一些氨基酸对产甘油假丝酵母甘油生产的促进作用

22卷1期2006年1月生 物 工 程 学 报Chinese J ournal o f Biotechnology Vol.22 No.1January 2006Received:Augus t 29,2005;Accepted:November 2,2005.*Corres ponding author.Tel:86_510_5874341;E_mai l:jzhuge@s 一些氨基酸对产甘油假丝酵母甘油生产的促进作用Stimulatory Effects of Some Amino Acids on Glycerol Production by Candida glycerinogenes谢 涛,方慧英,诸葛健*XIE Tao,FANG Hui_Ying and ZH UGE Jian*江南大学工业生物技术教育部重点实验室,无锡 214036TheK e y Laboratory o f In du st ria l Biote chn olo gy o f Min ist ry o f Edu cation ,South ern Ya ng tz U nive rsity ,W u xi 214036,Ch in a摘 要 以E MP 途径与TCA 循环中间代谢物的添加为对照,研究在尿素为氮源的产甘油假丝酵母发酵过程中添加氨基酸对甘油产量的影响。

结果表明:对甘油产量有强促进作用的氨基酸有谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、赖氨酸、酪氨酸、脯氨酸、组氨酸和丝氨酸,其最适添加浓度在0 26~0 45g/L 之间,丙酮酸、 _酮戊二酸、草酰乙酸、柠檬酸和琥珀酸的最适添加浓度在0 24~0 42g/L 之间;赖氨酸最适于在0h 添加,丙酮酸和草酰乙酸在第14h,谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、甘氨酸、 _酮戊二酸和琥珀酸在第30h,天冬酰胺、丝氨酸和柠檬酸在第48h;在最适条件下添加这些促进剂,甘油产量均呈显著增加趋势,转化率和增加率分别达到60%和16%以上。

氨基酸的作用机理为其脱氨形成的碳骨架经特定的分解代谢途径进入TCA 循环,使其强化,导致碳代谢流在3_磷酸甘油醛节点处发生转移,使甘油合成途径的代谢流增加。

关键词 氨基酸,产甘油假丝酵母,甘油生产,EMP 途径,T C A 循环,中间代谢物中图分类号 TQ92 文献标识码 A 文章编号1000 3061(2006)01 0138 06Abstract By using some intermedia te metabolites in EMP pathway and TCA c ycle as the control,the e ffec ts of a mino acid supplements on glyce rol produc tion by Candida glycerinogenes in shake _flask ferme nta t ions with urea as nitrogen resource were investigated.The results sho wed that ten kinds of amino acids,including L_glutamic acid,L_glutamine,L_aspartic acid,L_asparagine,L_glycin,L_lysine,L _tyrosine,L_proline,L_histidine,and L_serine,had strong promotional effects on glyc erol produc tion;The optimal concentrations of these a mino acids were 0 40,0 45,0 36,0 35,0 39,0 36,0 35,0 45,0 26,and 0 45g L,re spec t ively.Acc ordingly the optimum contents of pyruvic acid, _oxoglutarate,oxaloacetic acid,ci trate,and succinate we re 0 24,0 42,0 40,0 37,and 0 38g L,respec tively.The advanta geous opportunities of supplement were a s follows:L_lysine at the beginning of fermentation;pyruvic acid and oxaloacetic acid at the fourteenth hour;L_glutamic acid,L_glutamine,L_histidine,L_proline,L_aspartic acid,L_tyrosine,L_glycin, _oxoglutarate,and succinate a t the thirtieth hour;and L_asparagine,L_se rine,and citrate at the forty_eighth hour.The addition of eac h sti mulant at the opti mal conditions could significantly pro mote glycerol production,with the glycerol yield on initial glucose and its inc reased speed exceeding 60%and 16%,respectively.The possible stimulatory mechanism due to the amino acid supplements is tha t the inc reased inter mediate metabolites le vels fro m a mino acids de gradation may have enhanced the flux through TCA cycle,which improve cell energe tics.Meanwhile,the shift of carbon metabolism flux at the glyceraldhyde _3_phosphate node can result in the incremental flux through glycerol biosynthesis pa thway.Key words amino acid,Candida glycerinogenes ,glyce rol produc tion,Embden_Meyerhof_Parnas path way,tricarboxylic acid c ycle,intermediate me tabolite s氨基酸是一类很重要的生长限制因子,可以促进微生物生长和代谢产物合成,在酶制剂、抗生素、生化药物等众多发酵产品的生产过程得到普遍应用[1 8]。

