水稻小穗cDNA文库的构建
cDNA 文库的构建
第二节cDNA 文库的构建cDNA 文库中的外源 DNA 片段是互补 DNA （complementary DNA , cDNA）。
cDNA 是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的 mRNA 经体外反转录后形成的双链 cDNA 。
cDNA 文库代表生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内转录水平上的基因的群体，并不能包括该生物的全部基因，且这些基因在表达丰度上存在很大差异。
cDNA 文库的构建cDNA 文库的构建共分四步（图 8-2）：第一，细胞总 RNA 的提取和 mRNA 分离；第二，第一链 cDNA 合成；第三，第二链 cDNA 合成；第四，双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖。
图 8-2 ： cDNA 文库构建流程图一、RNA 的分离cDNA 文库构建是以 mRNA 为起始材料的， mRNA 在总RNA 中所占比例很小，因此从总RNA 中富集mRNA 是构建cDNA 文库和其它应用所必需进行的步骤。
通过降低rRNA和tRNA 含量，可大大提高筛选到目标基因的可能性。
目前纯化mRNA 的方法都是在固体支持物表面共价结合固定一段由脱氧胸腺嘧啶核苷组成的寡聚核苷酸[ oligo（dT）]链，由它与mRNA 的Poly（A）尾巴杂交，从而吸附固定住mRNA ，进而将mRNA从其它组分中分离出来的。
1．mRNA 的完整性指导合成高分子量蛋白质的能力，指导合成目的多肽的能力，mRNA 的大小，总mRNA 制剂指导合成cDNA 第一链长分子的能力。
2．mRNA 的丰度高丰度mRNA ：珠蛋白，免疫球蛋白，卵清蛋白，在特定细胞中占50-90% 。
低丰度mRNA ：含量 0.5% 被称为低丰度或稀有mRNA 。
3．mRNA 的富集3.1按大小对 mRNA 进行分级分离3.2 cDNA 的分离级分离近年来多采用此方法，特别是大mRNA ，可避免降解mRNA , agarose 分离大小易辨。
cDNA文库的构建
cDNA文库的构建cDNA文库的构建基因文库的构建是现代生命科学研究中的一项重要技术。
自70年代初首例cDNA克隆问世以来，已用构建和筛选cDNA文库的方法克隆了很多基因。
通过构建cDNA文库能直接分离到生命活动过程中的一些调控基因及了解这些基因所编码的蛋白质的相互作用关系．因此cDNA文库的构建是基因克隆的重要方法之一，从cDNA文库中可以筛选到所需的目的基因，并直接用于该目的基因的表达。
它是发现新基因和研究基因功能的工具。
1.cDNA文库构建的原理真核生物基因的结构和表达控制元件与原核生物有很大的不同。
真核生物的基因是断裂的，在基因最后产物中表达的编码序列（外显子）被非编码序列（内含子）分隔开，需经RNA转录后加工过程才使编码序列拼接在一起。
真核生物的基因不能直接在原核生物中表达，只有将加工成熟的mRNA经逆转录合成互补的DNA （complementary DNA,cDNA）接上原核生物表达控制元件，才能在原核生物中表达。
而且，真核细胞的基因通常只有一小部分进行表达，由于mRNA的不稳定性，对基因表达和有关mRNA都常通过对其cDNA来进行研究。
为分离cDNA克隆或研究细胞的cDNA 谱，需要先构建cDNA文库。
所谓cDNA文库是指细胞全部mRNA逆转录成cDNA并被克隆的总和。
cDNA文库应包含的克隆数目可由以下公式来计算：N=ln(1-p)/ln(1-1/n)式中：N－cDNA文库所包含的克隆数目；P－低丰度cDNA存在于库中的概率，通常要求其大于99％；1/n－每一种低丰度mRNA占总mRNA的分数。
2.构建cDNA文库的基本步骤构建cDNA文库的基本步骤有五步：①制备mRNA；②合成cDNA；③制备载体DNA；④双链cDN 的分子克隆；⑤对构建的cDNA文库进行鉴定，测定文库包含的克隆数，抽查克隆的质量和异质性，如果需要可适当扩增。
对cDNA的文库的要求：一是希望文库能包括各种稀有mRNA的cDNA克隆；二是克隆的cDNA应是全长的，避免丢掉5’端的序列。
cDNA文库构建原理以及技术路线
CDNA文库1. CDNA文库中重组DNA片断得原始供体来源与细胞中表达出得mRNA,将某一特定类型细胞表达得mrna经反转录酶催化形成与之互补得CDNA，重组克隆后得到得CDNA文库有各自不同得适合范围。
