基因工程菌的稳定性_
基因工程菌质粒的稳定性
四、提高质粒稳定性的措施
1．选择合适的宿主菌和合适的载体 （1）宿主菌
（2）载体
大肠杆 菌
酵母菌
四、提高质粒稳定性的措施
2．选择适宜的培养方式
（1）两步发酵方式：生长阶段外源基因表达阶段 （2）控制基因过量表达
3．控制合适的培养条件 （1）施加选择压力 （2）培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有 利于稳定 （3）培养温度： 较低的培养温度有利于重组质粒 的稳定
4．采用固定化技术
1. 质粒的不稳定性有哪几种表现？ 2. 质粒不稳定性产生的机制有哪些？ 3. 影响质粒不稳定性的因素有哪些？ 4. 如何提高质粒的稳定性？
课程名称:生物工艺学
基因工程菌质粒的稳定性
1 质粒不稳定的表现 2 质粒不稳定性的产生机制 3 影响质粒稳定性的因素 4 提高质粒稳定性的措施
一、质粒不稳定的表现
n 质粒丢失：脱落性不稳定
由环境因素或生理、遗传学原因，质粒从宿主中 丢失，丢失率因环境、宿主、质粒结构而不同。
n 质粒的基因结构突变：结构不稳定性
在pH为6．0时，基因工程酵母表达乙肝表面抗原的质粒最稳定， 在pH值为5.0时，质粒最不稳定。
设法控制pH值在合适范围内，确保质粒的稳定性。
（3)溶解氧和搅拌
当溶解氧浓度在培养基中周期变化时，连续培养酵母的质粒稳 定性强烈依赖于生长速率，在较低生长速率下完全稳定。
增加氧浓度能引起细胞内氧化性胁迫，稳定阶段缺氧限制产物 的形成和质粒稳定性。
在不同培养基中基因工程菌，还存在质 粒丢失概率的差异；比生长速率也不同。
2．发酵操作方式
n 流加操作方式 n 两段连续培养 n 固定化后
细胞
凝胶网 格载体
半透膜 胶囊ຫໍສະໝຸດ 3．发酵培养条件（1）温度
(附具体方法)基因工程菌质粒(遗传)稳定性--原创
质粒遗传稳定性目前没有明确的规定，但一般用斜面传代法，一定数量点接抗性和非抗性板，生长计数（主要证明分裂稳定性）；更严谨时，可进一步双酶切、测序等验证（证明结构稳定性--国家药品监督管理局的新生物制品审批）。
工业用菌确实存在很多问题，免不了质粒丢失严重，高突变等现象，但是一般工业用菌都是经过10代以上稳定筛选之后才用于小试、中试和工业生产的。
菌体不稳定造可能成的损失巨大，所以鲜有工业用菌使用在2-3代菌就没有产量或者产量低的菌株。
一般来说，一代菌用一点少一点，一代菌上罐太伤了，工业用菌一般会存储足够量的二代菌（多数是冷冻干燥安瓿管）用于生产，在生产中需要活化、制作摇瓶种子，如果菌体生长慢，还要进一步做种子罐，最后才能用于生产。
如果菌体稳定性差，几代传下来，发酵的不稳定造成损失是很难估计的，而且一般不稳定菌都是先做小试、中试，成功后才能用于生产。
质粒在宿主中的稳定性确实需要进行筛选，实验中遇到的质粒突变能避免尽量避免，做好的质粒也不一定一直存放，由于不断的被用于各种改进实验，期间经过的大量筛选，避免了一代菌用完之后就没有更好的使用。
使用高保真酶扩增、保证没有物理化学因素促变，使用合适的宿主，还是很容易得到没有突变的质粒的，后续连续传代培养也可以得到比较稳定的质粒的。
质粒不稳定是重组基因工程菌培养过程中的常见问题，也是影响外源基因高效表达的限制因素之一[77~78]。
Koch[79]最早对外源基因引入宿主而对细胞产生的代谢负荷进行考察，研究表明质粒的大小、拷贝数，质粒的维持，抗性基因的表达，培养环境的变化，都会对宿主细胞产生代谢负荷，当供氧不足或营养物质受限制时，代谢负荷对细胞生长的影响会更加明显。
基因工程菌中质粒稳定性问题是影响基因工程菌实现规模生产的一个重要因素,这种不稳定性主要表现为两种形式: 一种是重组DNA 质粒的丢失, 称为脱落性不稳定; 另一种是质粒中的基因结构发生突变, 称为结构性不稳定。
基因工程菌培养及其不稳定性
5. 搅拌器转速和通气应适当
6. 空气过滤系统要采用活性碳和玻璃纤维棉材料
7. 培养液要经化学处理或热处理后才可排放
8. 发酵罐的排气口须有蒸汽灭菌或微孔滤器除菌后才将废气放出。
9. 轴封可采用磁力搅拌或双端面密封
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中，大量乙酸在透析器中透过半透膜，降低培养基中的乙酸浓度，并
