蛋白质结构分析技术ppt课件
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蛋白质结构PPT课件
R1
R2
R3
R4
Rn
H2NCHCONHCHCONHCHCONHCHCO………NHC HCOOH
• 肽链，氨基酸残基, 主链，侧链
• N—末端：含有自由氨基的一端，书写用H表示；
• C—末端：含有自由羧基的一端，书写用OH表示；
一、蛋白质的一级结构
1、肽的一般概念
➢二硫键：是由二个半胱氨酸残基的侧链 之间形成的。即胱氨酸的残基中的二硫键
白质的方式； 蛋白质的结构层次：
一级结构→二级结构→超二级结构→结构域 →三级结构→四级结构
一、蛋白质的一级结构
一、蛋白质的一级结构
1、肽的一般概念
肽：是一个氨基酸的α-羧基和另一个氨基酸分子的α氨基之间脱去一分子水而通过肽键连接成的化合物。
肽键：一个氨基酸的α-羧基和另一个氨基酸分子的α氨基缩合是区水而形成的酰胺键。
➢ 1.样品必需纯（>97%以上）。 ➢ 2.知道蛋白质的分子量。 ➢ 3.知道蛋白质由几个亚基组成。 ➢ 4.测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量
计算每种氨基酸的个数。 ➢ 5.测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。
4、蛋白质一级结构的测定
Sanger法氨基酸序列测定的大体步骤为： （一）蛋白质亚基数目的确定及其拆分 （二）多肽链的局部断裂和肽段的分离 （三）各个肽段氨基酸序列的测定 （四）氨基酸完整序列的拼接 （五）多肽链中二硫键位置的确定
N-末端第六位Glu→Val）.
4、蛋白质一级结构的测定
世界上第一个氨基酸序列 的测定是，1953年由Sanger 完成，他用10年的时间测定 了含有51个氨基酸残基的牛 胰岛素。
我国1965年在世界上第 一个用化学方法人工合成 的蛋白质就是这种牛胰岛 素。
第三节蛋白质的结构(共92张PPT)
②测定蛋白质分子中多肽链的数目：通过测 定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子 量之间的关系，即可确定多肽链的数目。
③二硫键的断裂：几条多肽链通过二硫键交 联在一起。可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍 存在下，用过量的 -巯基乙醇处理，使二硫 键复原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成 的巯基，以防止它重新被氧化。可以通过参 加盐酸胍方法解离多肽链之间的非共价力； 应用过甲酸氧化法或巯基复原法拆分多肽链 间的二硫键。
由多个亚基聚集而成的蛋白质常常称为寡聚蛋白； 肽键具有局部双键性质，不能自由旋转。
在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活 氨基酸2和3之肽键可自由的与水形成氢键
In the α helix, the CO group of residue n forms a hydrogen bond with the NH group of residue n + 4.
成的化合物称为肽。 〔3〕多肽链内或链间二硫键的数目和位置。
因此平均相对分子质量接近128。 a 盐键 b 氢键 c 疏水相互作用 d 范德华力 e 二硫键
由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由多个 第二套肽段 ＨＯ ＷＴＯＵ ＳＥＯ ＶＥＲＬ ＡＰＳ
溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。 应用过甲酸氧化法或巯基复原法拆分多肽链间的二硫键。
肽键C-N的局部双键性质其键长小于胺中的CN
从Cα沿键轴方向观察 顺时针旋转的Φ和Ψ角度为正值〔+〕
逆时针旋转的为负值〔—〕
不可能的空间构象
〔三〕肽的性质
肽的化学反响与氨基酸一样，游离的 α氨基﹑α-羧基﹑R基团可发生与氨基酸 中相应基团类似的反响；
含有两个以上肽键的化合物在碱性溶液 中与Cu2+生成紫红色到蓝紫色的络合 物，称为双缩脲反响，可以测定多肽和 蛋白质含量。
蛋白质—蛋白质的分子结构(生物化学课件)
一、 -螺旋
结构要点：
(1)肽键平面为单位,以-碳原子为转折盘旋形成右 手螺旋，螺旋的每圈有3.6个氨基酸，螺旋间距离 为0.54nm，每个残基沿轴旋转100，上升0.15nm
(2)主链原子构成螺旋的主体,侧链在其外部，直径 约为0.5nm
-螺旋
左、右手螺旋
(3)每个肽键的羰基氧与远在第四个氨基 酸氨基上的氢形成氢键(共形成n-4个氢 键)，所有肽键都能参与链内氢键的形成， 氢键的方向与中心轴大致平行, 是稳定 螺旋的主要作用力
蛋白质最重要的性质之一
血红蛋白的四级结构
蛋白质的一级结构
一概
念
二 结构特点
蛋白质的分 子结构
一级结构 二级结构 三级结构 四级结构
——基本结构 空间结构
一、概念：
蛋白质的一级结构
蛋白质的一级结构是指蛋白 质多肽链中氨基酸的排列顺序， 也叫初级结构或基本结构。一级 结构的主要连接键是肽键，通常 将二硫键也归属于一级结构。
3.613 (SN)
(4)Pro的N上缺少H，不能形成氢键，经 常出现在-螺旋的端头，它改变多肽链的 方向并终止螺旋
二、-折叠
β-折叠是由两条或多条伸展的多肽链靠氢键联结而成的锯齿状片状结 构。
侧链基团与Cα间的键几乎垂直于折叠平面，R基团交替地分布于片层 平面两侧。
β-折叠分平行式和反平行式，后者更为稳定。
蛋白质的四级结构是指亚基的种类、数量以及各个亚基在寡聚蛋 白质中的空间排布和亚基间的相互作用。
蛋白质的四级结构
二、四级结构的特点: • 亚基单独存在时无生物活性，只有相互聚合成特定构象时才具有完
整的生物活性 • 亚基之间以非共价键结合，容易彼此解离 • 大多数寡聚蛋白质分子的亚基的排列是对称的，对称性是四级结构