CDNA文库在研究具体某类特定细胞中基因组得表达状态以及表达基因得功能鉴定方面具有特殊得优势，从而使它在个体发育，细胞分化，细胞周期调控2. CDNA文库得质量（1）文库的代表性CDNA文库的代表性是指文库中包含得重组CDNA分子是否能完整地反映出来原细胞中表达地全部信息（即mrna种类），它是体现文库质量地最重要标本。
文库地库容量，它是指构建建出地原始CDNA文库中包含地独立地重组子克隆数。
具备完全好代表性地CDNA文库需要满足地库容量取决与来源细胞中表达出地基因序列地总复杂程度。
具体来就是来源细胞中表达出地mrna种类和每种MRNA序列地拷贝数N=ln(1-p)/ln(1-n/t)，P为文库中包含细胞中任何一种mrna序列信息地概率，通常设为99％，N为文库中P概率出现细胞中任何一种mrna序列理论上应具有地最少重组克隆数，n为细胞中最稀少地mrna序列地拷贝数，t为细胞中表达出地所有mrna地总拷贝数，以人类细胞为列，人类基因组携带地遗传基因总数约为100000种，具体到某一特定类型地细胞中，表达出地基因种类仅为基因组全部基因地15％。
因此对于巨大部分地人类细胞，每个细胞内具体表达地mrna种类约为15000种，全体mrna序列地总拷贝约为500000个，而细胞中稀少地mrna种类地拷贝数平均为8个。
因此，用人类细胞来构建CDNA文库时候，要以99％概率保证文库中包含有细胞表达地任何一种mrna地序列信息，构建出地原始CDNA文库理论上应具有地最少独立克隆数为N=ln(1_99%)/ln(1-8/500000)=2.9*10(5)一个具有完好代表性地CDNA文库至少具有10（6）以上的库容量3．MRNA是由5‘端非编码区，中间地编码序列和3’端非翻译区。
cDNA文库构建的具体步骤及详细说明
cDNA文库构建的具体步骤及详细说明cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部mRNA 经反转录形成的cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。
经典cDNA 文库构建的基本原理是用Oligo(dT) 作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。
其基本步骤包括：（1）mRNA的提纯获取高质量的mRNA是构建高质量的cDNA 文库的关键步骤之一。
（2）cDNA第一条链的合成。
（3）cDNA第二条链的合成。
（4）双链cDNA的修饰。
（5）双链cDNA的分子克隆。
（6）cDNA文库的扩增。
（7）cDNA文库鉴定评价。
一、Superscipt II—RT合成第一链1. 在一RNase-free的0.2 ml PCR管中加入x ul mRNA(大约500 ng) 、1 ul Xho I Primer(1.4 ug/ul)(5’GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’)、11-x ul RNase-free water（大于500 ng mRNA 分n管(500 ng/tube)合成第一链，第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成。
）。
2. 混匀后，70℃反应10分钟。
3. 反应完成后，立刻将反应体系置于冰上5 min。
4. 稍微离心一下，顺序加入以下试剂：（1）4 ul 5×first strand buffer（2）2 ul 0.1 M DTT（3）1 ul 10 mM dNTP(自己配制)5. 混匀，稍微离心反应物之后，42℃放置2分钟。
6. 反应完成,趁热加入1 ul Superscipt II—RT，混匀。
7. 42℃反应50分钟，然后70℃，15分钟灭活反转录酶。
二、cDNA第二链的合成1. 第一链反应完成后，取2ul一链产物-20℃冰箱中保存，待电泳检测。
cDNA文库的构建
3. mRNA 的纯化
对高丰度的 mRNA 来讲，其所对应的 cDNA 克隆很NA 之前不需要进一步纯化和富集。分离低丰度 mRNA 通常有如下两种方法：①按照大小对总 mRNA 进行分级，主要用琼脂糖凝胶电泳和蔗糖密度梯度离心法进行分级；②多聚核糖体的免疫学纯化法，这是利用抗体来纯化合成目的多肽的方法。
4. mRNA 完整性的确定
确定 mRNA 完整性的方法有三种：