可通过在透析液中补充养分而维持较合适的基质浓度，从而获得高密
度菌体。
膜的种类、孔径、面积，发酵液和透析液的比例，透析液的组成
循环流速，开始透析的时间、透析培养的持续时间段都对产物的产率
有影响。
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一、基因工程菌的培养方式
5. 固定化培养
基因工程菌培养的一大难题是如何维持质粒的稳定性。 有人将固定化技术应用到这一领域，发现基因工程菌经固定化 后，质粒的稳定性大大提高，便于进行连续培养，特别对分泌型菌 更为有利。 由于这一优点，基因工程菌固定化培养研究已得到迅速开展。
提高发酵罐的供氧能力。
有些含质粒的菌对发酵环境的改变比不含质粒的菌反应慢，因
而采用间隙改变培养条件的方法以改变这两种菌的比生长速率，从
而改善质粒的稳定性。通过间隙供氧的方法和通过改变稀释速率的
方法都可提高质粒的稳定性。
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提高基因工程菌稳定性的方法
5. 控制培养条件
pH pH 影响重组菌的稳定性。
5. 控制培养条件
限制性基质
一般培养基中各成分并不是完全平衡的，经过一段时间的培养， 微生物的生长通常会受到一种或几种物质的限制。
限制性基质的种类对重组菌有不同的影响
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提高基因工程菌稳定性的方法
5. 控制培养条件
溶解氧
在基因重组菌的高密度培养时，为了ห้องสมุดไป่ตู้持所需的溶氧水平，除
工程菌的高效表达及稳定性
固定化细胞的制备方法
常用的有吸附法、包埋法、共价结合法、交
联法、多孔物质包络法、超过滤法等，其中
包埋法最为普遍。
2.选择合适的载体
改造、构建能稳定表达的质粒载体是构建工程菌的重要一环。针对不同的载体及 不同的目的采取不同的策略。 3.选择压力 从遗传学来说，选择意味着利用某些生长条件使得只有那些具有一定遗传特性 的细胞才能够生长。
4.分段控制培养 提高质粒稳定性的目的是为了提高克隆菌的发酵生产率，但外源基因表达水平越 高，重组质粒往往越不稳定。 可采用两阶段培养法，即在发酵前期控制外源基因不过量表达，使重组质粒稳 定地遗传；到后期通过提高质粒的拷贝数或转录、翻译效率使外源基因高效表 达。
6.固定化 固定化技术包括固定化酶技术与固定化微生物技术。固定化微生物技术是用化学 或物理手段将游离微生物定位于限定的空间区域,以提高微生物细胞的浓度,使其 保持较高的生物活性并反复利用的方法。
良好固定化细胞方法的条件：
1）应该能够控制固定化细胞的大小和空隙度； 2）原料易得、成本较低，方法简便、易行，载体对细胞是惰 性的，固定过程温和，对细胞损伤轻；
（4） 原核基因不含内含子（intron），没有转录 后加工过程。 （5） 原核生物基因表达的控制主要是在转录水平。 对RNA合成的调控有两种方式：启始控制（启动子 控制）和终止控制（衰减子控制）。 （6） 在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上，有 一个转译启始密码子及同16S核糖体RNA3‘末端碱 基互补的序列，即SD序列，真核基因则无此序列。
分泌到培养基中，提纯工艺简单，成本低。
影响工程菌发酵的原因
对发酵影响较大的几个因素有： 培养基的影响；接种量的影响；温度的影响； 溶解氧的影响；诱导时机的影响；诱导表达程 序的影响；pH的影响。
酶工程复习资料
酶工程复习资料名词解释1、酶反应器：用于酶进行催化反应的容器和附属设备2、pH记忆：3、产物阻遏作用：又称酶生物合成的反馈阻遏作用，是指酶催化反应的产物或代谢途径末端的产物使该酶的生物合成受到阻遏现象。
4.1酶的延续合成型:酶的生物合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成一段时间的生物合成模式。
4.2同步合成型：是指酶的生物合成与细菌生长同步进行的一种酶生物合成模式。
4.3中期合成型：酶在细胞生长一段时间后才开始合成，细胞进入生长平衡期后，酶的生物合成也随之停止。
4.4滞后合成型：酶是在细胞进入生长平衡期后才开始生物合成并大量积累，5、固定化细胞——固定在载体上，并在一定空间范围内进行生命活动的细胞。
