定量PCR原理及PCR仪光学原理

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荧光定量pcr仪原理

荧光定量pcr仪原理
荧光定量PCR仪是一种用于测量PCR反应过程中荧光信号的仪器。

其原理基于PCR反应中的DNA扩增过程以及荧光染料的发射和检测。

PCR是一种通过使用DNA聚合酶酶和特定引物，在适当的温度下连续进行反复的DNA复制过程。

PCR反应通常包含三个基本步骤：变性（解旋DNA双链），退火（引物结合到模板DNA上），和延伸（DNA聚合酶沿引物扩增目标序列）。

此过程会导致目标DNA序列数量的指数性增加。

荧光定量PCR仪中，DNA的扩增过程通常伴随着一种荧光染料的加入。

这种荧光染料会在扩增过程中与新合成的DNA结合，产生荧光信号。

荧光定量PCR仪通过在PCR反应过程中记录荧光信号的强度来测量PCR反应的进程。

仪器中的光学系统会周期性地激发荧光信号，并通过检测器检测信号的强度。

荧光定量PCR仪可以记录每一个PCR循环的荧光信号，然后使用计算机软件分析这些信号的特征，例如峰值高度或面积。

通过与已知浓度的标准样品进行比较，可以利用荧光信号的强度来定量PCR反应中的目标DNA的初始浓度。

PCR原理及各类PCR仪

PCR原理及各类PCR仪PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链反应，是一种通过扩增DNA片段的技术。

PCR的基本原理是利用DNA聚合酶酶活性，在适当的条件下，通过DNA的复制和扩增来获得大量的DNA片段。

PCR技术已经广泛应用于医学、疾病诊断、基因工程和进化研究等领域。

PCR基本原理：PCR基本原理是在一系列温度变化的条件下，通过DNA引物与模板DNA相互结合和分离，并通过DNA聚合酶的作用逐步扩增产生大量目的DNA片段。

PCR步骤：1. 反应体系组成：反应体系包含DNA模板、引物（primer）、dNTP （脱氧核苷三磷酸）、Mg2+离子、缓冲液和DNA聚合酶等成分。

2. Denaturation（变性）：将反应体系加热至95°C，使得DNA双链变为两条单链DNA。

3. Annealing（退火）：将反应体系降温至适合引物与模板DNA结合的温度，引物与DNA模板互补序列结合形成DNA双链。

4. Extension（延伸）：将反应体系升温至DNA聚合酶最适温度，DNA聚合酶在引物的作用下，在引物上逐步延伸合成新的DNA链。

PCR类别：1.常规PCR：常规PCR是最简单和常用的PCR方法，可用于扩增目标DNA区域。

2.实时定量PCR（qPCR）：qPCR是一种测定PCR产物数量的方法，可以用于定量DNA或RNA浓度，以及检测基因表达水平。

3.逆转录PCR（RT-PCR）：RT-PCR将RNA反转录为cDNA，然后再进行PCR扩增，用于检测基因表达。

4.数字PCR（dPCR）：dPCR是使用分子方法计算DNA模板的浓度和扩增产物的绝对数量的技术。

5.巢式PCR：巢式PCR是在两步PCR中进行的，第一步是较高的退火温度安排，用于生成内部引物所需的DNA片段，第二步是较低的温度安排，用于增加PCR产物的数量。

6. 长PCR：长PCR用于扩增较大的DNA片段，通常超过5 kb，需要更长的扩增时间和更大的反应体积。

定量PCR原理及PCR仪光学原理

pcr放大与荧光放大的结合与dna结合时发光游离时不发光sybrgreeni染料法sybrgreeni是一种dna小沟结合染料在pcr过程中染料与dna结合发光聚合完成聚合开始sybrgreeni荧光染料熔解曲线dissociationcurve导数图谱原始数据只有染料法才需要做熔解曲线探针法没有必要成本低不需要探针适合初步筛查先用sybr筛查再用探针法精确定量少数关键样品熔解曲线鉴定pcr有无杂带引物二聚体无模板特异性不能分辨主带与杂带给出的是总信号不能做多重检测每孔只能检测一个目标基因灵敏度低适合于5000拷贝以上的基因定量多重荧光定量原理同一样本多对引物分别扩增不同的靶基因不同的探针识别不同的靶基因不同的探针标记不同的颜色
Quencher dye:
TAMRA (TaqMan 探针) Dark Quencher (MGB 探针)
Reference dye:
ROX
- passive internal reference for signal normalisation - allows relative (not absolute) fluorescence to be measured - critical for precision
Q
R
Q
AGGCCTTGAGAGATAT MGB
(minor groove binder)
R
提高探针Tm值
AGGCCTTGAQGAGATAT |||||||||||||||| GCTACACAGTCCGGAACTCTCTATAGCATCACAC
R 报告荧光 NFQ 无荧光淬灭基团 MGB 小沟结合物
27
3'
5'
典型的PCR分4个阶段
平台期线性增长期指数增长期基线期

