第15章 液相色谱法2015.12
液相色谱法
现代高效液相色谱仪一般都具备贮液器、高压 泵、梯度洗脱装置（用双泵）、进样器、色谱柱、 检测器、恒温器、记录仪等主要部件。其结构框 图如图9—1所示。 图9——1高效液相色谱仪的结构
9. 1.1 贮液器(流动相贮罐)
分析用高效液相色谱仪的流动相贮罐，常使用1L 的锥形瓶加一个电磁搅拌器，在连接到泵入口处的管 线上时要加一个过滤器（例如2μm的过滤芯），以防 止溶剂中 的固体颗粒进人泵内。为了使贮罐中的溶剂 便于脱气，溶剂罐中常需要配备加热器、搅拌器和抽 真空及吹入惰性气体的装置。在进行分析工作前，必 须脱去流动相中的溶解气体，尤其是用水和其它极性 溶剂做流动相时，脱气更为重要（特别是在梯度洗脱 时）。为了防止在检测器中产生气泡，可在装流动相 贮罐中于强烈搅拌下抽真空几分钟，加热可提高抽气 效率。不管用什么方法脱气，以不使流动相混合物浓 度发生变化为原则。为了减少流动相和固定相可能发 生的反应，还必须除去流动相中的氧。用氦气吹扫流 动相是除去其中痕量氧气的有效手段。脱气后的流动 相液面上应保持有惰性气体，这样可以防止氧再次溶 解到流动相中，还可以避免易燃溶剂蒸气着火。
该检测器作为紫外 -可见光检测器的发展, 在液相色谱峰纯度检验和色谱峰定性方面有 很广泛的应用，它是以光电二极管阵列（或 CCD阵列，硅靶摄像管等）作为检测元件的 UV-VIS检测器。但在检测器结构与光路安排 上与紫外-可见光检测器有很大区别,光电二极 管阵列 检测器是由光源发出光线通过样品池, 然后由一系列分光技术,使所有波长的光在检 测端同时被检测,得到时间、光强度和波长的 三维谱图。而紫外-可见光检测器 是由光源发 出光线经过滤光片、棱镜或光栅分光,使单色 光进入样品池,再由光电倍增管检测。两检测 器结构中样品池与分光原件位置相反。
2015年版药典高效液相色谱法、质谱法
正相色谱系统的流动相常用两种或两种以上的有机溶剂，如二氯甲烷和正己烷等。
品种正文项下规定的条件除填充剂种类、流动相组分、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱内径与长度、填充剂粒径、流动相流速、流动相组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等，均可适当改变，以达到系统适用性试验的要求。
调整流动相组分比例时，当小比例组分的百分比例X小于等于33%时，允许改变范围为0.7X～1.3X；当X大于33%时，允许改变范围为X-10%～X+10%。
若需使用小粒径（约2μm）填充剂，输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配；如有必要，色谱条件也应作适当的调整。
当对其测定结果产生争议时，应以品种项下规定的色谱条件的测定结果为准。
当必须使用特定牌号的色谱柱方能满足分离要求时，可在该品种正文项下注明。
2.系统适用性试验色谱系统的适用性试验通常包括理论板数、分离度、灵敏度、拖尾因子和重复性等五个参数。
按各品种正文项下要求对色谱系统进行适用性试验，即用规定的对照品溶液或系统适用性试验溶液在规定的色谱系统进行试验，必要时，可对色谱系统进行适当调整，以符合要求。
（1）色谱柱的理论板数（n）用于评价色谱柱的分离效能。
由于不同物质在同一色谱柱上的色谱行为不同，采用理论板数作为衡量色谱柱效能的指标时，应指明测定物质，一般为待测物质或内标物质的理论板数。
在规定的色谱条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分色谱峰或内标物质色谱峰的保留时间t R和峰宽（W）或半高峰宽（W h/2），按n=16（t R/W）2或 n=5.54（t R/W h/2）2计算色谱柱的理论板数。
t R、W、W h/2可用时间或长度计（下同），但应取相同单位。
（2）分离度（R）用于评价待测物质与被分离物质之间的分离程度，是衡量色谱系统分离效能的关键指标。
可以通过测定待测物质与已知杂质的分离度，也可以通过测定待测物质与某一指标性成分（内标物质或其他难分离物质）的分离度，或将供试品或对照品用适当的方法降解，通过测定待测物质与某一降解产物的分离度，对色谱系统分离效能进行评价与调整。
《液相色谱分析法》课件
,
汇报人：
目录
01 添 加 目 录 项 标 题 03 液 相 色 谱 分 析 法 的
技术原理
05 液 相 色 谱 分 析 法 的 优缺点
02 液 相 色 谱 分 析 法 的 概述