6、电场膜分离——是在半透膜的两侧分别装上正、负电极。
在电场作用下，小分子的带电物质或离子向着与其本身所带电荷相反的电极移动，透过半透膜，而达到分离的目的。
7、催化周期：酶进行一次催化所需的时间。
8、固定化酶：固定在载体上并在一定空间范围内进行催化反应的酶称为固定化酶。
9、抗体酶：抗体酶又称为催化性抗体，是一类具有催化功能的抗体10、立体异构专一性：当酶作用的底物含有不对称碳原子时，酶只能作用于异构体的一种，这种绝对专一性称为立体异构专一性。
11、微滤：又称为孔过滤，微滤介质截留的物质颗粒直径为0.2-2um，主要用于细菌、灰尘等光学显微镜可看到的颗粒物质的分离。
12、酶的比活力：是一个纯度指标，指特定条件下，单位质量的蛋白质或RNA所具有的酶活。
13、膜反应器：是将酶的催化反应和半透膜的分离作用组合在一起的反应器。
14、酶电极：是由固定化酶与各种电极密切结合的传感装置。
15、氨基酸置换修饰：将酶分子上的某一个氨基酸置换成另一个氨基酸的修饰方法。
16、盐析沉淀法：是利用不同蛋白质在不同盐溶度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离的过程。
基因工程菌的培养
基因工程菌的培养
发酵过程：两种菌的混合物的发酵过程
一．工程菌大规模培养的两个关键
1.工程菌的稳定性
不稳定的原因：质粒的不稳定：质粒的丢失
重组质粒发生DNA片段脱落
表达产物的不稳定
工程菌不稳定的因素：培养基的组成（合成培养基有利于宿主细胞的生长，不利
于外源基因的表达）
培养温度（低温有利于重组质粒的稳定遗传）
菌体的比生长速率
控制基因的过量表达
二、溶氧量
溶氧量过低时，说明葡萄糖过量，此时应降低流加速率；当溶氧量过高时，说明葡萄糖即将耗尽，此时应加大流加速率。
当甲醇流速过快时，溶氧量上升：当甲醇流加速率过慢时，溶氧量降低。
三、毕赤酵母
为甲醇利用型酵母，能以甲醇为唯一碳源和能源生长。
甲醇利用途径的第一个酶为醇氧化酶。
生长在限量甲醇中的细胞能诱导出大量该酶，而生长在甘油、葡萄糖或乙醇中的细胞却不能产生该酶。
因此利用醇氧化酶基因作为启动子来构建表达系统而高效表达外源蛋白。
四、重组毕赤酵母具体方法（三段法）
第一阶段：在甘油或葡萄糖为碳源的合成培养基中进行工程菌的分批培养，以累积菌体细胞。
第二阶段：在限制生长速率下流加甘油或葡萄糖的流加补料培养，以进一步提高菌体量。
第三阶段：即诱导阶段，开始较低速度流加甲醇，以诱导外源蛋白的表达。
（要控制甲醇的流加量，浓度高于5g/L时，将会严重抑制细胞的生长。
基因工程菌的稳定性
基因工程菌的培养方式
固定化培养 基因工程菌培养的一大难题是如何维持质粒的稳定性。有人将固定化
技术应用到这一领域，发现基因工程菌经固定化后，质粒的稳定性大大提 高，便于进行连续培养，特别是对分泌型菌更为有利。由于这一优点，基 因工程菌固定化培养研究已得到迅速开展。
提高质粒稳定性的方法
提高基因工程菌稳定性的策略
分阶段控制培养 因外源基因表达造成质粒不稳定时，可以考虑将发酵过程分阶段控制 在生长阶段使外源基因处于阻遏状态，避免因表达造成不稳定性问 题的发生；在获得需要的菌体密度后，再去阻遏或诱导外源基因表 达。 连续培养时可以考虑采用多级培养，如在第一级进行生长，维持菌 体的稳定性，在第二级进行表达。
第6节 基因工程菌的稳定性
基因工程菌的遗传不稳定性及其对策
基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制 改善基因工程菌不稳定性的策略
基因工程菌的稳定性
基因工程菌的遗传不稳定性的表现
基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳定性， 这种 不稳定性具有下列两种表现形式：
结构不稳定性 重组 DNA 分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，导致其表 观生物学功能的丧失
长对数期，获得高密度菌体，通常把溶氧控制和流加补料措施结合起来， 根据基因工程菌的生长规律来调节补料的流加速率。
基因工程菌培养方式
连续培养 连续培养是将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至菌体浓度达到一定程