pcr仪的工作原理

pcr仪的工作原理PCR（聚合酶链式反应）仪是一种用于进行聚合酶链式反应的设备，其工作原理涉及温度控制、荧光探测等关键技术。

以下是PCR仪的基本工作原理：1. 变温块：PCR仪中的关键部分是一个能够控制温度的变温块。

这个块通常由热电偶或其他传感器探测样品的温度，然后根据PCR程序的要求，通过电加热或制冷来快速而精确地调整温度。

2. PCR程序：PCR通常包括一系列的温度循环，每个循环中都有不同的温度阶段。

最基本的PCR程序包括以下三个阶段：-变性（Denaturation）：在较高的温度（通常为94-98摄氏度），DNA的双链会分离为两条单链。

-退火（Annealing）：在较低的温度（通常为50-65摄氏度），引物（PCR反应中的引物是DNA链上的短序列）结合到目标序列的末端，形成引物-模板DNA复合物。

-延伸（Extension）：在中间的温度（通常为72摄氏度），DNA聚合酶沿着模板DNA 合成新的DNA链。

这是PCR的关键步骤，因为它会在目标序列的每个引物结合点上生成新的DNA。

3. 荧光探测：PCR仪中通常使用荧光探测系统来检测PCR反应的进程。

这可以通过引物或DNA与荧光染料结合，形成荧光信号。

在PCR的每一个周期，荧光信号都会被记录下来，从而能够实时监测PCR反应的进行。

4. 热盖：PCR仪还配备了一个热盖，用于避免PCR反应中的蒸发，并确保反应混合物的均匀受热。

总体而言，PCR仪通过精确控制温度循环，使PCR反应在不同温度下的三个步骤（变性、退火、延伸）重复进行，从而在短时间内扩增DNA。

荧光探测系统实时监测PCR的进程，使其成为一种高效、快速、精确的DNA扩增技术。

实时荧光定量pcr的原理

实时荧光定量pcr的原理实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）是一种用于测定DNA或RNA在样本中的数量的技术。

它可以实时监测PCR反应过程中的荧光信号，从而实现对目标序列的定量分析。

实时荧光定量PCR在生物医学研究、临床诊断、环境监测等领域具有广泛的应用价值。

实时荧光定量PCR的原理基于PCR技术，但在PCR反应过程中引入了荧光探针，使得PCR过程中的荧光信号与目标序列的数量成正比。

下面将详细介绍实时荧光定量PCR的原理。

首先，实时荧光定量PCR需要使用一种荧光探针，通常有两种类型，双标记探针和DNA间接染料。

双标记探针是一种含有荧光素和荧光淬灭剂的探针，当它与目标序列结合时，荧光素和淬灭剂之间的距离被拉大，从而导致荧光信号的增加。

DNA间接染料则是一种无需特定探针的染料，它可以与PCR产物结合并发出荧光信号。

其次，实时荧光定量PCR需要使用一种特殊的PCR仪器，称为实时荧光定量PCR仪。

这种仪器可以在PCR反应过程中实时监测荧光信号的强度，并将其转化为目标序列的数量。

实时荧光定量PCR仪器通常配备了特定的软件，可以自动分析荧光信号的强度，并计算出目标序列的起始数量。

最后，实时荧光定量PCR的原理是基于荧光信号与目标序列数量成正比的关系。

在PCR反应过程中，荧光信号的强度随着PCR产物的增加而增加，从而可以通过监测荧光信号的动态变化来实现对目标序列的定量分析。

实时荧光定量PCR可以实现高灵敏度、高特异性和高准确性的目标序列定量分析，因此在科学研究和临床诊断中得到了广泛的应用。

总之，实时荧光定量PCR是一种基于PCR技术的定量分析方法，它利用荧光探针和实时监测荧光信号的PCR仪器，可以实现对DNA或RNA目标序列的高灵敏度、高特异性和高准确性的定量分析。