04 液 相 色 谱 分 析 法 的 应用实例
06
液相色谱分析法的 发展趋势和未来展
望
Part One
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数据处理：对检测到的信号 进行处理，得到样品的色谱 图和定量结果
结果分析：根据色谱图和定 量结果，对样品进行分析和 鉴定
Part Four
液相色谱分析法的 应用实例
在药物分析中的应用
药物稳定性研究：研究药物 在储存过程中的稳定性
药物成分分析：分析药物中 的有效成分、杂质等
药物质量控制：控制药物的 质量，确保药物的安全性和
液相色谱分析法的研究热点和前沿技术
超高效液相色谱技术：提高分离效率，降 低检测限
生物样品分析：应用于生物医药、食品安 全等领域
质谱联用技术：提高检测灵敏度和准确性
环境样品分析：应用于环境监测、污染治 理等领域
微流控芯片技术：实现样品的微型化和快 速分析
智能化、自动化技术：提高分析效率，降 低人工操作误差
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核磁共振检测器：利用核磁共振原理，检测样品中的核磁共振信号，用于结构分析和定量分析
液相色谱分析法的操作流程
样品制备：将样品进行适当 的处理，如稀释、过滤等
样品注入：将样品注入到色 谱柱中
色谱分离：样品在色谱柱 中分离，根据不同组分的 性质和亲和力进行分离
检测器检测：样品经过检 测器时，检测器对样品进 行检测，得到相应的信号பைடு நூலகம்
液相色谱与超高效液相色谱方法如何转换与验证
1.流速的转换
不改变线速度，流速与柱内径的平方成比例，速从 4.6 x 150 mm （5µm）到 2.1 x 50 mm(1.7 µm )，几何缩放流速的计算：
上述为方法转换时推荐流速，实际使用时可根据系统压力、保留时间以 及常用流速范围（如1.7 µm，2.1 mm内径色谱柱的常用流速范围为： 0.3～0.7ml/min ）进行调整。
24
应用实例1-阿托伐他汀有关物质检查
图1、阿托伐他汀钙有关物质HPLC图(进样20µL) 50分钟
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
图2、阿托伐他汀钙有关物质UPLC图(进样2µL)
17分钟
25
表1、阿托伐他汀钙有关物质HPLC梯度洗脱程序
时间（min） 0 25 35 40
40.01 50
流动相A（%） 48 48 10 0 48 48
75ml/针 75ml*18针 (1350ml)
6.8ml/针 6.8ml*18针
(122ml)
形成废液
＞3240ml
＞1350ml
＞122ml
消耗能源
7倍
3倍
1
假设：1000个样品一个月内必须完成。如果使用5μm，4.6X150mm色谱柱， 流速1.4ml/min，45min运行时间的方法，需要3套LC系统，14天来完成这个 实验。但是如果使用1.7μm，2.1X100mm色谱柱，流速0.4ml/min，11min运 行时间的方法，则只需要1台LC系统，10天就能完成。
灵敏度 ↑ 3X
(Increased optimal flow
(Peak height increases as peak width
rate & shorter column)
《液相色谱技术》课件
生态毒理学研究
液相色谱技术可以用于研究环境污染物对生物体的毒理学效应，有助于了解环境污染对生态系统的危害。
液相色谱技术的未来发展与挑战
高效液相色谱法（HPLC）
HPLC是液相色谱技术中的一种，具有高分离效能、高灵敏度、高选择性等优点，被广泛应用于生物医药、环境监测、食品安全等领域。随着技术的不断发展，HPLC的分离柱、检测器等关键部件也在不断改进，提高了分离效果和检测灵敏度。
智能化与自动化：随着机器人技术和自动化控制技术的发展，液相色谱技术的操作将更加智能化和自动化。未来的液相色谱仪将更加便捷、高效，能够实现自动化进样、自动优化分离条件等功能，大大提高分析效率。
感谢观看
THANKS
流动相的准备与更换
根据实验要求，准备好适量的流动相，并定期更换以保证实验结果的准确性。
定期清洗进样器、色谱柱和检测器，保持仪器表面清洁。
日常保养
定期校准
常见故障排除
对仪器进行定期校准，确保检测结果的准确性。
遇到问题时，应先检查电源、管线连接等基本情况，再根据仪器手册排查故障。
03
02
01
液相色谱技术的实验设计
色谱柱
检测色谱柱流出的组分，并将其转化为电信号，便于记录和检测。
检测器
用于采集、处理、分析和存储色谱数据。