度后，开动进料和出料蠕动泵，以一定稀释率进行不间断培养。 连续培养可以为微生物提供恒定的生活环境，控制其比生长速率，为研
基因重组菌的比生长速率与培养环境有关，如温度，pH，溶氧，限 制性营养物质浓度，有害代谢产物浓度等。在一定的温度和 pH 下，限制 性基质浓度往往是决定比生长速率的主要因素。
基因工程菌的稳定性
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发酵罐的组成有：
发酵罐体、保证高传质作用的搅 拌器、精细的温度控制和灭菌系 统、空气无菌过滤装置、残留气 体处理装置、参数测量与控制系 统、培养液配制和连续操作系统。
对发酵罐要求： 提供菌体生长最适生长条件， 培养过程不得污染， 保证纯菌培养， 培养及消毒过程不得游离异物， 不能干扰细菌代谢活动等。
温度还影响蛋白质的活性和包 含体的形成。
⒋ 溶解氧的影响
对于好氧发酵,溶解氧浓度是重 要的参数。
好氧微生物利用溶解于培养液 中的氧气进行呼吸。
若能提高溶氧速度和氧的利用 率，则能提高发酵产率。
发酵时，随DO2浓度的下降， 细胞生长减慢，ST值下降，发酵后 期下降幅度更大。
外源基因的高效表达需要大量 的能量，促进细胞的呼吸作用，提 高对氧的需求。
第五节 基因工程菌的 稳定性
基因工程菌在传代过程中常 出现质粒不稳定的现象。
质粒不稳定可分为： 分裂不稳定 结构不稳定
分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一 定比例不含质粒子代菌的现象。
结构不稳定：指外源基因从质粒上丢 失或碱基重排、缺失所致工程菌性 能的改变
重组人IL-2大肠杆菌工程菌质粒稳定性的研究
重组人IL-2大肠杆菌工程菌质粒稳定性的研究摘要基因工程菌中质粒稳定性对于基因工程菌的发酵有着重要影响，但基因工程菌在传代中经常出现质粒不稳定遗传的现象。
本试验通过在工程菌的培养过程中添加抗生素这一选择压力和诱导表达目的蛋白的方式来提高基因工程菌的稳定性，并通过双酶切电泳分析及高效率的诱导表达外源蛋白来进行检测，得出工程菌在LB（-）和LB（+）平板上都能生长且形态相似；电泳图平行、酶切片段的位置大致一致；诱导表达的外源基因的质粒稳定。
提高质粒稳定性有利于外源蛋白表达，以满足大规模生产发酵。
关键词：基因工程菌；质粒；稳定性-I-Study on the stability of plasmid of recombinanthuman IL-2 E.coli bacteriaAbstractEscherichia coli. plasmid stability for the genetic engineering of bacteria fermentation has important implications genetically engineered bacteria in the mid-recurring genetic instability of the plasmid. This experiment in engineering from the training course to add the option of antibiotic pressure and protein expression induced by way of reference high genetically engineered bacteria stability and digested by electrophoresis and high efficiency induced expression of foreign proteins to detect, the virus can grow in the panel of LB(-) and LB(+), and the morphology is similar; The electrophoregram is parallel, and the position of the fragment is consistenct roughly; Inducible expression of foreign genes is stabile. We improve the