解并稀释至2000ml。 3、染液：考马斯亮蓝G250(0.01%),称取0.1g考 马斯亮蓝G250溶于50ml95%乙醇中，再加入 100ml浓磷酸，后加蒸馏水定容到1000ml,过滤。
三 、实验器材
（1）旋涡混合器。 （2）试管1.5cm×15cm（×8） （3）吸管0.10ml（×1），0.50ml（×2）， 1.0ml（×2），2.0ml（×1），2.0ml（×1）。 （4）722型（或7220型）分光光度计。 （5）容量瓶1000ml（×1）。 （6）量筒100ml（×1）。 （7）电子分析天平。
0.8 0.2 4 80
A595nm
（二）样品的测定
另取一支干净试管，加入样品液1.0ml及 考马斯亮蓝染液4.0ml，混匀，室温静置 3min，于波长595nm处比色，读取吸光 度，由样品液的考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度——标准曲线的制备
管号 试剂 标准蛋白液/ml 0.9%NaCl/ml 考马斯亮蓝染液/ml 蛋白质浓度（μg/ml） 0 1 4 0
考马斯亮蓝法测蛋白质含量
标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量一、标准曲线一般用分光光度法测物质得含量,先要制作标准曲线,然后根据标准曲线查出所测物质得含量。
因此,制作标准曲线就是生物检测分析得一项基本技术。
二、蛋白质含量测定方法1、凯氏定氮法2、双缩脲法3、Folin-酚试剂法4、紫外吸收法5、考马斯亮蓝法三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作(一)、试剂:1、考马斯亮蓝试剂:考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇,加入100ml 85% H3PO4,用蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。
最终试剂中含0、01%(W/V)考马斯亮蓝G—250,4、7%(W/V)乙醇,8、5%(W/V)H3PO4。
2、标准蛋白质溶液:纯得牛血清血蛋白,预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,根据其纯度同0、15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。
(二)、器材:1、722S型分光光度计使用及原理()。
2、移液管使用()。
(三)、标准曲线制作:1、2、以A595nm为纵坐标,标准蛋白含量为横坐标(六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug),在坐标轴上绘制标准曲线。
1)、利用标准曲线查出回归方程。
2)、用公式计算回归方程。
3)、或用origin作图,测出回归线性方程。
即A595nm=a×X( )+6一般相关系数应过0、999以上,至少2个9以上。
4)、绘图时近两使点在一条直线上,在直线上得点应该在直线两侧。
(四)、蛋白质含量得测定:样品即所测蛋白质含量样品(含量应处理在所测范围内),依照操作步骤1操作,测出样品得A595nm,然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。
一般被测样品得A595nm值在0、1—0、05之间,所以上述样品如果A595nm值太大,可以稀释后再测A595nm值,然后再计算。
(五)、注意事项:1、玻璃仪器要洗涤干净。
2、取量要准确。
3、玻璃仪器要干燥,避免温度变化。
考马斯亮蓝染色法测定蛋白质的含量
实验一 考马斯亮蓝染色法测定蛋白质的含量【实验目的】1．掌握考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量的原理和过程。
2．熟悉蛋白质含量测定的影响因素。
【实验原理】1976年Bradford 等建立了用考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合，迅速、灵敏的定量测定蛋白质的方法。
染料与蛋白质结合后引起染料最大吸收的改变，从465 nm 变为595 nm ，光吸收增加。
蛋白质-染料复合物具有较大的吸光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度，最低检出量为1 g 蛋白。
染料与蛋白质的结合是很迅速的过程，大约只需2分钟，结合物的颜色在1小时内是稳定的。