数据处理系统
数据处理与分析
采集色谱数据，进行峰识别、定量和合适的流速、检测波长等参数，开始色谱分离。
进样
将样品注入进样器，设定进样量，启动进样程序。
准备工作
检查仪器是否正常，准备好流动相、色谱柱和样品。
样品前处理的挑战：液相色谱技术对于样品的要求较高，需要进行适当的前处理以去除杂质、提高分离效果。目前常用的样品前处理方法包括沉淀、萃取、吸附等，但这些方法操作繁琐、耗时长且效果不稳定。为解决这一问题，新型的样品前处理技术如固相萃取、免疫吸附等正在不断发展，以提高样品处理的效率和效果。
液相色谱法如何用于药物分析 液相色谱操作规程
液相色谱法如何用于药物分析液相色谱操作规程液相色谱法（High Performance Liquid ChromatographyHPLC）又称“高压液相色谱”“高速液相色谱”“高分别度液相色谱”“近代柱色谱”等。
液相色谱是色谱法的一个紧要分支，以液体为流动相，接受高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分别后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。
如今，该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中紧要的分别分析技术应用。
尤其是在药物分析领域，有着广泛的应用。
液相色谱在药物分析中的应用，紧要考虑试样的预处理和分析柱、检测器的选择。
在试样的预处理上，日前兴起的固相（微）萃取使得很多含量低的成分得到精制提纯，从而适于液相色谱的测定。
中药中有些紫外吸取，或无特征紫外吸取的成分，直接用液相色谱测定，其灵敏度和分别度都不尽人意，利用柱前或柱后衍生化法可使这些成分较地测定出来。
对于极性大、脂溶性差物质，在YWGCl8柱上不易保留，用十二烷基磺酸钠作为离子对试剂，降低其极性，延长柱上的保留时间，取得较好的分别较果。
将液相色谱和质谱这两个强有力的分析技术在线连接在一起，经过三十年的进展已成为一项较为成熟的分析手段，但是它从形成伊始就存在着问题：从液相色谱流进质谱时，流动相的变化、溶剂的构成、高温高压离子化的问题制约着这种联用技术进展。
大气压离子化接口具有去除溶剂和离子化的双重功效，它的引入使得该技术在各个领域得到了广泛的应用。
电喷雾离子源是一种软电离技术，一般只生成（M H）和（M—H）—两种分子离子峰，选择性监测（mz）190的负分子离子峰，具有较高的灵敏度、精准度、专一性，充分了低浓度药物讨论的需求。
三维液相色谱法可以同步测定葛根素和阿魏酸两种指标。
通过试验证明：假如选择合适的柱温等色谱条件，乙醇作为反相液相色谱流动相，分析中药及中成药中有效成分，既安全又精准。
版药典高效液相色谱法质谱法(DOC)
品种正文项下规定的条件除填充剂种类、流动相组分、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱内径与长度、填充剂粒径、流动相流速、流动相组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等，均可适当改变，以达到系统适用性试验的要求。
调整流动相组分比例时，当小比例组分的百分比例X小于等于33%时，允许改变范围为～；当X大于33%时，允许改变范围为X-10%～X+10%。
若需使用小粒径（约2μm）填充剂，输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配；如有必要，色谱条件也应作适当的调整。
当对其测定结果产生争议时，应以品种项下规定的色谱条件的测定结果为准。
当必须使用特定牌号的色谱柱方能满足分离要求时，可在该品种正文项下注明。
2.系统适用性试验色谱系统的适用性试验通常包括理论板数、分离度、灵敏度、拖尾因子和重复性等五个参数。
按各品种正文项下要求对色谱系统进行适用性试验，即用规定的对照品溶液或系统适用性试验溶液在规定的色谱系统进行试验，必要时，可对色谱系统进行适当调整，以符合要求。
（1）色谱柱的理论板数（n）用于评价色谱柱的分离效能。
由于不同物质在同一色谱柱上的色谱行为不同，采用理论板数作为衡量色谱柱效能的指标时，应指明测定物质，一般为待测物质或内标物质的理论板数。
在规定的色谱条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分色谱峰或内标物质色谱峰的保留时间t R和峰宽（W）或半高峰宽（W h/2），按n=16（t R/W）2或 n=（t R/W h/2）2计算色谱柱的理论板数。