实时荧光定量PCR在基础科学研究、临床诊断和环境监测等领域具有广泛的应用前景。

实时荧光定量PCR仪原理和使用方法

实时荧光定量PCR仪原理和使用方法荧光定量PCR仪原理将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。

Ct值（Cyclethreshold，循环阈值）的含义为：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。

1. 荧光阈值（threshold）的设定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省（默认）设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold= 10*SDcycle 3-152. Ct值与起始模板的关系每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，公式如下。

Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)n为扩增反应的循环次数，X0为初始模板量，Ex为扩增效率，N为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。

起始拷贝数越多，Ct值越小。

利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。

因此，只要获得未知样品的Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

实时荧光定量PCR所使用的荧光物质可分为两种：荧光探针和荧光染料。

现将其原理简述如下：1.TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

96孔pcr仪光学原理

96孔pcr仪光学原理：
96孔PCR仪的光学原理主要包括以下几个方面：
1.光源：PCR仪通常使用特定波长的光源，如LED或激光，以提供足够的光能量来激
发荧光染料或标记物。

2.滤光片：滤光片用于过滤掉不需要的光波长，只允许特定波长的光通过。

这样可以
确保只测量所需的荧光信号，减少背景干扰。

3.检测器：检测器负责捕捉荧光信号。

它使用光电转换元件（如光电倍增管或光电二
极管）将荧光信号转换为电信号，以便后续的信号处理和测量。

4.光学模块：光学模块是PCR仪中负责控制光源、滤光片和检测器之间的光路设计的
部分。

它确保荧光信号能够准确地进入检测器，同时避免光路中的干扰和交叉污染。

5.实时监测：在PCR扩增过程中，荧光染料或标记物会随着DNA的扩增而释放出荧光
信号。

通过实时监测这些荧光信号的强度，可以确定DNA的扩增情况。

PCR仪通过软件算法将这些荧光信号转换为可读的数据，如CT值或荧光阈值，以反映样品中DNA的浓度和扩增情况。

定量PCR基本原理及方法

✓ Ct值与起始模板的关系
logN=log N0 +nlogE n=Ct 每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。利用已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线，根据未知样品的Ct值，即可计算出该样品的起始拷贝数。
Y轴—Ct值
6
X—起始拷贝数的对数
✓ 绝对定量——未知浓度的样品与标准曲线相比较
Excitation
R
3’
11
3’
3’
5’
QQQ
Q
5’
分子信标（Molecular Beacon Probe）
R ExcitatEiomnission Q
Excitation
12
荧光共振能量传递（FRET Probe）
Oligo 1: Fluorescein Excitation
Transfer
野生型突变型杂合型
21
利用熔解曲线检测基因突变 FRET探针进行熔解曲线分析确定基因型
FRET探针与模板结合时，因共振能量的传递而信号增强，而当在Tm 值时， FRET探针与PCR产物分开，荧光信号减弱。通过实时捕捉到的PCR产物在熔解过程中荧光信号的变化，得到PCR产物的熔解曲线。因为发生基因突变的PCR产物有特定的Tm 值，通过测定探针与PCR产物分开时的熔解温度Tm值，就能确定样品的基因型。
8
内掺式染料 SYBR-Green I
Excitation
5’
3’
SG
Emission
SG
SG
3’
SG
5’
SG
9
内掺式染料 SYBR-Green I
Excitation
SG
5’
3’

定量PCR原理及PCR仪光学原理

定量PCR原理及PCR仪光学原理1.荧光染料法：在PCR反应混合液中添加荧光染料，该染料只与双链PCR产物结合并产生荧光信号，因此只有在扩增过程中产生双链PCR产物时才会有荧光发光。