① 直接检测 mRNA 分子的大小；
② 测定 mRNA 的转译能力；
③ 检测总 mRNA 指导合成 cDNA 第一链长分子的能力。
二、 cDNA 的合成和克隆
1. cDNA 第一链的合成
用亲和层析法得到 mRNA 后，根据 mRNA 分子的 3' 端有 poly (A) 尾结构的原理，用 12~20 个核苷酸长的 oligo （ dT ）与纯化的 mRNA 混合， oligo （ dT ）会与 poly (A) 结合作为反转录酶的引物，反转录反应的产物是一条 RNA-DNA 的杂交链。 oligo （ dT ）结合在 mRNA 的 3' 端，因此合成全长的 cDNA 需要反转录酶从 mRNA 分子的一端移动到另一端，有时这种全合成难以达到，尤其是 mRNA 链很长时，为此建立了一种随机引物法合成 cDNA 。随机引物是一种长度为 6~10 个核苷酸，由 4 种碱基随机组成的 DNA 片段。与 oligo （ dT ）仅与 mRNA 3' 端结合不同，它们可以在 mRNA 的不同位点结合。随机引物法合成的产物也是 RNA-DNA 的杂交体。把 cDNA 克隆到载体中之前，必须把这种杂交体中的 RNA 转变成 DNA 链，即形成双链 DNA 分子。
3. 将 cDNA 重组到载体上
cDNA文库的构建
PCR基因扩增
• 目的：增加目的DNA的数量
过程：
• 1、将PCR使用的药品、试剂从冰箱取出，冰浴放置。按照 PCR反应体系加药品，加药完毕后，用微型离心机离心数秒， 使所加药品混匀。
• 2、PCR反应体系
• 在0.2ml PCR管内配制25ml反应体系
• 3、PCR反应程序： • 预变性 • 变性 • 退火 • 延伸 • 再延伸
• (4)PCR反应完成后的样品4℃下短时间保存。-20℃下可 以保存数周。
双链cDNA连接到质粒或噬菌体载体并导入 大肠杆菌中繁殖
• 将合成的双链重组到质粒载体或噬菌体载体上,转化大肠 杆菌寄主细胞增殖.
• 1,同聚物加尾法 • 利用小牛胸腺末端转移酶在双链cDNA和质粒载体的3'-端
都加上一个互补的同聚片段,通过退火使两个连接片段成 重组质粒,再将重组质粒转化受体细胞. • 同聚物加尾法克隆双链cDNA • 2,接头-衔接头法 • 3,mRNA-cDNA克隆法
蓝白斑筛选：• 找出需构建的目的（3）cDNA第二条链的合成。
（4）双链cDNA的修饰。
（5）双链c提取与分离 B. 第一链cDNA的合成 C. 第二链cDNA的合成 D. 双链cDNA连接到质粒或噬菌体载体并导入大肠杆菌中
• 2、在锥瓶的瓶口用玻璃纸封口，留有一定空隙。然后在 微波炉中加热溶解琼脂糖。加热时，当溶液沸腾后，请 戴上防热手套，小心摇动锥瓶，使琼脂糖充分均匀溶解。
• 3、使溶液冷却至50℃-60℃左右，在此时按照1 μL / 10 mL的比例加入4S green染料，并充分混匀。
构建cdna文库的基本步骤
构建cdna文库的基本步骤《构建cDNA文库的基本步骤》引言：cDNA文库的构建是基因组研究中重要的实验技术之一，它可以利用转录酶逆转录RNA为cDNA，然后将其插入适当的载体中，最终形成一个具有表达能力的基因文库。
本文将介绍构建cDNA文库的基本步骤。
一、总RNA的提取首先，需要从细胞或组织中提取总RNA，并保证RNA的完整性和纯度。
常用的提取方法包括酚/氯仿法、硅胶柱法等。
提取得到的总RNA可以用琼脂糖凝胶电泳进行分离和检测。
二、逆转录反应逆转录反应是将RNA逆转录为cDNA的过程。
在逆转录反应中，需使用逆转录酶、引物和核苷酸等。
逆转录酶能合成第一链cDNA，引物通常采用寡聚dT引物或随机引物。
三、DNA合成和连接在逆转录反应后，需要使用DNA聚合酶和核苷酸进行第二链cDNA的合成。
然后，将合成的cDNA连接到选择的载体上，常见的载体有质粒、噬菌体等。
连接过程一般采用连接酶催化反应。
四、转化和筛选将连接好的载体转化到合适的宿主细胞中，可以通过热冲击法、电穿孔法等方法进行转化。
之后，将转化后的细胞涂在筛选板上，并在含有抗生素的培养基上筛选，筛选出含有目标基因的克隆。
五、鉴定和分析最后，对构建好的cDNA文库进行鉴定和分析。
可以利用限制性内切酶等方法进行单克隆检测和鉴定，也可以通过PCR扩增目标基因进行进一步分析。
结论：构建cDNA文库是一项关键的技术，它为基因组研究提供了丰富的资源。
通过提取总RNA、逆转录反应、DNA合成和连接、转化和筛选，最终可以得到一个具有表达能力的cDNA文库。