甘油是一种重要的轻化工原料,已广泛应用于化妆品、牙膏、烟草、香精、水性油墨、印染纺织、涂料、合成树脂、皮革、造纸、制药、食品和国防等各个领域的1700多种产品中[9]。

耐高渗透压酵母Candida glycerinogenes发酵生产甘油具有高产量、高转化率和高回收率等优点,在我国已得到了较好的工业化应用[10 12]。

但是,在氨基酸、E MP途径与TCA 循环的中间代谢产物影响C.glycerino genes产甘油发酵过程及其作用机理方面的研究,目前尚为空白。

本文将依据20种氨基酸对C.glycerino genes甘油产量的影响程度对其进行分类,确定具有强促进作用的氨基酸的最适作用浓度与添加时机,研究其对C. glycerinogenes发酵过程的影响。

由于E MP途径和TC A循环的某些中间代谢产物,如丙酮酸、草酰乙酸和 _酮戊二酸等,既是某些氨基酸合成的前体,又是氨基酸脱氨基后形成的碳骨架进入TCA循环的终端产物。

因此,研究E MP途径和TC A循环中的某些关键中间代谢产物对C.glycerino genes产甘油发酵的影响也是十分必要的,有助于阐明氨基酸的作用机理。

1 材料和方法1 1 菌株和培养基菌株:Candida glycerinogenes由江南大学工业微生物研究中心提供。

种子培养基(g L):葡萄糖100,尿素2,玉米浆8,自然pH值。

合成发酵培养基(g L):葡萄糖210~230,尿素2,KH2PO40 4,MgSO4 7H2O0 5,CaCl20 1,NaCl0 1,微量元素溶液1mL/L,pH值不调。

微量元素溶液(g/L):KI0 2,ZnSO4 7H2O0 9, Na2S0 3,SnCl20 1,NiCl0 05,NaBr0 05,MnSO4 H2O2 5,CuSO4 5H2O0 15,Co(NO3)2 6H2O0 01, NaB4O7 10H2O0 6,(NH4)6Mo2O24 9H2O0 02,Al2 (SO4)30 1,FeSO4 7H2O5 56,Na2 ED TA 2H2O 7 46。

1 2 发酵方法从刚转接培养好的新鲜斜面上挑取一环菌株,接入500mL摇瓶中(种子培养基装液量为50m L),于往复式摇床上30振荡培养19h(振幅10cm,振动频率110次 min)。

再按5%(V V)的接种量将种子液接入装有60mL合成发酵培养基的500mL摇瓶中进行发酵,发酵条件同种子培养。

1 3 测定方法甘油的测定采用高碘酸钠_变色酸法[10];葡萄糖的测定采用生物传感仪。

2 结果2 1 氨基酸的作用类型及其添加量的确定为了研究氨基酸对C.glycerinogenes产甘油发酵结果的影响,采用合成培养基,并在发酵开始时分别添加不同浓度梯度的单个氨基酸,然后进行发酵。

根据甘油产量提高的程度,将20种氨基酸的作用类型分为以下三类:第一类,甘油产量提高10%以上,如谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、赖氨酸、酪氨酸、脯氨酸、组氨酸和丝氨酸等,它们的最适添加量及其发酵结果见表1,甘油对葡萄糖的转化率达到60%左右;第二类,甘油产量提高5%~ 10%,如丙氨酸和精氨酸等;第三类,导致甘油产量下降,如苏氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、缬氨酸和色氨酸等。

实验结果还表明,随着氨基酸添加量的增加,第一类和第二类氨基酸对生物量的形成和葡萄糖的消耗基本没有影响(数据未列出);第三类氨基酸对生物量的影响也不显著,但葡萄糖的消耗速率和利用率明显下降,从而导致甘油产量减少、副产物增加(数据未列出)。