PCR反应过程中，荧光信号会随着扩增产物的积累而增加。

可以通过荧光强度与PCR循环数的关系来计算出初始模板的初始数量。

2.探针法：在PCR反应中加入探针，该探针通常包含两个部分：荧光染料基团和辅助基团。

辅助基团可以竞争性结合PCR产物，从而导致荧光信号减弱或熄灭。

当PCR过程中产生PCR产物时，探针会被酶水解并释放出荧光染料基团，从而导致荧光信号增强。

通过测量荧光信号的变化，可以测量PCR 产物的数量。

PCR仪光学原理：PCR仪是用于定量PCR实验的专用仪器，它具有特殊的光学系统来测量荧光信号的强度。

PCR仪的光学原理通常基于光衰减原理。

PCR仪中使用的荧光染料或探针一般会发出荧光信号，该信号在PCR过程中会通过光学系统进行收集和测量。

PCR仪的光学系统一般包括以下几个组件：1.光源：PCR仪通常使用特定波长的光源来激发荧光信号的发生。

常见的光源有LED或氙气灯。

2.滤光片：滤光片用于选择特定波长的荧光信号传递到探测器，并阻挡其他波长。

滤光片通常由凹凸面组成，以控制特定光线的传播方向和传播方式。

3.检测器：检测器用于测量荧光信号的强度。

常见的检测器有光电二极管（photodiodes）或光电倍增管（photomultiplier tubes），它们可以将荧光信号转化为电信号。

4.放大器和转换器：放大器用于增强电信号的强度，并将其转换为数字信号。

5.软件和分析系统：PCR仪通常配备专门的软件和分析系统，用于处理和分析测量的数据。

这些软件可以计算出初始模板的初始数量，并生成相应的曲线和图表。

总结：定量PCR是一种用于测量DNA或RNA在样本中的定量浓度的技术，依赖于PCR过程中的荧光信号的监测。

荧光染料法和探针法是常用的定量PCR方法。

定量PCR基本原理

定量PCR基本原理基本原理:定量PCR通过引入一种用于测量PCR反应进程的探针或染料来获取结果。

这些探针或染料具有与目标序列相互作用的特性。

当目标序列被放大并到达一定浓度时，探针或染料与之结合，产生荧光信号。

这个荧光信号的强度与目标序列的数量成正比。

下面是定量PCR的主要步骤:1.反应物准备：反应物主要包括样本DNA或RNA、引物和探针(如果使用)等。

引物是位于目标序列两侧的短DNA寡核苷酸片段，用于定向放大DNA。

探针是一种染料与荧光标记分子结合的DNA片段，用于鉴别和定量检测目标序列。

2.反应体系的配置：根据反应物的需求，将引物、探针、双链DNA模板、dNTPs、酶和缓冲液等组合在一起，形成反应混合物。

3.PCR反应：将反应混合物置于PCR仪中，进行多轮的反应循环。

每一个反应循环包括三个步骤：变性、退火和延伸。

-变性：在高温条件下，双链DNA被解开成两条单链DNA。

-退火：在较低温度下，引物与目标序列的互补部分结合。

-延伸：在适当酶的作用下，引物延伸成为与目标序列相互补的DNA 链。

4.目标序列的定量测量：反应循环完成后，可以通过测量荧光信号的强度来定量PCR反应中的目标序列。

对于使用探针的定量PCR，荧光信号强度与目标序列的拷贝数呈正相关。

探针通常在引物的5'端带有一种荧光染料，并在3'端带有另一种荧光染料。

当探针与目标序列结合时，这两种染料距离变近，导致荧光共振能量转移(FRET)。

这种能量转移的效应会导致双荧光染料之间的荧光信号发生变化，从而提供了目标序列的相对丰度的定量信息。

需要注意的是，为了准确测量目标序列的拷贝数，还需要使用内参基因或标准曲线。

内参基因是一个稳定的基因，它在样本中的拷贝数相对稳定，可以作为PCR反应的参考。

标准曲线是一系列含有已知拷贝数的DNA 标准品，它们在PCR反应中被共同放大，用来建立目标序列拷贝数和荧光信号强度之间的关系。

综上所述，定量PCR是一种基于PCR技术的分子生物学方法，通过测量荧光信号的强度来定量PCR反应中的目标序列。

PCR仪原理及其应用

多组学分析
03
结合多种技术手段，实现多组学（如基因组、转录组和蛋白质
组）分析，为科学研究提供更全面的数据。
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准备阶段
01
02
03
仪器准备
确保PCR仪处于良好工作状态，检查仪器是否清洁，确保没有残留物。
试剂准备
根据实验需求，准备足够的PCR反应试剂，包括 DNA模板、引物、dNTPs 和Taq酶等。
样品准备
将待检测的样品进行处理，提取出所需的DNA片段，并进行纯化。
实验阶段
01
PCR循环
按照设定的程序，在PCR仪中进行DNA扩增。通常包括变性、退火、延
pcr仪原理及其应用
目录
• pcr仪原理 • pcr仪的应用 • pcr仪操作流程 • pcr仪的优缺点 • pcr仪的发展趋势与展望
01 pcr仪原理
pcr技术概述
聚合酶链式反应（PCR）
一种在体外快速、特异地扩增DNA片段的分子生物学技术。
发明者
凯利·穆利斯（Kary Mullis）于1983年发明。
通过特定的引物和酶，PCR技术能够特异性地扩增目标DNA或RNA片段，避免非特异性扩增，提高检测准确性。
可重复性
自动化
PCR技术具有很高的可重复性，使得实验结果更加可靠，并且可以进行大规模的实验操作。
现代PCR仪通常都具有很高的自动化程度，能够快速、准确地完成实验操作，减少人为误差。
缺点
依据。
其他领域应用
环境监测与污染控制
食品工业
PCR仪可用于检测环境中的微生物和污染物，为环境监测和污染控制提供技术支持。