由于该法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。
N CH 2CH 3CH 2N +CH 3CH 2CH 2NHCH 3CH 3O CH 2CH 3SO 3-SO 3Na蛋白质+ 蛋白质-染料复合物H +考马斯亮蓝G-250（蓝色，λmax595nm ）【仪器与试剂】1．紫外-可见分光光度计，微量注射器。
2．考马斯亮蓝G-250，95%乙醇，85%(W/V)磷酸。
【实验步骤】1．标准蛋白质溶液的配制称取牛血清白蛋白适量，加水溶解并配制成1 mg/ml 的溶液。
2．蛋白试剂的配制称取100 mg考马斯亮蓝G-250，加入95%乙醇50 ml溶解，再加入85%(W/V)磷酸100 ml，将溶液用水稀释至1000 ml。
试剂的终浓度为0.01%考马斯亮蓝G-250，4.7%乙醇和8.5%(W/V)磷酸。
3．标准曲线的制作取标准蛋白质溶液5、10、20、50、100 μl于小试管中，用水稀释至0.1 ml，然后分别加入5 ml蛋白试剂，充分振荡混合，2分钟后于595 nm测定其吸光度值。
以0.1 ml水及5 ml蛋白试剂作为空白对照。
以蛋白浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线作为定量依据。
4．样品测定取含10~100 μg蛋白质溶液于小试管中，加水稀释至0.1 ml，然后加入5 ml 蛋白试剂，充分振荡混合，2分钟后于595 nm测定其吸光度值。
考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量
考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量专业班级：制药工程3班小组成员：梦娴敏林晓丝一、实验目的1、了解考马斯亮蓝法测定蛋白质的原理2、掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的操作步骤二、实验原理1、根据蛋白质的理化性质，有多种蛋白质定量方法。
考马斯亮蓝G-250是比色法与色素法相结合的复合方法。
考马斯亮蓝G-250是一种染料，在游离状态下呈棕红色，当与蛋白质结合后呈青蓝色。
在一定围，也就是蛋白质含量在0~1000ug围，蛋白质-色素结合物在595nm 下的吸光度与蛋白质含量成正比，所以可用比色法测定。
2、考马斯亮蓝G-250法有常量法和微量法两种。
三、仪器与试剂1、仪器：分析天平；铁架台；大漏斗；洗瓶；烧杯100m l×2、50m l×1；吸管10ml×2、5ml×1；胶头滴管；移液枪；离心管10个；722型分光光度计；容量瓶100ml×3；洗耳球×2；玻璃棒；记号笔。
2、试剂：（1）蒸馏水。
（2）标准蛋白质溶液：用移液枪吸取1ml浓度为1mg/ml标准蛋白质溶液，溶于蒸馏水并定容至10ml，制成0.1mg/ml的原液。
（3）考马斯亮蓝G-250(0.01%)染液:称取0.01g考马斯亮蓝G-250,溶于5ml 90%乙醇中，加入85%（m/v)的磷酸10ml,最后用蒸馏水定容至100ml（此溶液不宜久存，在常温中可放置1~2个月）；将定容好的染液过滤并装入棕色瓶中保存。
（4）样品液：用移液枪取1ml纯牛奶液体（经调查，市场上大部分纯牛奶中蛋白质的含量大致为每100ml中2.5~3.5g），用蒸馏水稍做稀释，然后转移至一号100ml的容量瓶中并定容至100ml;用10ml的吸量管吸取10ml一号容量瓶中的液体于二号100ml的容量瓶中，最后用蒸馏水定容至100ml，此时二号容量瓶中为待测样品液。
四、操作步骤1、0~100μg/ml标准曲线的制作：取8支离心管，编号后，按下表加入试剂，盖塞后，将各试管中的溶液纵向倒转混匀，室温静止5min后，以管一为空白对照，在595nm 下比色测定。
考马斯亮蓝染色法测定蛋白质的含量
实验一 考马斯亮蓝染色法测定蛋白质的含量【实验目的】1．掌握考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量的原理和过程。
2．熟悉蛋白质含量测定的影响因素。
【实验原理】1976年Bradford 等建立了用考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合，迅速、灵敏的定量测定蛋白质的方法。
染料与蛋白质结合后引起染料最大吸收的改变，从465 nm 变为595 nm ，光吸收增加。
蛋白质-染料复合物具有较大的吸光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度，最低检出量为1 g 蛋白。