stabilization of the foreign gene in order to meet the large-scale fermentation.Key words: Genetic engineering ; plasmid ; stability-II-目录摘要 (I)ABSTRACT ............................................................................................................................... I I 前言. (1)1 材料与方法 (3)1.1试验材料 (3)1.1.1 菌种质粒 (3)1.1.2 培养基 (3)1.1.3 常用药品 (3)1.1.4试验仪器 (3)1.2试验方法 (3)1.2.1 基因工程菌的转化 (3)1.2.2 制平板 (3)1.2.3 连续传代 (3)1.2.4 鉴定 (4)2 结果与分析 (6)2.1不同代菌的传代结果 (6)2.2上述不同代质粒的电泳图 (8)2.3不同代质粒的酶切图 (9)2.4诱导表达不同代的基因工程菌的外源基因蛋白电泳图 (10)3 讨论 (11)3.1分析本试验所出现的问题 (11)3.2质粒稳定性影响的若干因素 (12)3.2.1 含调控型启动子的基因工程菌稳定性控制 (12)3.2.2 选择性培养基提高质粒稳定性 (12)3.2.3 培养操作方式对工程菌稳定性的影响 (12)3.2.4 培养条件对工程菌稳定性的影响 (12)4 结论 (14)参考文献 (15)致谢 (17)-III-前言随着分子生物学、免疫学理论和技术的发展，运用重组表达技术来生产预防和治疗疾病的制品已成为近几年研究的热点。
工程菌的高效表达及稳定性护理课件
CHAPTER 03
工程菌的稳定性护理
菌种保藏技术
01
02
03
低温保藏
将工程菌种保存在低温环 境下，如-80°C或-196°C ，以减缓菌种生长和变异 的速度。
真空干燥保藏
通过去除水分，降低菌种 活性，延长保藏时间。
基因编辑技术将有助于发现和鉴定新的基因和蛋白质，进 一步拓展工程菌的应用领域。
新型表达载体的研发
新型表达载体是提高工程菌表达效率 和稳定性的关键，未来将会有更多高 效、稳定的新型表达载体被研发和应 用。
新型表达载体将有助于解决现有表达 载体存在的问题，如表达水平低、易 污染等，进一步提高工程菌的应用价 值。
表达载体技术主要涉及载体的设计和 改造、外源基因的插入和表达调控等 。
表达载体技术的关键在于选择合适的 载体和构建高效的载体系统，以提高 外源基因的表达水平和稳定性。
培养优化技术
培养优化技术是通过优化培养条件，提高工程菌的生长和代谢速率，从而提高目标 产物的产量。
培养优化技术主要涉及温度、pH、氧气、营养物质等培养条件的调节和控制。
添加稳定剂
在培养基中添加抗氧化剂、抗紫 外线和重金属等稳定剂，提高工 程菌的抗逆性。
培养条件控制
温度控制
保持恒定的培养温度，避 免温度波动对工程菌生长 和稳定性的影响。
pH值控制
维持适宜的pH值范围，保 证工程菌的正常生长和代 谢。
溶氧量控制
根据工程菌的生长需求， 控制培养液中的溶氧量， 促进菌种的生长和稳定性 。
VS
工程菌的应用将有助于解决一些全球 性的问题，如抗生素耐药性、环境污 染等，对人类社会的可持续发展具有 重要意义。
工程菌传代稳定性方案
工程菌传代稳定性方案一、引言随着生物工程技术的不断发展，工程菌的传代稳定性成为一个重要的研究方向。
传代稳定性是指工程菌在持续传代过程中，其基因组和代谢特性不发生显著变化的能力。
传代稳定性的不稳定性会影响到工程菌在发酵、生产过程中的稳定性和可靠性，因此对于工程菌的传代稳定性进行深入研究具有重要的意义。
本文将对工程菌传代稳定性的影响因素及解决方案进行系统的论述。
二、工程菌传代稳定性影响因素1. 外源DNA插入点外源DNA在工程菌中的插入点会直接影响到工程菌的稳定性。
如果外源DNA插入到工程菌的基因组中的激活区域，可能会导致基因的过度表达或失活。
这种情况会对细胞的代谢特性产生明显影响，从而影响到工程菌的传代稳定性。
2. 外源DNA拷贝数外源DNA在工程菌中的拷贝数也是影响传代稳定性的一个重要因素。
外源DNA拷贝数过高可能会导致工程菌的基因组不稳定，进而影响到其传代稳定性。