定量pcr的原理和应用

定量PCR的原理和应用一、定量PCR的概述定量PCR（Quantitative PCR，简称qPCR）是一种用于精确测定DNA或RNA 在样本中的相对或绝对数量的技术。

相比传统的定性PCR，定量PCR能提供更加准确和可靠的分子生物学定量分析结果。

本文将介绍定量PCR的原理、方法和应用。

二、定量PCR的原理定量PCR基于传统PCR技术，通过测量PCR产物的实时累积情况来确定起始模板的数量。

其主要原理包括：1.设计引物和探针：定量PCR需要使用特异性引物和荧光探针来扩增和检测目标序列，引物的设计应考虑碱基配对的特异性和温度互补性。

2.实时检测：在PCR反应过程中，荧光探针与目标序列发生特异性结合，形成荧光信号。

通过实时监测PCR产物的荧光信号强度，可以确定目标序列的起始数量。

3.标准曲线法：定量PCR通常需要构建标准曲线来确定目标序列的起始数量。

标准曲线是由一系列已知起始数量的标准品制备而成，根据标准曲线上的荧光信号强度和已知起始数量的关系，可以推断出未知样本中目标序列的起始数量。

三、定量PCR的步骤定量PCR通常包括以下步骤：1.样本处理：将待测样本中的DNA或RNA提取和纯化，以获得高质量的核酸模板。

2.引物和探针设计：根据目标序列的特异性和相关基因信息，设计引物和荧光探针。

3.PCR反应体系的配置：根据实验需求和PCR仪器要求，配置PCR反应混合液，包括引物、荧光探针、DNA模板和PCR反应缓冲液等。

4.PCR反应条件的设置：确定PCR反应的温度和时间参数，包括退火温度、延伸时间和扩增周期数等。

5.实时荧光监测：将PCR反应体系加载到实时荧光PCR仪中，监测PCR反应过程中荧光信号的强度变化。

6.数据分析：利用实时荧光PCR仪软件对荧光信号数据进行分析，绘制标准曲线和计算目标序列的起始数量。

四、定量PCR的应用定量PCR在生物学研究和临床诊断中具有广泛的应用。

以下是定量PCR的主要应用领域：1.基因表达分析：通过定量PCR可以测定不同组织或细胞中特定基因的表达水平，揭示基因在生物学过程中的功能和调控机制。

pcr 仪工作原理

pcr 仪工作原理PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种重复扩增DNA序列的技术，在医学、生物学和犯罪学等领域被广泛应用。