这些步骤的顺利进行和准确操作，对于后续的基因组研究具有重要意义。
cdna文库的构建步骤
CDNA文库的构建步骤一、引言在分子生物学和基因组学研究中，建立cDNA文库是一项重要的实验技术。
cDNA文库是从mRNA中合成的互补DNA（cDNA）的集合，它能够反映细胞中mRNA的表达情况。
本文将详细探讨cDNA文库构建的步骤和流程。
二、cDNA文库构建步骤2.1 RNA提取与纯化在构建cDNA文库之前，首先需要提取和纯化所需基因表达的RNA，这是启动构建cDNA文库的关键步骤。
1.准备细胞样本或组织样本。
2.使用适当的方法（例如TriZol法、RNA纯化试剂盒）提取总RNA。
3.通过离心等手段去除DNA和蛋白质等杂质。
4.使用酶切RNA的方法去除rRNA等非编码RNA。
2.2 逆转录合成cDNA逆转录是将RNA转录成cDNA的过程，这是构建cDNA文库的关键步骤之一。
1.准备RNA模板和引物，引物可以是随机引物或特定引物。
2.将RNA样本与引物混合，在特定条件下进行反应。
3.添加逆转录酶（如Reverse Transcriptase），逆转录酶能合成cDNA的互补序列。
4.根据反应体系的要求进行反应，通常涉及温度和时间的控制。
5.利用热敏聚合酶（如Taq DNA Polymerase）可加热光敏不稳定的逆转录酶，从而停止逆转录反应，并保持产物的合成。
2.3 cDNA文库构建cDNA文库的构建涉及PCR扩增、酶切、连接和转化等步骤，下面详细介绍。
2.3.1 PCR扩增1.准备扩增反应液：包括cDNA模板、引物（正向引物和反向引物）、dNTPs和聚合酶等。
2.设置PCR扩增条件，包括温度、循环数和时长等。
3.进行PCR扩增反应，其中cDNA模板将作为DNA合成的起始物，引物将提供扩增的特异性。
2.3.2 酶切1.使用限制性内切酶对扩增产物和载体进行酶切。
2.确定酶切产物的大小和酶切位点。
2.3.3 连接1.准备连接试剂盒和连接系统。
2.混合酶切产物和合适的载体，进行连接反应。
3.控制反应条件，如温度和时间。
cdna文库的构建
cdna文库的构建
首先需要提取出RNA分子的互补DNA（cDNA），然后将其克隆到载体上，形成一个cDNA文库。
具体的步骤如下：
1. RNA提取：从组织或细胞中提取RNA。
2. 逆转录：利用逆转录酶将RNA转变成cDNA。
逆转录酶可以用几种不同的方法，包括反转录PCR方法和反转录特异性引物的方法。
3. 双链cDNA合成：将一端的oligo dT引物与头部的mRNA 低复杂度区域杂合，随后，通过使用逆转录酶(polymerase)来合成第一条链，然后再合成第二条链，以得到双链cDNA。
4. 手工或机器克隆：将cDNA克隆到载体中。
手工克隆使用限制性内切酶和连接酶来插入cDNA，而机器化克隆则使用高通量自动克隆技术。
5. 图书馆筛选：初步筛选文库，以分离包含所需基因的克隆。
6. 验证和测序：最后，通过验证所得克隆的插入片段的尺寸和序列，并使用测序技术对其进行测序。
总的来说，构建cdna文库需要耗费较多的时间和精力，但它
是研究基因表达的重要手段。
对于生物学、医学、农业等领域的研究都具有非常重要的意义。
cdna文库构建过程
cdna文库构建过程
cdna文库构建过程
cdna文库构建是一种从逆转录提取mRNA，并将其转化成可用于克隆的DNA片段的方法，并将其用于测序等分子生物学研究。
下面の流程介绍了cdna文库构建的步骤：
1. 样本准备：收集合适的活菌样本，细胞经过lysis处理，可以获得核酸提取液，用于cdna文库构建。
2. 微小RNA提取：将液体样本经过cDNA合成，利用内源Oligo dT链条的帮助，在rRNA与mRNA之间断开，就可以获得微小RNA。
3. cdna合成：将液体样本经过反转录，也就是mRNA转化为cDNA，就可以获得cdna文库。
4. 再次纯化：将cdna文库经过再次纯化，去除反转录产物及其他污染源，经过QC后，就可以开始克隆。
5. cDNA克隆：将cdna文库再次纯化的片段植入到克隆载体上，就可以获得cDNA克隆文库。
6. 测序：最后将克隆文库经过测序，就可以获得cdna序列，进行进一步的分子生物学研究。
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水稻cosmid文库的构建、鉴定与S5区新克隆的获得