染料与蛋白质的结合是很迅速的过程，大约只需2分钟，结合物的颜色在1小时内是稳定的。
由于该法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。
N CH 2CH 3CH 2N +CH 3CH 2CH 2NHCH 3CH 3O CH 2CH 3SO 3-SO 3Na蛋白质+ 蛋白质-染料复合物H +考马斯亮蓝G-250（蓝色，λmax595nm ）【仪器与试剂】1．紫外-可见分光光度计，微量注射器。
2．考马斯亮蓝G-250，95%乙醇，85%(W/V)磷酸。
【实验步骤】1．标准蛋白质溶液的配制称取牛血清白蛋白适量，加水溶解并配制成1 mg/ml 的溶液。
2．蛋白试剂的配制称取100 mg考马斯亮蓝G-250，加入95%乙醇50 ml溶解，再加入85%(W/V)磷酸100 ml，将溶液用水稀释至1000 ml。
试剂的终浓度为0.01%考马斯亮蓝G-250，4.7%乙醇和8.5%(W/V)磷酸。
3．标准曲线的制作取标准蛋白质溶液5、10、20、50、100 μl于小试管中，用水稀释至0.1 ml，然后分别加入5 ml蛋白试剂，充分振荡混合，2分钟后于595 nm测定其吸光度值。
以0.1 ml水及5 ml蛋白试剂作为空白对照。
以蛋白浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线作为定量依据。
4．样品测定取含10~100 μg蛋白质溶液于小试管中，加水稀释至0.1 ml，然后加入5 ml 蛋白试剂，充分振荡混合，2分钟后于595 nm测定其吸光度值。
考马斯亮蓝法法测定蛋白质含量
（优选）考马斯亮蓝法法测定 蛋白质含量
【实验原理】
考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于 染料结合法的一种。
考马斯亮蓝G250在酸性溶液中呈棕 红色，最大吸收峰在465nm；当它与蛋白 质通过范德华键结合成复合物时变为蓝色， 其最大吸收峰移至595nm，而且消光系数 更大。
考马斯亮蓝G-250在游离状态 下呈红色，最大光吸收在 465nm；当它与蛋白质结合 后变为青色，蛋白质-色素结 合物在595nm波长下有最大 光吸收。其光吸收值与蛋白质 含量成正比。
蛋白质与考马斯亮蓝G250的 结合十分迅速，约2min即可 反应完全，其复合物在1h内 保持稳定。
考马斯亮蓝R250与蛋白 质反应虽然比较缓慢， 但是可以被洗脱下去， 所以可以用来对电泳条 带染色。
在一定蛋白质浓度范围内 (1～1000µg/ml）,
考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在465nm；
蛋白质－染料复合物在595nm处的光吸收与蛋白 考马斯亮蓝试剂（mL）
蛋白质与考马斯亮蓝G250的结合十分迅速，约2min即可反应完全，其复合物在1h内保持稳定。 考马斯亮蓝法法测定蛋白质含量
质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。 当一束平行单色光(I0)照射有色溶液时，光的一部分被吸收，一部分透过溶液(I)
蛋白质与考马斯亮蓝G250的结合十分迅速，约2min即可反应完全，其复合物在1h内保持稳定。 由于蛋白质－染料复合物具有很高的消光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度（最低检出量为1µg）。 考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。 （优选）考马斯亮蓝法法测定蛋白质含量
当它与蛋白质通过范德华键结合成复合物时变为蓝色，其最大吸收峰移至595nm，而且消光系数更大。 可见光范围内波长和颜色的关系
考马斯亮蓝法测蛋白质含量实验报告
一、实验目的1. 熟悉考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的基本原理和方法。
2. 掌握实验操作步骤，提高实验技能。
3. 学习利用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的方法，并分析实验结果。
二、实验原理考马斯亮蓝法是一种常用的蛋白质定量方法，其原理基于染料结合法。
在一定条件下，考马斯亮蓝G-250染料与蛋白质发生结合，形成蛋白质-染料复合物。
该复合物在595nm波长下的光吸收值与蛋白质浓度成正比。