PCR仪是PCR技术的关键设备，它基于热循环反应原理，通过在不同温度下的一系列扩增步骤，迅速产生大量目标DNA。

下面将详细介绍PCR仪的工作原理。

PCR仪主要由热循环装置、温度控制系统、检测装置和数据采集与分析系统组成。

热循环装置通常由Peltier元件构成，能够迅速调整反应体系的温度。

温度控制系统利用传感器监测反应体系的温度，并对Peltier元件进行精确的温度调节。

PCR反应按照一定的温度程序进行，通常包括三个主要步骤：变性、退火和延伸。

在变性步骤中，PCR反应管中的目标DNA被替代为两个单链DNA，需要高温（95°C）来使DNA双链断裂。

在退火步骤中，反应管中的引物结合到目标DNA的两个单链上，温度被降低到适宜引物结合的温度（一般为50-65°C）。

在延伸步骤中，温度被升高到恶劣范围，使DNA聚合酶酶活化，并沿着引物从3'末端向5'末端逐渐合成新的DNA链。

PCR仪通过精确控制反应体系的温度，在一个PCR循环内完成上述三个步骤。

循环的次数决定了扩增DNA的量，并且可以进行数十到数百次。

每次循环都会使目标序列的数量成倍增加，从而使其扩增到检测或研究所需的程度。

PCR仪还配备了光学系统，用于实时监测PCR反应的进展。

在PCR反应中，DNA的含量与荧光信号的强度相关联。

检测装置通过激发和检测荧光信号，可以定量检测PCR反应的结果，并即时输出结果。

数据采集与分析系统则负责收集、处理和分析PCR反应过程中产生的数据，如荧光信号强度、时间和温度等。

根据系统预设的阈值和算法，可以实现结果的定量分析、目标序列的定位和检测。

综上所述，PCR仪通过精确控制温度和光学检测系统，将目标DNA在体外进行大规模的扩增。

其工作原理基于热循环反应，通过不同温度下的一系列扩增步骤，使目标DNA得以迅速扩增。

PCR仪的原理和使用

PCR仪的原理和使用PCR（聚合酶链反应）仪是一种用于扩增和复制DNA序列的实验仪器。

PCR反应是一种体外的快速扩增DNA序列的方法，其原理是在适当的反应条件下，使用DNA聚合酶及其引物以及模板DNA，通过反复进行三步循环的温度变化（变性、退火、扩增），最终可以快速扩增目标DNA。

PCR仪是为了实现PCR反应而专门设计的仪器，它可以精确控制反应体系的温度和时间。

PCR仪的主要组成部分包括温控模块、光学检测模块、控制模块和显示模块。

温控模块负责精确控制反应体系的温度，通常由Peltier元件和温控系统组成。

光学检测模块用于检测PCR反应过程中产生的荧光信号，通常采用光电二极管或光电倍增管等光电检测器件进行信号检测。

控制模块用于控制PCR反应的参数，如温度、时间等，通常由控制电路和软件程序组成。

显示模块用于实时显示PCR反应的结果，通常采用液晶显示屏或数码显示器。

1.准备反应体系：准备PCR反应所需的试剂和试管，如模板DNA、引物、dNTPs等。

根据实验需求确定反应体系的配比和容量。

2.设定PCR程序：在PCR仪的控制模块中设定PCR反应的程序，包括变性温度、变性时间、退火温度、退火时间和扩增温度等参数。

根据模板DNA的碱基序列和引物设计合理的PCR程序。

3.装载反应体系：将预先配制好的PCR反应体系装入PCR管或PCR片中，确保反应体系的充分混匀和无气泡。

4.温度调节：将装载好的PCR反应体系放入PCR仪中，并通过温控模块将温度快速升至设定的变性温度，保持一段时间进行DNA的变性。

5.引物退火：将温度降至设定的退火温度，以使引物与模板DNA结合。

通常，引物的退火温度低于模板DNA的熔解温度，以保证引物与DNA的特异性结合。

6.DNA扩增：将温度升至设定的扩增温度，此时DNA聚合酶开始工作，引物在模板DNA上进行扩增反应。

在每个PCR循环中，DNA的复制数量将翻倍。

7.反复循环：根据设定的PCR程序，反复进行温度变化循环，以使DNA的扩增倍数不断增加。

定量pcr的技术原理

定量pcr的技术原理定量PCR（quantitative polymerase chain reaction）是一种用于DNA分子的定量分析技术。

它通过特定的引物和荧光探针来放大目标DNA序列，并结合荧光信号的强弱来确定初始DNA的数量。

其技术原理基于PCR（聚合酶链式反应）的基本步骤。

PCR 由三个主要步骤组成：变性、退火和延伸。

在定量PCR中，这些步骤与传统PCR相似，但引入了一种特殊荧光探针。

首先，通过热变性步骤将待测DNA样本的双链DNA分离为两个单链DNA。

接下来，将温度降低，使引物（由两个短DNA片段组成）与待测DNA序列上的特定区域结合。

这称为退火步骤，可选择性地将引物定位到目标序列。

然后，引物承担引导延伸的作用。

在延伸步骤中，通过添加DNA聚合酶酶和适当的碱基（dNTPs），引物沿待测DNA序列定向添加互补的碱基。

这样，每个引物在反应中逐渐延伸，生成新的DNA链，并将之前分离的双链DNA恢复成双链状态。

在定量PCR中的一个关键步骤是引入荧光探针。

这些荧光探针具有一个荧光染料和一个荧光猝灭器，其能力在其未结合目标序列时发出荧光信号。

在PCR过程中，当引物逐渐与目标序列结合并延伸时，荧光探针能特异性地与目标序列结合，导致荧光染料和荧光猝灭器之间的距离缩短，猝灭效应减弱，从而大大增加荧光信号的强度。