中山大学硕士学位论文水稻cosmid文库的构建、鉴定与S<,5>区姓名：***申请学位级别：硕士专业：遗传学指导教师：***20000501水祸ｃｏｓｍｌｄ史席的构址、惟定’ｊ■Ｋ新兜惭的瓠拊摘要本论文以广亲和品种水稻（ｏＳａｔｉｖａＬ．Ｃｐｓｌｏｌ７）为材料，成功构建了～个高质量的核基因组ｃｏｓｍｉｄ文库，并以此文库为｜＇：Ｌ具分离到一个位于Ｊ。
亲和主效应基因座＆区的新克隆。
在基因组ｃｏｓｍｉｄ文库构建过程中。
采用了几种改进的方法，以提高文库的质量：第一、从水稻黄化苗中提取细胞核，包埋后处理成Ｍｂ级ＤＮＡ，用＾丁部分酶切建库，此法所得ＤＮＡ片段很大，Ｈ般为纯净，ＤＮＡ鼠也相当多。
第二、对建ｃｏｓｍｉｄ文库常用的两种同裂酶进行了比较，发现Ｍｂｏｌ切割水稻基因组ＤＮＡ较Ｓａｕ３ＡＩ随机，所以选用Ｍｂｏｌ进行部分酶切，以获得较好的结果。
用ＰＦＧＥ分部部分酶切产物，网收３３．５ｋｂ一４８５ｋｂ之问的片段，超滤浓缩后连接到载体ＳｕｐｅｒＣｏｓｌ中，包装，转染宿主ＸＬｌ一ＢｌｕｅＭＲ。
第三、将整个文库１０万多个克隆以三种不同方式（每孔一个菌、每孔二个荫和每孔若干个菌１转接入３８４孔板中培养、保存，克服了其他保存方式的弊端，使保存更安全，阳性克隆定位也容易。
（对文库质量进行了较为全面的攀定。
随机挑选１００余个克降，分别用ＥｃｏＲＩ和ｌｖ、ｏｔＩ酶切鉴定，发现有５％的克隆为空载，非空载克隆的平均插入片段近４０ｋｂ，所以整个基因组文库的插入外源总量覆盖水稻单倍体基因组９倍以．Ｊ二。
用水稻根部表达序列Ｒ２３４９（低拷贝）和ＢＡＣ水端２３Ｄｔ２Ｒ（单拷贝）为探针对文库进行筛选，共有２１个阳性信号，说明文库具有良好的代表性。
任意挑选４个克隆连续培养约１００代，分别比较０代与１００代质粒酶切带型，结果显示并无差别，表明ｃｏｓｍｉｄ克隆稳定性较好。
选择并分离了与水稻广‘亲车¨暴风廖。
殳区紧密ｊｆ）ｃ锁的分了标记２３Ｄ１２Ｒ，以其为探针对文库进行初筛、复筛，得到‘阳性克隆Ｒ２１１９，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定了其正确性，并克隆了其左、右末端。
cDNA文库的构建策略及其应用
cDNA文库的构建策略及其应用cDNA文库是一种重要的生物资源，可用于研究基因的表达、结构和功能，以及发现新药靶等。
因此，构建高质量的cDNA文库是生物科学研究中的一项关键任务。
下面将介绍构建cDNA文库的策略及其应用。
构建高质量的cDNA文库是首要任务。
在进行构建之前，需要对实验材料进行严格的筛选和处理，以确保获得的cDNA质量高、重复性高且覆盖面广。
同时，需要根据研究目的选择适当的筛选方法，如杂交筛选、PCR筛选等，以获得所需基因的阳性克隆。
插入片段的大小是影响cDNA文库质量的重要因素之一。
为了获得完整的编码序列，需要优化插入片段的大小。
一般来说，插入片段的大小在5-0 kb之间为最佳，这有助于确保获得完整的功能基因序列。
高效的载体和筛选系统对于构建高质量的cDNA文库同样至关重要。
在选择载体时，需要考虑其容量、复制特性、稳定性等方面，以确保获得的文库具有较高的拷贝数和稳定性。
在筛选系统方面，需要选择灵敏度高、特异性强的筛选方法，以获得阳性克隆并降低假阳性率。
在构建cDNA文库的过程中，需要对其质量进行严格控制。
一般来说，需要进行以下质量控制：检测cDNA的质量和大小、评估文库的随机性、检测重组子的稳定性等。
通过这些质量控制步骤，可以确保获得的cDNA文库质量可靠。
通过比较不同条件下细胞或组织中的cDNA文库，可以研究特定基因在不同条件下的表达情况。
利用基因表达谱技术，可以对表达差异进行定量分析，揭示基因的表达调控机制。
通过对cDNA文库进行高通量筛选，可以发现新的药物作用靶点。
这些靶点可能是新的基因或新的基因变异体，也可能是已知基因的新功能域。
通过研究这些靶点的结构和功能，可以设计和开发新的药物。
通过将正常的cDNA导入病变细胞，可以治疗某些遗传性疾病或癌症。
例如，导入能够表达正常血红蛋白的cDNA可以治疗地中海贫血；导入能够表达抗癌药物的cDNA可以治疗癌症。
这些基因治疗方法需要构建特定的cDNA文库，以便找到适合的治疗方案。
《cDNA文库构建》
基因库是指某一生物群包选取其中任何一个基因克重组体形式贮存起来; ☆ 是理课件
(1)细菌人工染色体(bacterial artificial chromosomes, BACs, fosmids)
基础：大肠杆菌F质粒 导入宿主：电转化 载体筛选：显性选择标记重组筛选：插入片段