通过测定吸光度值，可以计算出样品中的蛋白质含量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 标准蛋白质溶液（如牛血清白蛋白，BSA）- 待测蛋白质样品- 考马斯亮蓝G-250染料- 95%乙醇- 磷酸- 超纯水- 紫外分光光度计- 移液枪- 烧杯- 玻璃杯- 比色皿2. 实验步骤：1. 配制考马斯亮蓝G-250染液：称取0.01g考马斯亮蓝G-250，溶于5mL 95%乙醇中，加入85% (m/V) 磷酸10mL，最后用超纯水定容至100mL，装入棕色瓶中保存。
2. 配制标准蛋白质溶液：称取适量BSA，用超纯水配制成1mg/mL的标准溶液。
3. 样品处理：取适量待测蛋白质样品，用超纯水稀释至适当浓度。
4. 比色测定：a. 准备一系列标准蛋白质溶液，分别加入5mL考马斯亮蓝G-250染液，充分混匀，室温下放置10min。
b. 将上述溶液倒入比色皿，于595nm波长下测定吸光度值，记录数据。
c. 将待测蛋白质样品按照上述步骤进行处理，测定吸光度值。
5. 绘制标准曲线：以蛋白质浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
6. 计算待测蛋白质样品的蛋白质含量：将待测蛋白质样品的吸光度值带入标准曲线，计算蛋白质含量。
四、实验结果与分析1. 标准曲线：根据实验数据，绘制标准曲线，线性关系良好。
2. 待测蛋白质样品的蛋白质含量：将待测蛋白质样品的吸光度值带入标准曲线，计算得到蛋白质含量为XX mg/mL。
五、实验讨论1. 考马斯亮蓝法是一种快速、简便、灵敏的蛋白质定量方法，广泛应用于生物、医药、食品等领域。
实验考马斯亮蓝测蛋白质含 量
实验7 考马斯亮蓝考G-250染色法测定蛋白质含量一、目的1、学习一种蛋白质染色测定的方法2、掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的基本原理和方法二、原理蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化，从而改变这些染料的光吸收。
在些基础上发展了蛋白质染色测定方法。
涉及的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫。
目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝。
考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，其所含疏水基团在酸性条件下与蛋白质的疏水区具有亲和力，通过疏水作用与蛋白质相结合，形成蓝色的蛋白质染料复合物，在595nm处有最大吸光度，在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质染料符合物在595nm处的吸光度与蛋白质杭亮成正比，因此可用于蛋白质含量测定。
反应2—5分钟即呈最大光吸收，至少稳定1小时。
在0.01—1.0 mg蛋白质/ml范围内均可。
该法操作简便迅速，消耗样品量少，但不同蛋白质之间差异大，且标准曲线线性差。
高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂时测定有干扰。
缓冲液浓度过高时，改变测定液pH值会影响显色。
考马斯亮蓝染色能力强，比色杯不洗干净会影响光吸收值，不可用石英怀测定。
三、材料、试剂与器具（一）试剂1、染色液：取考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50ml 95%乙醇中，加100ml 85%磷酸，加水稀释至1升。
棕色瓶保存，该染色液可保存数月，若不加水可长期保存，用前稀释。
2、标准蛋白溶液：0.5mg/ml牛血清白蛋白。
3、未知浓度的蛋白质溶液用酪蛋白配制，浓度控制在10—30mg/ml（二）器具1、试管及试管架2、移液管（1ml,5ml）3、可见光分光光度计四、操作步骤（一）标准曲线的制作1、取7支试管，按下表加入试剂试0123456管编号00.10.20.40.60.81蛋白标准溶液10.90.80.60.40.20蒸馏水考5555555马斯亮蓝2、将试管摇匀，放置20分钟。
考马斯亮蓝法测蛋白质含量实验报告
考马斯亮蓝法测蛋白质含量实验报告考马斯亮蓝法（Bradford assay）是一种常用于测定蛋白质含量的实验方法。
本文将对考马斯亮蓝法进行详细介绍，并展示一个实验报告的范例。
1. 引言蛋白质是生命体中不可或缺的重要分子，因此准确测定蛋白质的含量对于生物学研究至关重要。