t R、W、W h/2可用时间或长度计（下同），但应取相同单位。
（2）分离度（R）用于评价待测物质与被分离物质之间的分离程度，是衡量色谱系统分离效能的关键指标。
可以通过测定待测物质与已知杂质的分离度，也可以通过测定待测物质与某一指标性成分（内标物质或其他难分离物质）的分离度，或将供试品或对照品用适当的方法降解，通过测定待测物质与某一降解产物的分离度，对色谱系统分离效能进行评价与调整。
液相色谱法基本知识
第一节 概 述
等，作为分析时选择余地大；而气相色谱并不可能的。 ③ 液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般有利
于色谱分离条件的选择。 （3）由于液体的扩散性比气体的小105倍，因此，溶质在液
相中的传质速率慢，柱外效应就显得特别重要；而在 气相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不计。 （4）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易，而 且回收是定量的，适合于大量制备。但液相色谱尚缺 乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实际 应用中，这两种色谱技术是互相补充的。
组分的差速迁移，从而实现分离。分配系数（K）或分配比
（k）小的组分，保留值小，先流出柱。然而与气相色谱法 不同的是，流动相的种类对分配系数有较大的影响。
21
第四节 液—固色谱法
（4）应与所用检测器相匹配。例如利用紫外检测器时，溶 剂要不吸收紫外光。
（5）容易精制、纯化、毒性小，不易着火、价格尽量便宜 等。
在液-固色谱中，选择流动相的基本原则是 极性大的试 样用极性较强的流动相，极性小的则用低极性流动相。
为了获得合适的溶剂极性，常采用两种、三种或更多种 不同极性的溶剂混合起来使用，如果样品组分的分配比k值 范围很广则使用梯度洗脱。
3
第一节 概 述
的70 ~ 80%。 （2）液相色谱能完成难度较高的分离工作
因为： ①气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡
过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相 互作用。而在液相色谱中流动相液体也与固定相争夺样 品分子，为提高选择性增加了一个因素。也可选用不同 比例的两种或两种以上的液体作流动相，增大分离的选 择性。 ②液相色谱固定相类型多，如离子交换色谱和排阻色谱。
8
第二节 高效液相色谱仪
2015版高效液相色谱法标准操作规程12.1
高效液相色谱法标准操作规程 目 的：建立高效液相色谱法标准操作规程，确保高效液相色谱法操作规范化。
适用范围：适用于高效液相色谱法的操作。
责 任 者：质量管理部经理、质量检验中心主任、质量检验员。
内 容：高效液相色谱法系采用髙压输液泵将规定的流动相泵人装有填充剂的色谱柱，对 供试品进行分离测定的色谱方法。
注入的供试品，由流动相带人色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进人检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。
1.对仪器的一般要求和色谱条件髙效液相色谱仪由髙压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。
色谱柱内径一般为3.9〜4.6mm,填充剂粒径为3〜lOum 。
超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2um)填充剂的耐超髙压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。
(1）色谱柱反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。
常见的载体有硅 胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。
正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。
常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。
氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作文件编码：SOP-QC-ZJ-6041-03题 目高效液相色谱法标准操作规程制定部门：质量检验中心 颁发部门：质量管理部 分发部门：质量管理部、质量检验中心制定人： 日期： 年 月 日审核人： 日期： 年 月 日批准人： 日期： 年 月 日生效日期： 年 月 日 变更历史：1.2003年3月制定；2.2005年7月执行《中国药典》2005年版第一次修订；3.2010年10月执行《中国药典》2010年版第二次修订；4.2015年12月执行《中国药典》2015年版第三次修订。
反相色谱。
离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。
有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。
手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。
《液相色谱法》课件
DATE
ANALYSIS
SUMMAR Y
REPORT
CATALOG
DATE
ANALYSIS
SUMMAR Y
05
液相色谱法的优化与注 意事项
实验条件的优化
1 2
流动相的选择
根据分析物的性质选择合适的流动相，如有机溶 剂、缓冲液等，以达到最佳分离效果。
流速的优化
流速对色谱分离效果有重要影响，需根据实际情 况调整流速，以达到最佳分离效果。
3
柱温的优化
柱温会影响物质的吸附和扩散速度，适当提高柱 温可以加快分析速度，但过高的温度可能导致柱 效降低。
液相色谱柱的维护与保养
使用前清洗
新柱子使用前需进行彻底清洗，以去除残留物和 污染物。
使用中维护
使用过程中应定期清洗和再生色谱柱，以保持其 性能和寿命。
储存条件
色谱柱应存放在干燥、避光的地方，避免直接阳 光照射和高温。
反相色谱法
总结词
反相色谱法是利用非极性固定相和极性流动相之间的相互作用来分离物质的分离 模式。
详细描述
反相色谱法中，固定相通常是烷基键合硅胶，流动相则是极性的溶剂，如水、甲 醇等。在分离过程中，非极性或弱极性的组分更容易被固定相吸附，因此会先被 洗脱出来。
离子交换色谱法
总结词
离子交换色谱法是利用离子交换剂与溶液中的离子之间的相互作用来分离物质的分离模 式。
动相。
流动相的流速和组成对分离效果 也有影响，需根据实际情况调整
。
固定相
固定相是色谱柱中的填料，用于吸附样品中的组分。
常见的固定相有硅胶、氧化铝、活性炭等，根据不同分离需求选择合适的固定相。
固定相的粒径和性质对分离效果有影响，粒径越小，性质越均匀，分离效果越好。
2015年版药典高效液相色谱法、质谱法
2015年版药典高效液相色谱法、质谱法正相色谱系统的流动相常用两种或两种以上的有机溶剂，如二氯甲烷和正己烷等。
品种正文项下规定的条件除填充剂种类、流动相组分、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱内径与长度、填充剂粒径、流动相流速、流动相组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等，均可适当改变，以达到系统适用性试验的要求。
调整流动相组分比例时，当小比例组分的百分比例X小于等于33%时，允许改变范围为0.7X～1.3X；当X大于33%时，允许改变范围为X-10%～X+10%。
若需使用小粒径（约2μm）填充剂，输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配；如有必要，色谱条件也应作适当的调整。
当对其测定结果产生争议时，应以品种项下规定的色谱条件的测定结果为准。
当必须使用特定牌号的色谱柱方能满足分离要求时，可在该品种正文项下注明。
2.系统适用性试验色谱系统的适用性试验通常包括理论板数、分离度、灵敏度、拖尾因子和重复性等五个参数。
按各品种正文项下要求对色谱系统进行适用性试验，即用规定的对照品溶液或系统适用性试验溶液在规定的色谱系统进行试验，必要时，可对色谱系统进行适当调整，以符合要求。
（1）色谱柱的理论板数（n）用于评价色谱柱的分离效能。
由于不同物质在同一色谱柱上的色谱行为不同，采用理论板数作为衡量色谱柱效能的指标时，应指明测定物质，一般为待测物质或内标物质的理论板数。
在规定的色谱条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分色谱峰或内标物质色谱峰的保留时间t R和峰宽（W）或半高峰宽（W h/2），按n=16（t R/W）2或 n=5.54（t R/W h/2）2计算色谱柱的理论板数。