大小供体DNA大小：>300kbp主要应用：大基因 组分析评论：低频率的重排和嵌合分子。载体 在每个细胞中维持一个或、噬菌体、粘粒和人工染色体 根据构建过程中是否对克隆进行过全长选择分为
普通cDNA和全长cDNA 依据第一链反转录引物不同分为随机引物c的构建整理课件主要内容
基因的概念及意义 cDNA基因的类型 几种cDNA的介绍 SMAR物类型全部基因的 集合，这些基因以克隆的形式存在（人工构建）。
点和端粒
中不相连的连续片段)；
不稳定(自发缺失)；
很难与酵母染色体分离；
PAC(P1 人工染色体) 细菌噬菌体 P1
100～300kb 稳定，但在细菌外难以维
BAC(细菌人工染色体) F 质粒
300kb
持
MACs(哺乳类人工染色 基于 Epstein-Barr 病 >300kb
体)
毒的游离载体
人类人工游离染色体(human artificial episomal chromosome,HAEC)是一类发展 中的 MACs,它来自于 Epstein-Barr 病毒
整理课件
根据基因类型（重组DNA片段的供体） 基因组 和cDNA1、基因组
★ 基因组(gene library)：用重组DNA
技术，将某种生物细胞的总DNA或染色体DNA切割成一定大 小的片段，并与合适的载体重组后，然后转移到适当的宿主 细胞中，通过细胞增殖而构成各个片段的无性繁殖系（克 隆），这些存在于所有重组P1载体和P1人工染色体(P1 artificial chromosomes, PACs)
cDNA文库构建
cDNA文库构建cDNA文库[原理]：cDNA文库不同于基因组文库，被克隆DNA是从mRNA反转录来源的DNA。
CDNA 组成特点是其中不含有内含子和其他调控序列。
从而做cDNA克隆时应是先从获得mRNA 开始，在此基础上，通过反转录酶作用产生一条与mRNA相互补的DNA链，然后除掉mRNA，以第一条DNA链为模板复制出第二条DNA链（双链）；再进一步把此双链插入原核或真核载体。
cDNA文库的构建分为六个阶段：阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链阶段2：cDNA第二链的合成阶段3：cDNA的甲基化阶段4：接头或衔接子的连接阶段5：Sepharose CL-4B凝胶过滤法分离cDNA阶段6：cDNA与λ噬菌体臂的连接[阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链]1．在置于冰上的无菌微量离心管内混合下列试剂进行cDNA第一链的合成：poly(A)+RNA (1μg/μl) 10μl寡核苷酸引物(1μg/μl) 1μl1mol/L KCl 3.5μl250 mmol/L MgCl22μldNTP溶液（含4种dNTP，每种5mmol/L）10μl0.1 mol/L DTT 2μlRNase抑制剂（选用）25单位加H2O至48μl2．当所有反应组在0℃混合后，取出2.5μl反应液转移到另一个0.5ml微量离心管内。
在这个小规模反应管中加入0.1μl [α-32P] dCTP（400 Ci/mmol, 10mCi/ml）。
3．大规模和小规模反应管都在37℃温育1h。
4．温育接近结束时，在含有同位素的小规模反应管中加入1μl 0.25mol/L EDTA，然后将反应管转移到冰上。
大规模反应管则在70℃温育10 min，然后转移至冰上。
5．参考《分子克隆实验指南》第三版附录8所述方法，测定0.5μl小规模反应物中放射性总活度和可被三氯乙酸（TCA）沉淀的放射性活度。
此外，用合适的DNA分子质量参照物通过碱性琼脂糖凝胶电泳对小规模反应产物进行分析是值得的。
水稻幼叶及幼穗cDNA文库的构建及初步分析
水稻幼叶及幼穗cDNA文库的构建及初步分析
王峰;王金发
【期刊名称】《中山大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2005(044)002
【摘要】为了克隆水稻第6染色体上S5位点的基因及包括广亲和基因在内的重要功能基因,以水稻Oryza sativa L.广亲和品种Cpslo17为材料,以λTriplex2TM 为载体利用SMART技术构建了幼叶和幼穗2种器官的cDNA噬菌体文库.幼叶和幼穗原始文库的克隆数目为别为1.5×105 pfu和2.45×105 pfu,插入片段的大小均在500～3 000 bp之间,文库的阳性克隆子的为别比例为97.0%和98.7%.此文库的建立为克隆广亲和基因和其它重要全长功能基因奠定了基础.