考马斯亮蓝法是一种常用的蛋白质测定方法，其原理基于蛋白质与考马斯亮蓝染料之间的非共价结合。
2. 实验目的本实验的目的是利用考马斯亮蓝法测定给定溶液中蛋白质的含量。
3. 实验步骤3.1 准备工作首先，准备好所需的试剂和设备，包括考马斯亮蓝试剂、蛋白质标准品、显微管、离心机等。
3.2 制备标准曲线按照给定的浓度，分别取一系列蛋白质标准品，加入不同的显微管中。
然后，加入适量的考马斯亮蓝试剂，充分混合。
将显微管放入离心机中离心，使液体沉淀。
离心后，取出显微管，观察颜色变化，并使用分光光度计测定吸光度。
3.3 测定待测样品将待测样品加入显微管中，加入适量的考马斯亮蓝试剂，充分混合。
然后，将显微管放入离心机中离心，使液体沉淀。
离心后，取出显微管，观察颜色变化，并使用分光光度计测定吸光度。
4. 结果与讨论通过测定标准曲线，我们可以得到各个蛋白质标准品的吸光度与浓度之间的关系。
利用这个关系，我们可以计算出待测样品中蛋白质的浓度。
在实验中，我们观察到显微管中的液体颜色会随着蛋白质浓度的增加而加深。
这是因为考马斯亮蓝染料与蛋白质发生非共价结合，形成复合物，使溶液变色。
吸光度的测定则是通过分光光度计来实现的。
需要注意的是，考马斯亮蓝法对于某些物质的干扰较大，因此在实验中应该选择适当的样品稀释倍数，以确保测定结果的准确性。
5. 结论通过考马斯亮蓝法，我们成功测定了给定溶液中蛋白质的含量，并得到了标准曲线。
通过标准曲线，我们可以计算出待测样品中蛋白质的浓度。
6. 结束语考马斯亮蓝法是一种简单、快速且准确的测定蛋白质含量的方法。
它被广泛应用于生物学研究和实验室工作中。
浙江大学生物化学实验甲 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
浓度的计算
• 测出未知样品在595nm处的光吸收值，通过标准 曲线求出未知样品的蛋白含量并进而求出未知样 品的浓度。
• 但由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的
含量不同，因此考马斯亮蓝法用于测定不同蛋白 质时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
• 主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二 烷基硫酸钠（SDS）等。
3、实验材料及试剂
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
管号 1 试剂 0.1mg/ml标准蛋白质溶液（ml） 蒸馏水（ ml ） 考马斯亮蓝试剂（ ml ） 1.0 5 0.2 0.8 5 0.4 0.6 0.6 0.4 5 5 0.8 0.2 5 5 1.0 0.5 0.5 0.5 0.5 5 5 2 3 4 5 6 7 8
即摇匀使反应完全。 • 反应的灵敏度很高，比Lowry法约高四倍，因此
是一种常用的快速测定微量蛋白质的方法。
• 且结合物在室温下1h内保持稳定，在5～20min之 间，颜色的稳定性最好。
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
2、考马斯亮蓝法的特点
• 操作简便快捷；可测范围为0～1 000μg/mL，最小
可测2.5μg/mL蛋白质， • 干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+ 离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、 EDTA等均不干扰此测定法。
（1）、试验材料 • 待测蛋白溶液 （2）、试验试剂 • 0.1mg/ml的牛血清白蛋白 • 蒸馏水
• 考马斯亮蓝试剂
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
4、操作步骤
（1）、标准曲线的制作
实验 6.考马斯亮蓝法测蛋白质的含量
在一定蛋白质浓度范围内 (1～1000µg/ml）, 蛋白质－染料复合物在595nm处的光吸收与蛋白 质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。 蛋白质与考马斯亮蓝G250的结合十分迅速， 约2min即可反应完全，其复合物在1h内保持稳 定。由于蛋白质－染料复合物具有很高的消光系 数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度（最低 检出量为1µg）。由于染色法简单迅速，抗干扰 性强，灵敏度高，线性关系好，近年来在某些方 面有取代经典的Lowry法的趋势，是一种较好的 蛋白质快速微量测定方法。