t R、W、W h/2可用时间或长度计（下同），但应取相同单位。
（2）分离度（R）用于评价待测物质与被分离物质之间的分离程度，是衡量色谱系统分离效能的关键指标。
可以通过测定待测物质与已知杂质的分离度，也可以通过测定待测物质与某一指标性成分（内标物质或其他难分离物质）的分离度，或将供试品或对照品用适当的方法降解，通过测定待测物质与某一降解产物的分离度，对色谱系统分离效能进行评价与调整。
液相色谱法
液相色谱法
液相色谱法（liquid chromatography，LC）是一种色谱技术，用于分离
和分析溶液中混合物的化学成分，以确定是否存在或不存在特定成分，如果存在，则存在多少。
我们中的许多人会从上学开始就熟悉平面LC的形式，在滤纸上打上黑色墨水标记，将一端浸入水中，然后观察墨水中的成分颜色是否分开。
但是，分析应用中使用的大多数LC均基于柱色谱法，这将是本文的重点。
顾名思义，高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是使用高色谱分辨率进行高效分离的高性能分析。
分离的组分也可以在检测后使用馏分收集器分离，作为纯化的手段。
HPLC有多种不同的配置，可用于分离分子量从半挥发性小分子到几万千道尔顿的大蛋白生物分子的溶解组分。
液相色谱法是一种非常流行的分析技术，广泛用于环境监控，农业，医药领域。
液相色谱法的优缺点
LC通常用于各种应用。
但是，它不适用于挥发性化合物的分离和分析。
仅当所有要分离的组分的蒸气压低于流动相的蒸气压时，才能实现可靠的分析型液相色谱方法。
气相色谱法更适合分析挥发性化合物。
提供各种不同的色谱柱和溶剂，可提供广泛的选择性，从而可以分离极性范围很广的组分。
大分子和小分子同样适用于该技术。
在相对较低的温度下进行有效分离的能力也使LC成为可在气相色谱仪中分解的热不稳定化合物的理想分离技术。
实验 高效液相色谱法(2015年)
[仪器与试剂]
1.仪器: 高效液相色谱仪,配备二极管阵列检测器; 超声波清洗仪; 50ml容量瓶;50ml烧杯;50µ l微量进样器
2.试剂: 稀氨水(1+1);碳酸氢钠溶液:20g/L;甲醇(色谱纯) 糖精钠标准储备溶液(10.0mg/ml): 准确称取于120℃烘干4h后的糖精钠 (C6H4CONNaSO2· 2H2O)0.5000g,加水溶解 后定容至50ml 苯甲酸标准储备溶液(5.0mg/ml): 准确称取0.2500g,加碳酸氢钠溶液25ml,加热溶解, 定容至50ml 山梨酸标准储备溶液(5.0mg/ml): 准确称取0.2500g山梨酸,加碳酸氢钠溶液25ml,加热溶 解,定容至50ml 标准混合使用液 (含糖精钠1.0mg/ml,苯甲酸0.5mg/ml,山梨酸0.5mg/ml): 准确吸取各标准储备溶液5.0ml,加水定容至 50ml
前处理
(1)过滤：0.45um或更小孔径滤膜
目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤 其是使用无机盐配制的缓冲液。
滤膜类型：
聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐 醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水溶剂 尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可以 用于强酸，不适用于二甲基甲酰胺。 再生纤维素滤膜：同样适用于水溶性样品和有机溶剂
流动相出口 泵头
凸轮
单向阀
柱塞杆 柱塞密封圈 流动相入口
柱塞泵的基本结构
1_at.flv LC-10ATvp LC-20AT 串联式柱塞往复泵 1_ad.flv LC-10ADvp LC-20AD 并联式微体积柱塞往复泵
单向阀
单向阀
单向阀
单向阀
单向阀结构 单向阀工作原理
吸液冲程
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检测器：
• 光学及/或质谱检测器 • 可调紫外或光电二极管矩阵 • 为UPLC™专门优化的流动池 • 高速检测
色谱柱管理：
• 创新的枢轴转动设计 • 置色谱柱出口直接到检测器
样品管理器：
• 低扩散XYZZ’形式 • 快速进样周期 • 低交叉污染 • 样品盘及/或样品瓶 • 可选样品组织器
两元溶剂管理：
在有缓冲液的情况下 , 缓冲液的浓度和 PH 是非常重要