通过PCR反应进行若干循环，每一个循环都会使目标DNA序列的数量呈指数级增加，同时也会使荧光信号不断增强。

定量PCR的关键是要确定荧光信号的阈值，也就是荧光信号强度达到一个特定的临界值，被定义为测定阈值（Ct，Cycle threshold）。

Ct值与最初待测DNA的数量成反比，因此，Ct值越小，待测DNA的初始数量越多。

最后，通过与标准曲线比较Ct值，可以通过插值法确定待测样本中目标DNA的初始浓度。

定量PCR是一种快速、高效、灵敏且准确的DNA定量分析方法，广泛应用于基因表达研究、疾病诊断、病原体检测等领域。

定量PCR基本原理及方法-PPT精品文档

原理：根据扩增产物的量计数反应物中原始分子数，即： lnx=lnY-n×ln(1+Ev)=lnY - b (b为常数) 2. 实时检测法定量原理前提：在最佳实验、相同Ev以、扩增产物量相同原理：反应物中原始分子数（X）与其所需要的扩增循环次数（n）
成反比，由此计算出标本中靶分子的准确含量，即：
LgX=LgY–n×Lg(1+Ev)=b - n×a (a、b为常数)
Ampliflour Probe，LUX
定量分析
基因型分析
利用扩增信号的种类来分型 —— Taqman
根据熔解曲线的不同来分型 —— FRET, Molecular Beacon LC Green
利用扩增信号的种类来分型双Taqman探针法检测野生型和突变型
在基因型分析中，可采用两种不同的Taqman探针（分别针对野生型和突变型)，即一个突变型探针以一种荧光素（Flr）标记，而野生型探针则用不同的荧光物（Tet）标记。如果只有一种信号被扩增出来，则样本为对应的基因型（野生型或突变型）的纯合子；如二者都被有效地扩增出来，则样本为杂合型。
后来用与双链DNA有更强结合力的SYBR Green I取代EB
荧光定量PCR的定量原理
PCR的理论方程： Y=x×(1+ Ev)n Real-time Chemistries
Y：扩增物数量； X ：起始模板数量；Ev：扩增效率；n：扩增循环数
1. 终点法定量原理
前提：在最佳实验、循环次数n一定、Ev相同
定量PCR基本原理及方法
基因有限公司黄妤
内容
一．荧光定量PCR基本原理二．荧光定量PCR标记方法三．荧光定量PCR不同方法学的应用
一．荧光定量PCR基本原理

荧光定量PCR、数字PCR技术与光学原理解决方案

荧光定量PCR、数字PCR技术与光学原理解决方案一、PCR分子诊断技术在全球医疗器械行业中，体外诊断是占比最高的细分领域之一，根据诊断原理的不同，体外诊断产品分为分子诊断、免疫诊断、生化诊断等多种类型。

其中，分子诊断的灵敏度、特异性、准确性等均较为突出，尤其是在新冠肺炎疫情全球蔓延的大背景下，以PCR为代表的分子诊断技术得到了加速发展。

PCR，即聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）的英文缩写，是一种以DNA 双链复制原理为基础，对特定核酸样本进行体外扩增的生物技术，能够将微量的核酸样本迅速拷贝至几百万倍，便于后续的分析研究。

该技术源起于20世纪70、80年代，经过几十年的发展，经历了初代传统PCR、第二代荧光定量PCR和第三代数字PCR的演变，在医疗筛查诊断、生命科学基础研究、法医分析鉴定及食品卫生和环境检测等方面得到广泛应用。

1.荧光定量PCR实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）技术，简称qPCR，是在PCR反应体系中加入荧光物质（荧光染料或荧光标记的特异性探针），利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

与普通PCR相比，实时荧光定量PCR技术是一次由定性技术向定量技术的飞跃。

运用该项技术，可以对DNA、RNA样品进行相对定量、定量和定性分析。

（图：荧光定量PCR实验过程）2.数字PCR数字PCR即Digital PCR（dPCR)，它是一种核酸分子绝对定量技术。

相较于qPCR，数字PCR可让你能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。

PCR实际上是一个在模板DNA、引物（模板片段两端的已知序列）和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA 聚合酶依赖的酶促合成反应，扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合。