而且外源DNA拷贝数过高还容易导致外源基因与细胞内自身基因发生重组，从而引起基因突变和适应性降低。
3. 环境条件环境条件对于工程菌的传代稳定性也有一定的影响。
例如，温度、pH值、营养条件等环境因素都可能影响到工程菌的代谢特性和遗传稳定性。
另外，在野外环境中，外源菌可能会受到生物环境因素的影响，加速了基因突变的发生。
三、工程菌传代稳定性解决方案1. 合理设计外源DNA插入点在进行工程菌的遗传改造时，应该注意选择适当的外源DNA插入点。
合理的外源DNA插入点可以降低外源DNA对细胞代谢特性的影响，减少基因的过度表达或失活等现象，从而提高工程菌的传代稳定性。
2. 精细调控外源DNA拷贝数在进行工程菌的遗传改造时，应该对外源DNA的拷贝数进行精细调控。
避免外源DNA拷贝数过高，减少基因突变和适应性降低的发生概率，从而提高工程菌的传代稳定性。
3. 优化环境条件在工程菌的发酵、生产过程中，应该优化环境条件，保持细胞的代谢稳定性。
保持适宜的温度、pH值和营养条件，可以减少外源菌受生物环境因素的影响，降低基因突变的发生概率。
基因工程菌的不稳定性
• 工程菌的培养一般分为2个阶段： （1）第一阶段----先使菌体生长至一定密度。 （2）第二阶段----开始诱导外源基因的表达。
• 由于第一阶段外源基因没有表达，减少了 丢失质粒的细菌的产生概率，也就增加了
工程菌的稳定性。
• 因为丢失质 粒的细菌在 含的抗生素 的培养基环 境中是不能 正常生长的。
（2）然后随机挑选100个菌落，接种到含有 抗生素标记的平板培养基上，培养10-12小 时，统计所长出的菌落数B；
（3）计算出B/A的比值。该比值能够反映出 质粒的稳定性。
• 因为丢失质粒的细菌在含的抗生素的培养 基环境中是不能正常生长的。
பைடு நூலகம்
二、提高质粒稳定性的方法
1、分阶段培养法 2、在培养基中加入抗生素，形成选择性压力 3、通过温度、PH值、培养基组分、溶解氧
• 含高拷贝质粒的工程菌产生不含质粒子代 菌的频率较低，但是大量外源质粒的存在 使含质粒菌的工程菌的比生长速率明显低 于不含质粒菌，而不含质粒菌一旦产生， 能较快地取代含质粒菌而成为优势菌，对 质粒的稳定性不利。
质粒稳定性的分析方法
（1）将工程菌培养液样品适当稀释，均匀涂 于不含抗生素标记的平板培养基上，培养 10-12小时，统计所长出的菌落数A；
• 所以可以通 过加入抗生 素来抑制质 粒丢失的细 菌的生长。
• 通过温度、PH值、培养基组分、溶解氧的 综合调节措施
• 通过以下方法可以提高质粒的稳定性。
（1）间歇送氧 （2）改变稀释速率
基因工程菌的不稳定性
一、质粒不稳定产生的原因 分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比 例不含质粒子代菌的现象。(常见) 结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或 碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变
关于基因工程菌的稳定性
关于基因工程菌的稳定性摘要：研究了定态与周期操作对基因工程酒精酵母质粒稳定性的影响,周期操作有利于提高底物的利用率并增强质粒的稳定性；发现了固定化重组菌高稳定性的原因，另外还讨论了诸多培养条件对基因工程菌稳定性的影响。
关键字：固定化；基因工程菌；质粒；稳定性；基因工程基因工程菌就是将目的基因导入细菌体内使其表达，产生所需要的蛋白的细菌成为基因工程菌。
基因工程菌在传代过程中常出现质粒不稳定的现象。
质粒不稳定可分为：分裂不稳定和结构不稳定。
分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。
结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。
1 常见分裂不稳定的两个因素：1.1 含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；1.2 这两种菌比数率差异的大小。
2 提高质粒稳定性的方法2.1 选择合适的宿主菌；2.2 选择合适的载体，适当增加质粒拷贝数；2.3 加入选择性压力；2.4 采用两阶段培养法；先使菌体生长至一定密度，再诱导外源基因的表达。