固定相的影响
分析条件
ODS
C8 TMS
柱 : Shim-pack CLC-ODS 流动相 : MeOH : H2O = 7 :3 流速 : 1.0 mL/min 温度 : 40 C 进样体积 : 10 uL 检测器 : UV-254 nm
峰 1. 苯甲酸甲脂 2. 苯甲酸乙脂 3. n-丙基 苯甲酸 4. n- 丁基 苯甲酸
3
四 尺寸排阻(凝胶)色谱法
尺寸排阻色谱法也称凝胶色谱法，是一种根据试样分子大 小进行分离的色谱技术。
排阻色谱的色谱柱的填料是凝胶，它是一种表面惰性，
含有许多不同尺寸的孔穴或立体网状物质。孔穴大小与试样
(2) 进样系统
——通常使用耐高压的六通阀进样装置，
（3） 色谱分离柱
柱体为直型不锈钢管，内径4.6 mm，柱长100-
250mm，标准柱型：150×4.6mm 和250 × 4.6 mm
。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
(4)、检测器
目前最常用的检测器主要有：
A、紫外检测器
21．在液相色谱中，常用作固定相又可用作键合相基体的物质是 A 分子筛 B 硅胶 C 氧化铝 D 活性炭 22．样品中各组分的出柱顺序与流动相的性质无关的色谱是 A 离子交换色谱 B 分配色谱 C 吸附色谱 D 凝胶色谱 23．在液相色谱中，固体吸附剂适用于分离（ ）。 A 异构体 B 沸点相近，官能团相同的颗粒 C 沸点相差大的试样 D 极性变换范围 24．为测定邻氨基苯酸中微量杂质苯胺，选择下面哪种条件 A 硅胶固定相，异丙醚一正己烷流动相 B 硅胶固定相，水一甲醇流动相； C ODS键合相，水一甲醇流动相 D ODS键合相，异丙醚一己烷流动相。
3、在反相色谱法中，若以甲醇一水为流动相，增加甲醇的比例时 ，组分的容量因子k与保留时间tR的变化为（ ）。 A k与tR增大 B k与tR减小 C k与tR不变 D k增大，tR减小 4、高效液相色谱仪与气相色谱仪比较增加了（ ） A、恒温箱 B、进样装置 C、程序升温 D、梯度淋洗装置
5．在液相色谱中，为了改善分离的选择性，下列措施（ ） 是有效的？ A 改变流动相种类 B 改变固定相类型 C 增加流速 D 改变填料的粒度 6．在分配色谱法与化学键合相色谱法中，选择不同类别的溶剂 （分子间作用力不同），以改善分离度，主要是（ ）。 A 提高分配系数比 B 容量因子增大 C 保留时间增长 D 色谱柱柱效提高 7．分离结构异构体，在下述四种方法中最适当的选择是 A 吸附色谱 B 反离子对色谱 C 亲和色谱 D 空间排阻色谱 8. 下列用于高效液相色谱的检测器，（ ）检测器不能使用 梯度洗脱。 A、紫外检测器 B、荧光检测器 C、蒸发光散射检测器 D、示差折光检测器
第15章 高效液相色谱法
(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)
主讲：丘秀珍 化学与环境工程学院
高压
高效 高柱效
高灵 敏度
HPLC
应用范 围广
安捷伦 1200
Waters 2695 液相色谱仪
一 高效液相色谱仪的基本部件
高效液相色谱仪由五大部分组成：高压输液系统、进 样系统、分离系统（色谱柱）、检测系统、记录仪
(3)n2=(R2/R1)2n1
根据题目给出的已知条件,首先求出A、B组分在色谱图上 的半峰宽(或底宽Y),再根据(2),(3)公式进行计算. tR 解 根据公式(2)得W1/2(1)= (n / 5.54)1/ 2
14.6 0.5303 1/ 2 (4200/ 5.54)
• 高压混合 • 两元梯度 • 四溶剂选择 • 在线脱气 • 低扩散设计 • UPLC的耐压能力
超高效液相色谱的C18色谱柱
固定相粒度 直径可达
dp
1.7µm 色谱柱长可 达3-5cm
色谱柱颗粒化学
全二维液相色谱
液相色谱自测题
1．HPLC与GC的比较，可忽略纵向扩散项，这主要是因为（ A 柱前压力高 B 流速比GC的快 C 流动相粘度较小 D 柱温低 2．在下列方法中，组分的纵向扩散可忽略不计的是（ A 毛细管气相色谱法 B 高效液相色谱法 C 气相色谱法 D 超临界色谱法 ）。 ）