【总页数】4页(P74-77)
【作者】王峰;王金发
【作者单位】中山大学生命科学学院∥基因工程教育部重点实验室,广东,广
州,510275;中山大学生命科学学院∥基因工程教育部重点实验室,广东,广州,510275【正文语种】中文
【中图分类】Q785
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3.西施舌浮游幼虫cDNA文库构建及EST序列初步分析 [J], 郭永明;孟学平
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cdna文库建立流程
cdna文库建立流程cDNA文库组标准流程一. Total RNA的提取 (2)二. mRNA的分离 (5)三．cDNA双链合成 (8)四．载体制备 (11)五. cDNA双链和载体的连接 (13)六．电转化流程 (14)七．快速鉴定、菌落PCR (16)八．pBlueScript cDNA库扩增 (18)一.Total RNA的提取1.试剂配制准备工作：1、研钵、5ml/10ml/ 25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml/100ml容量瓶、药匙、试剂瓶等玻璃制品均用锡纸包裹口部，置于烤箱内,180℃，烤6小时。
2、50ml/1.5ml离心管、枪头等塑料制品用0.1‰DEPC水浸泡过夜后，121℃20mins 高压灭菌。
3、电泳槽及电泳托、梳子用3%双氧水处理。
4、常用试剂及其配方：▲DEPC水：在1000ml去离子水中加入100ul DEPC, 静置过夜后高压灭菌。
▲0.78M柠檬酸纳：PH=4~5三水合柠檬酸纳22.94g加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。
▲10%肌氨酸钠：肌氨酸钠10g加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。
▲变性裂解液：0.78M柠檬酸钠8.25ml10%肌氨酸钠12.375ml异硫氰酸胍118.05g加DEPC水定容至250ml，室温放置备用临用前加β-巯基乙醇使其终浓度为1%（v/v）▲2M 醋酸钠PH=4.5NaAc·3H2O 13.6g加DEPC水定容至50ml,高压灭菌，室温放置备用▲3M醋酸钠PH=5NaAc·3H2O 20.4g加DEPC水定容至50ml,高压灭菌，室温放置备用▲4M LiCL: LiCL 24.164g加DEPC水定容至100ml,高压灭菌，室温放置备用▲0.5M EDTA PH=8.0EDTA 18.61g用NaOH调PH值至8.0，定容到100ml，高压灭菌，室温放置备用▲10X MOPS (3-（N-吗啉代）丙磺酸):MOPS 41.86gNaAC·3H2O 4.10g0.5MEDTA（PH 8.0）20ml用NaOH调PH值 6.5 , DEPC水定容到1L，室温避光放置备用。
cDNA文库的构建方法与原理
c D N A文库的构建方法与原理蛋白质是细胞的功能分子：它们构成结构和调控分子，动力和泵蛋白，酶和受体。
然而，如果仅用传统的生化方法确定某一特异蛋白的全序列，或制备足够量的蛋白进行操作和鉴定都是使人厌烦且昂贵的步骤。
基因克隆和遗传工程对生化领域有很大贡献。
如果只限于将基因组DNA作为材料来源，由于其中仅2%被认为可能编码蛋白质，那么确定蛋白质序列仍然是令人生畏的工作。
其他部分包括结构和调节因子、内含子、非编译外显子和重复及功能未知的非编码序列。
如果分析仅局限在编码序列，那么确定基因产物序列所需的努力就会大大的降低。
因此分子生物学主要原则之一是mRNA作为蛋白质合成的模板，所以mRNA是确定蛋白质序列的理想底物。
不幸的是，现有通用的克隆载体没有一个能容纳mRNA分子作为插入片段。
因此，产生表达序列文库的一个基本步骤是将mRNA分子转变成双链DNA。
来自mRNA分子的DNA拷贝称cDNA，由来自细胞或组织mRNA种类的DNA拷贝组成的文库称为cDNA文库。
1．基本原理cDNA（Complementary DNA）是以mRNA为模板，在反转录酶作用下合成的互补DNA，它的顺序可代表mRNA序列。
cDNA文库的构建是指将cDNA与克隆载体DNA体外重组，然后去转化克隆载体DNA 的宿主细胞，从而得到一群含重组DNA的细菌或噬菌体克隆的过程。
这些序列来自并代表一定组织或细胞类型特定发育或分化阶段的整个mRNA群体。
其过程可概括为：（1）通过反转录酶将各种mRNA转变在cDNA；（2）cDNA与合适的载体重组并导入到宿主中。
cDNA基因文库具有许多优点和特殊用途：首先，cDNA克隆以mRNA为起始材料，这对于有些RNA病毒来说非常适用，因为它们的增殖并不经过DNA中间体，研究这样的生物有机体，cDNA克隆是唯一可行的方法。
第二，cDNA基因文库的筛选简单易行，恰当选择mRNA的来源，使所构建的cDNA基因文库中，某一特定序列的克隆达到很高的比例，简化了筛选特定基因序列克隆的工作量。
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为利 用水 稻贮 藏蛋 白抗体 筛 选 相 应 的 贮 藏 蛋
白 1
1
.