由于第一阶段外源基因未表达，减小了重组菌与质粒丢失菌的生长速率的差别，增加了质粒稳定性。
在培养基中加入抗菌素抑制质粒丢失菌的生长，提高质粒稳定性。
调控环境参数如温度、pH、培养基组分和溶解氧浓度。
有些含质粒菌对发酵环境的改变比不含质粒菌反应慢，间歇改变培养条件以改变两种菌比生长速率，可改善质粒稳定性。
通过间歇供氧和改变稀释数率，都可以提高质粒稳定性。
2.5 控制工程菌的培养条件；2.6 采用固定化培养基因工程技术是生物技术的核心和关键,已成功地表达了一系列与人类健康有关的重要多肽物质以及使多种氨基酸和抗生素增产,对人类社会生活产生了深远的影响。
基因工程菌中质粒稳定性问题是影响基因工程菌实现规模生产的一个重要因素,这种不稳定性主要表现为两种形式:一种是重组ＤＮＡ质粒的丢失,称为脱落性不稳定;另一种是质粒中的基因结构发生突变,称为结构性不稳定。
这两种不稳定都能使细胞失去生产能力。
基因工程菌中重组质粒的稳定性研究进展_肖硕
重组质粒的不稳定性， 是指重组菌在培养过程 中发生突变或丢失， 结果使重组菌失去了原有的表 型特征。依据重组质粒的变化本质， 质粒不稳定性 可 分 为 结 构 不 稳 定 性 、分 离 不 稳 定 性 。 质 粒 的 结 构 不 稳 定 主 要 是 由 于 ＤＮＡ 的 插 入 、 缺 失 或 重 排 等 引 起的不稳定， 使目的基因功能丢失， 但对质粒主要
Ａｂｓ ｔｒａ ｃｔ： Ｒ ｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｓ ｓｕｂｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ ｉｎ ｍｏｄｅｒｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｏｎｅ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐａｌ ｐａｒｔ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ｓｔｅａｄｙ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｉｓ ｔｈｅ ｈａｒｄ ｃｏｒｅ ｓｔｅｐ ａｎｄ ｆｉｎａｌ ａｉｍ． Ｐｌａｓｍｉｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｓ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｐｒｏｂｌｅｍ ｏｆ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｉｚｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｒｅｓｅａｒｃｈ． Ｔｈｅ ａｒｔｉｃｌｅ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ａｎｄ Ｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ ｉｔｓ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ， ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ， ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．
低 影 响 质 粒 稳 定 性 及 人 类 特 异 性 免 疫 反 应 的 降 低 ［７］。 ２．３ 调 控 突 变 、培 养 条 件 等
外 源 基 因 的 调 控 突 变 、培 养 条 件 及 质 粒 中 所 携 带 的 外 源 基 因 性 质 、重 组 菌 的 生 长 速 率 、外 源 基 因 的表达水平等因素都是影响质粒稳定性的因素， 有 些需要在质粒设计和构建时仔细考虑， 有些则与培 养过程有关。
微生物基因工程菌
具有高效性、可操作性和可预测 性，能够实现快速、准确地对微 生物进行定向改造。
微生物基因工程菌的应用领域
01
02