9．在液相色谱中，梯度洗脱适用于分离（ ）。 A 异构体 B 沸点相近，官能团相同的化合物 C 沸点相差大的试样 D 极性变化范围宽的试样 10. 在液相色谱中, 某组分的保留值大小实际反映了哪些部分的分 子间作用力（ ） A、组分与流动相 B、组分与固定相 C、组分与流动相和固定相 D、组分与组分 11、吸附作用在下面哪种色谱方法中起主要作用（ ）。 A 液一液色谱法 B 液一固色谱法 C 键合相色谱法 D 离子交换法 12. 在液相色谱中，提高色谱柱柱效的最有效途径是（ ）。 A 减小填料粒度 B 适当升高柱温 C 降低流动相的流速 D 增大流动相的流速 13．在正相色谱中，若适当增大流动相极性则（ ）。 A 样品的k降低，tR降低 B 样品的k增加，tR增加 C 相邻组分的增加 D 对基本无影响
18、与气相色谱相比，在液相色谱中（ ）。 A 分子扩散项很小，可忽略不计，速率方程式由两项构成 B 涡流扩散项很小，可忽略不计，速率方程式由两项构成 C 传质阻力项很小，可忽略不计，速率方程式由两项构成 D 速率方程式同样由三项构成，两者相同 19．在液相色谱中，下列检测器可在获得色谱流出曲线的基础上， 同时获得被分离组分的三维彩色图形的是（ ）。 A 光电二极管阵列检测器 B 示差折光检测器 C 荧光检测器 D 电化学检测器 20．不同类型的有机物，在极性吸附剂上的保留顺序是（ ） A C 饱和烃、烯烃、芳烃、醚 烯烃、醚、饱和烃、芳烃 B 醚、烯烃、芳烃、饱和烃 D 醚、芳烃、烯烃、饱和烃
C.荧光检测器
原理：基于被分析组分发射的荧光强度进行检测
优点： 1）灵敏度极高 2）选择性好 3）对温度和流速不敏感，可用于梯度洗脱
缺点：仅适用于测定可产生荧光的物质 可检测物质：多环芳烃、霉菌毒素、酪氨酸、色氨酸、 卟啉、儿茶酚氨等（具有对称共轭体系）
D. 示差折光检测器
通过参比池和样品池中流动相之间的折光率差值 来测定组分浓度。差值与浓度呈正比；
化学键合固定相是通过化学反应把各种不同的有机基团键合
到硅胶（载体）表面的游离羟基上，代替机械涂渍的液体固
定相。
疏水性 相互作用
C18 (ODS) 强 OH
OH
弱
疏水性
反相模式下流动相溶剂的选择
优化水（缓冲溶液）和有机溶剂的比例对
反相色谱是非常重要的
甲醇，乙腈和 THF 是常用的有机溶剂
如化妆品中违禁品的检测
UPLC仪器
仅仅有小颗粒不能构成UPLCTM 大幅提高色谱柱的性能；第一要解决小颗粒填料的 耐压问题，第二要解决小颗粒填料的装填问题。 高压溶剂输送系统（超过15000psi）。 完善的系统整体性设计，降低死体积。并解决超高 压下的耐压及渗漏问题。 快速自动进样器，降低进样的交叉污染。 高速检测器。 系统控制及数据管理，解决高速数据的采集、仪器 的控制问题。
1、仪器流程及主要部件
(1) 高压输液系统 高压输液泵
高压输液泵是液相色谱仪的关键部件。输液泵的稳定
性直接关系到分析结果的重复性和准确性。
梯度洗脱就是在分离的过程中式两种或两种以上不 同极性的溶剂按一定得程序连续改变它们的比例， 从而调节流动相得极性、强度、 PH ，以到达提高 分离效果的目的
UPLCTM与HPLC：分离度比较
填料颗粒尺寸的演变
0.040
0.020
UPLC
0.000
速度、灵敏 度及分离度 的完美结合
AU
0.00
0.20
0.40 Minutes
0.60
0.80
1.00
一分钟以内！
超高效液相色谱的应用
药物分析 如天然产物中复杂组分的分析
生化分析 如蛋白质、多肽、代谢组学等生化样品 食品分析 如食品中农药残留的检测 环境分析 如水中微囊藻毒素的检测 其他
组分性质和结构与吸附剂相近时，易被吸附。所以吸附色谱
对分离几何异构体和不同官能团的物质有很好的选择性，但
吸附色谱对同系物没有选择性，不能用该法分离同系物。 (2) 液固色谱固定相
极性吸附剂包括硅胶、分子筛及聚酰胺等；中等极性吸附剂
氧化铝；非极性吸附剂最常见的是活性炭。
（3）液固色谱流动相
液相色谱流动相必须符合的要求：
能溶解试样，但不与试样发生反应。 与固定相不互溶，也不发生不可逆反应 粘度尽可能小，保证较高的渗透性和柱效 检测器对流动相无响应
二 液液分配色谱
液液分配色谱是根据各组分在两相中的分配系数不同
得以分离的。分配系数（K）或分配比（k）小的组分，
在固定相中滞留时间短，先流出色谱柱。
（1） 液-液分配色谱固定相 化学键合固定相
液相色谱40年的发展史是颗粒技术的发展史。颗粒度的 改变直接影响到柱效，从而对分离结果产生直接影响。 由下图可知：随着颗粒度的不断降低，色谱分离度不断 提高。
基于1.7 μm小颗粒技术的超高效液相色谱（UPLC ），并非普通HPLC系统改进而成。它不但需要耐 压、稳定的小颗粒填料，而且需要耐压的色谱系 统(>15,000psi)、最低交叉污染的快速进样器、快 速检测器及优化的系统体积等诸多方面的保障， 以充分发挥小颗粒技术优势。这就需要对系统所 有硬件和软件的进行全面创新。