c
DN A
克隆
研 究贮藏 蛋 白 基 因的 结构 及 基 因表达 调 控 机制 奠 定 基 础
材料 和方 法
1
材料 水 稻 品 种 黑 糯 开花 后
7一
e
4 天 的 小 穗 ( 由 广 东 省 农 科 院提 供 ) 1
r
。
A M V逆
中 山 大学 学报 ( 自然科学 ) 论丛 〔1 8 〕 第 第
4 8
卷
S U P P L E ME N T 二 T O NA T U R A L IU M
T H E
ACT A
SC IE NT IA R U M S U N Y A T S E N I 〔1 8 〕
V
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8
期 ( 1 9 8 9年 )
2 8
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公司 )
P
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所 以 只 有 了 解 贮藏蛋 白 基 因 的 结构 及 基 因 表达 调 控 机 制
,
、
上对农 作物 的 营养 品 质 进行 改 良
c
D NA
,
克隆
,
是 目前 分离 基 因 常 用
有效 的 途 径 之 一 〔
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本 文采 用表 达 型 载 休
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以 及 其 它 酶制
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e
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织 细 胞 裂 解物
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体外 翻 译 产 物
1 4
U N I V E R SI T A T I S
沁
4
( 19 89)
实验 技术
水 稻 小穗
c
DNA文 库 的构 建
吴 新祀
摘 要
,
*
李等等
刘 良式
用蛋 白酶 K 苯 酚 法
一
,
4 天 的 水稻 小穗 从开 花后 7 ~ 1
一
的 总 抽 提 纯 化出 有 生 物 学 活 性王
DN A E
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S D S 一 聚 丙 烯 酞胺 凝 胶 电 泳
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干 燥 凝 胶 进 行 放 射 自显 影
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噬 菌 体纯 化 和 O N A制 备
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参照 M
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双 链 c O N A的 合 成
参照 第
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方法
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链c D NA的合成
十
R N A 的制 备
,
取20 9 水稻 小穗
本文 1 9 8 9 年
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t 按 Ba r e
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”
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方 法 提取 总核 酸
,
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丙 醇 沉 淀
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月
6
日收 到
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广东省科委资助项 目
李宝健教授指 导部分工 作
第
4
期
李蓄着等
离 心 2 0分 钟 , l
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用 1 0召9 P o l
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R N A
作模 板
,
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(
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32
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小时
。
煮
1
.
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.
合成
9
。
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(A )
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,
在
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,
逆转录酶作用下 合成双链
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,
将 它反 转录 合成 第一链 c
c
并在 D N
R I
A
聚
合酶 1 和 核酸酶 S I 作用 下
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6
DN A
。
D N A DN A
连接
,
经离体 包 装构建出水稻开花后小穗
.
5即1 2 又
“, 〔 , , ,
具 有 明 显 的 组织 特 异 性 和 发 育 时 期 特 异 性 〔
’
,
因而贮
.
提 供 了 一个 研 究高 等植物 基 因 表 达与 调 控 的 良好 模 型
,
贮藏
直 接 影 响 贮 藏 蛋 白的 积 累 和 某 些重 要 的 粮 食作 物 种 子 蛋 白 质 的 营养价 才 能 做 到 在 分 子 水平
DN A
该文 库 的 复 杂
度为
2
.
4
x
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重 组 体 的 比 率为 1 4 %
Po l y
关键 词
水稻
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十
R N A
,
纯化
,
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D N A 文 库构建
,
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种 子 贮藏 蛋 白 基 因 的 表达 藏蛋 白 基 因 表 达 调 控 系统 蛋 白基 因的 表 达 值
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, ,
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ly
a o
(A )
A
e
R N A 纯 化 参照 M H 4 s R N A
. .
ia tis
,
“’ 〔
方法
收 集低 盐溶液 洗脱 峰
400 oo
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加 入 1 / 1 0 体积
1
N
o
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)和
2
倍 体积 乙醇