（二） 样品提取液中蛋白质含量的测定
1.蛋白质提取: 称取样品400mg，加蒸馏水5ml，匀 浆，4000rpm离心10min， 取上清液。 残渣用2.0ml蒸馏水悬浮，4000rpm离 心10min，合并上清液并定容至10ml。
2. 蛋白质含量测定:
取3支试管，各吸取样品提取液0.1ml，
加入考马斯亮蓝G250试剂3.0ml，充分振荡
枪头（吸液嘴）的装配 在将枪头（pipette tips）套上移 液枪时，正确的方法是将移液枪 （器）垂直插入枪头中，稍微用力 左右微微转动即可使其紧密结合。
移液的方法
1.吸取液体时，用大拇指将按钮按下至第一 停点，移液器保持竖直状态，将枪头插入液 面下2－3毫米。 2.然后慢慢松开按钮回原点。 3.接着将按钮按至第一停点排出液体，稍停 片刻继续按按钮至第二停点吹出残余的液体。 最后松开按钮。
1. NaCl、KCl、MgCl2、(NH4)2SO4、乙醇等物 质对测定无影响，而大量的去污剂如Triton X100、SDS等严重干扰测定，少量的去污剂及 Tris、乙酸、2-巯基乙醇、蔗糖、甘油、 EDTA有少量颜色干扰，可很容易地通过用适 当的溶液对照而消除。同时注意，比色应在显 色2min～1h内完成；如果测定很严格，可以 在试剂加入后的5～20min内测定光吸收，因 为在这段时间内颜色最稳定。
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实验五考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
一、实验目的
1.掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质含量的原理与方法
2.熟练分光光度计的使用和操作方法。
二、实验原理
考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种，它与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。
它在酸性溶液中呈棕红色，最大光吸收峰在465nm，当它与蛋白质结合形成复合物时，其最大吸收峰改变为595nm。
考马斯亮蓝G-250—蛋白质复合物呈蓝色，在一定范围内，595nm下光密度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质含量的测定。
考马斯亮蓝结合法是近年来发展起来的蛋白质定量测定法，本方法具有操作方便、快速、干扰因素少的特点。
离心机的使用说明： 1.要离心的离心管和管套要称重，重量不等时将水加在管套里。
2．离心管的放置是对角线放置，要求必须对称。
3. 先将离心机转速旋钮恢复到零刻度后，再定时间，定好时间后缓慢旋转转速旋钮，使离心机均匀的提速到预定转速。
分光光度计的使用说明： 1.接通电源开关，预热20min后，再选择须用的单色光波长。
2.放入已加入溶液的比色皿，盖上样品室盖，推动试样架拉手，使对照比色皿（溶液装入4／5高度，置第一格）置于光路上，调节100％透射比按钮，使吸光度值A=。
3.推动试样架拉手，使样品比色皿置于光路上，读出吸光度值。
4.测量完毕，取出比色皿，洗净后置于乙醇溶液中浸泡脱色。
5.电源开关置于“关”，拔下电源插头。
三、试剂与器材：
1. 试剂：
（1）％NaCl：9g NaCl溶解在1L的容量瓶中。
（2）标准蛋白质：称取50mg结晶牛血清蛋白定溶于50ml容量瓶里。
（3）染液：考马斯亮蓝G-250 ，溶于250mL95%乙醇，再加入500mL85％(W
／V)磷酸，保存于棕色瓶中，称为母液。
取150 mL然后加蒸馏水定容到1000mL，保存于棕色瓶中，备用。
2.器材：
试管；吸管10mL、l5mL、lmL、；722分光光度计
四、操作方法
1.标准曲线的制备
取6支试管，按下表加入各：
以各管相应标准蛋白质含量（mg）为横坐标、A595为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 待测样品测定
中加蛋白质样品，再加入考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀，放置5min后，在595nm波长下吸光度值，记录A595。
根据所测A595从标准曲线上查得蛋白质含量。
并计算蛋白样品的浓度（mg/ml）。
五、实验结果及分析
六、思考题
蛋白质含量的测定还有哪些方法？其优缺点是什么？。