（图：数字PCR技术原理）根据微反应单元的不同形式，数字PCR产品可分为微板式、微滴式和芯片式等。

数字pcr仪的工作原理(一)

数字pcr仪的工作原理(一)数字PCR仪的工作原理1. 引言数字PCR仪是一种常用的实验室设备，用于在遗传学、医学和生物学研究中进行核酸的扩增和定量。

它利用PCR（聚合酶链式反应）技术，通过多轮循环使目标DNA段迅速复制，从而实现定量分析和检测。

2. PCR技术简介PCR技术是一种体外的DNA复制方法，它在体系中同时存在DNA模板、引物、聚合酶和四种核苷酸，通过不断循环加热、退火和延伸的过程，实现DNA的复制和扩增。

PCR反应通常包含三个步骤：变性、退火和延伸。

变性PCR反应开始时，PCR仪升温至95°C，高温使DNA的双链解开，反应体系中的DNA变为单链。

退火退火过程中，PCR仪温度降至50-65°C，引物与模板DNA的互补序列结合，形成引物-模板复合物。

延伸延伸阶段的温度通常设定在60-75°C，此时聚合酶开始在引物的引导下合成新的DNA链，从引物的末端延伸，与模板DNA互补配对。

3. 数字PCR仪的工作原理数字PCR仪通过利用光学检测技术，实现对PCR反应过程的实时监测和分析，从而得到准确的定量结果。

光学检测数字PCR仪主要利用荧光染料对PCR反应过程进行实时检测。

在PCR反应中，聚合酶合成的DNA链会与荧光探针结合，形成荧光复合物。

数字PCR仪通过特定的光源激发荧光复合物，然后测量荧光信号的强度，以此来确定PCR产物的数量。

分析算法数字PCR仪通常配备有强大的数据分析算法，这些算法可以根据荧光信号的强度、荧光曲线的形状和PCR循环的数目等信息，实现PCR 产物的定量分析。

这些算法通过与事先建立的标准曲线进行比较，从而计算出样品中目标DNA的初始浓度。

4. 数字PCR的优势相比传统PCR方法，数字PCR具有一系列的优势：•高灵敏度：数字PCR能够检测样品中非常低浓度的目标DNA。

•高精确性：数字PCR通过实时监测荧光信号，减少了人为误差，并提供更准确的定量结果。

pcr仪的原理

pcr仪的原理PCR仪的原理PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，它能够在体外扩增DNA片段。

PCR仪是进行PCR实验的关键设备，它的原理和工作方式对PCR反应的成功与否起着至关重要的作用。

PCR仪的主要原理是通过循环性温度变化来促使DNA的复制。

PCR反应需要三个关键组分：DNA模板、引物和聚合酶。

首先，DNA模板是需要扩增的DNA片段，引物是两段碱基序列，它们与DNA模板的两端碱基序列互补。

聚合酶是一种酶类，能够识别引物并在其基础上合成DNA链。

PCR仪的工作过程一般分为三个步骤：变性、退火和延伸。

首先，在变性阶段，PCR仪会将PCR反应体系加热至94-98℃，使其变性，即将DNA的双链解开，形成两条单链。

接下来，在退火阶段，PCR 仪会将温度降低至55-65℃，使引物与DNA模板的互补碱基序列结合成双链。

最后，在延伸阶段，PCR仪会将温度升高至72℃，使聚合酶在引物的基础上合成新的DNA链。

这个过程会不断循环，每个循环会产生两倍数量的DNA分子，从而实现DNA的扩增。

PCR仪在实验中的温度控制是非常关键的。

它能够精确地控制反应体系的温度，并在每个阶段保持恰当的时间。

这种精确的温度控制有助于提高PCR反应的效率和特异性。

一般来说，PCR仪会通过热电偶或光学传感器来监测反应体系的温度，并通过加热或冷却系统来控制温度。

PCR仪还具有其他一些重要的功能和特点。

例如，PCR仪通常会配备一个独立的热盖，用于保护PCR反应体系免受外界的污染和蒸发。

此外，PCR仪还可以存储和执行多个PCR反应程序，以满足不同实验的需求。

另外，PCR仪还可以配备一个显示屏，用于实时显示PCR 反应的参数和结果。

PCR仪是一种基于循环性温度变化的设备，用于扩增DNA片段。

它通过精确地控制反应体系的温度，使DNA模板在循环的过程中得以复制。

PCR仪在实验中起着至关重要的作用，为分子生物学研究和诊断提供了强大的工具。