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生物医药领域
生产重组蛋白药物、抗体 药物、疫苗等，提高药物 质量和产量。
工业领域
生产高值化学品、生物燃 料、生物塑料等，提高生 产效率和降低成本。
环境治理领域
修复污染环境、降解有机 污染物等，改善环境质量 。
微生物基因工程菌
汇报人： 202X-12-21
目 录
• 微生物基因工程菌概述 • 微生物基因工程菌的构建与优化 • 微生物基因工程菌的发酵工艺研究 • 微生物基因工程菌的应用研究 • 微生物基因工程菌的未来发展趋势与挑战
01
微生物基因工程菌概述
定义与特点
定义
微生物基因工程菌是指通过基因 工程技术对微生物进行改造和优 化，以获得具有特定性状的工程 菌。
通过选择合适的培养基、控制 培养条件、优化基因型等方法 提高基因工程菌的稳定性和可
重复性。
03
微生物基因工程菌的发 酵工艺研究
发酵工艺流程及影响因素
菌种选育
选择适合表达目标产物 的菌种，进行遗传改良
和筛选。
种子制备
通过培养基优化、接种 量、接种时间等因素，
制备活力强的种子。
发酵培养基
选择适合菌种生长和目 标产物表达的培养基， 包括碳源、氮源、无机
在农业领域的应用
1 2
生物肥料研发
通过基因工程技术改造微生物，生产具有固氮、 解磷、解钾等功能的生物肥料，提高土壤肥力和 农作物产量。
植物生长调节剂研发
利用微生物基因工程菌生产植物生长调节剂，促 进植物生长和发育，提高农作物产量和品质。
生物工程制药之基因工程制药7
基因工程制药
3.3.2.2、互补DNA第一链的合成
mRNA的3’末端常含有一多聚腺苷酸序列，可用寡 聚脱氧胸苷酸为引物，在反转录酶的催化下，开始互补 DNA的合成。在合成反应体系中加入一种放射性标记的 dNTP，在反应中以及反应后可通过测定放射性标记的 dNTP掺入量，计算出互补DNA的合成效率，在凝胶电泳 后，进行放射自显影分析产物的分子大小，探索最佳反应 条件。
3、不致病、不产生内毒素；
4、发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态； 5、容易进行代谢调控； 6、容易进行DNA重组技术操作； 7、产物的产量、产率高，产物容易提取。
基因工程制药
3.4.1 宿主细胞的选择 宿主可分为两大类： 原核细胞—大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌； 真核细胞—酵母菌、丝状真菌、哺乳动物细胞。
基因工程制药
3.2基因工程药物生产的基本过程
•目的基因的克隆； •构建DNA重组体；
•将DNA重组体转入宿主菌构建工程菌；
•工程菌的发酵； •外源基因表达产物的分离纯化； •产品的检验等。
基因工程制药
3.2.1制备基因工程药物的一般程序：
获得目的基因 组建重组质粒 构建基因工程菌
培养工程菌
产物分离纯化 除菌过滤 半成品检定 成品检定 包装
生物制药工艺（基因工程制药）
基因工程技术就是将重组对象的目的基因 插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成 工程菌，实现遗传物质的重新组合，并使目的 基因在工程菌内进行复制和表达的技术。
基因工程制药
3.1基因工程技术生产药物的优点：
1、大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽，为临床 使用提供有效的保障； 2、可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生 化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围 3、可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质； 4、内源生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处， 可通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除； 5、可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。