蛋白质的结构与功能ppt课件(完整版)全文
• 氨基酸残基(residue) :肽链中的氨基酸分 子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基 酸残基。
* 两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨 基酸缩合则形成三肽……
* 由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡 肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相 连形成的肽称多肽(polypeptide)。
* 多肽链(polypeptide chain)是指许多 氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。
3）运动与支持
机体的结构蛋白：头发、骨骼、牙齿、肌肉等
4）参与运输贮存的作用
血红蛋白 ——运输氧 铜蓝蛋白 ——运输铜 铁蛋白 ——贮存铁
5）免疫保护作用
抗原抗体反应 凝血机制
6）参与细胞间信息传递
信号传导中的受体、信息分子等
7） 氧化供能Βιβλιοθήκη 第一节蛋白质的分子组成
The Molecular Component of Protein
4. 无规卷曲
无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部 分肽链结构。
（三）模体(motif)
在许多蛋白质分子 中，可发现二个或三个 具有二级结构的肽段， 在空间上相互接近，形 成一个特殊的空间构象， 被称为模体
钙结合蛋白中 结合钙离子的模体
锌指结构
螺旋－折叠－折叠 2个His和2个Cys 与Zn离子结合 螺旋区 与 DNA 结合
子，占人体干重的45％，某些组织含量更 高，例如脾、肺及横纹肌等高达80％。
大事记：
1833年 Payen和Persoz分离出淀粉酶。 1864年 Hoppe-Seyler从血液分离出血红蛋
白，并将其制成结晶。 19世纪末 Fischer证明蛋白质是由氨基酸组成
的，并将氨基酸合成了多种短肽 。 1938年 德国化学家Gerardus J. Mulder引用
* 两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨 基酸缩合则形成三肽……
* 由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡 肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相 连形成的肽称多肽(polypeptide)。
* 多肽链(polypeptide chain)是指许多 氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。
3）运动与支持
机体的结构蛋白：头发、骨骼、牙齿、肌肉等
4）参与运输贮存的作用
血红蛋白 ——运输氧 铜蓝蛋白 ——运输铜 铁蛋白 ——贮存铁
5）免疫保护作用
抗原抗体反应 凝血机制
6）参与细胞间信息传递
信号传导中的受体、信息分子等
7） 氧化供能Βιβλιοθήκη 第一节蛋白质的分子组成
The Molecular Component of Protein
4. 无规卷曲
无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部 分肽链结构。
（三）模体(motif)
在许多蛋白质分子 中，可发现二个或三个 具有二级结构的肽段， 在空间上相互接近，形 成一个特殊的空间构象， 被称为模体
钙结合蛋白中 结合钙离子的模体
锌指结构
螺旋－折叠－折叠 2个His和2个Cys 与Zn离子结合 螺旋区 与 DNA 结合
子，占人体干重的45％，某些组织含量更 高，例如脾、肺及横纹肌等高达80％。
大事记：
1833年 Payen和Persoz分离出淀粉酶。 1864年 Hoppe-Seyler从血液分离出血红蛋
白，并将其制成结晶。 19世纪末 Fischer证明蛋白质是由氨基酸组成
的，并将氨基酸合成了多种短肽 。 1938年 德国化学家Gerardus J. Mulder引用
蛋白质结构解析课件
亚基结构
某些蛋白质由多个亚基组成，每个亚 基具有独立的三级结构。
PART 02
蛋白质结构解析方法
X射线晶体学
X射线晶体学是解析蛋白质结构的主要方法之一，通过分析X射线在晶体中的衍射， 可以获得蛋白质分子的三维结构信息。
X射线晶体学适用于蛋白质大分子，尤其是膜蛋白和复合物蛋白的结构解析，能够提 供高分辨率的结构信息。
酶的结构解析
酶的结构包括一级、二级、三级和四级结构，其中一 级结构是指氨基酸的排列顺序，二级结构是指肽链的 折叠方式，三级结构是指整条肽链的三维构象，四级 结构是指多亚基酶蛋白的组合方式。
单击此处添加正文，文字是您思想的提一一二三四五 六七八九一二三四五六七八九一二三四五六七八九文， 单击此处添加正文，文字是您思想的提炼，为了最终 呈现发布的良好效果单击此4*25}
变构效应
蛋白质的变构效应是指蛋白质在与其配体或效应物结合后， 其空间构象发生改变，进而影响其功能的过程。这种效应通 常是由蛋白质中的特定氨基酸残基与配体或效应物的相互作 用所引起的。
变构效应的意义
变构效应在生物体内具有重要的意义，它可以帮助生物体快 速适应环境变化，并调节各种生理过程。例如，某些激素可 以通过变构效应调节靶蛋白的活性，从而影响细胞内的信号 转导过程。
作用具有重要意义。
核磁共振技术解析蛋白质结构的难点在 于信号解析和数据处理，需要专业的技
术和经验。
电子显微镜技术
电子显微镜技术是解析蛋白质结构的重要手段之一，通过观察蛋白质颗 粒的形貌和排列，可以获得蛋白质大分子和复合物的结构信息。
电子显微镜技术适用于观察蛋白质颗粒和病毒等大分子结构，能够提供 高分辨率的形貌信息，对于研究蛋白质的功能和相互作用具有重要意义。
第九章 蛋白质结构分析
全β-折叠蛋白质
人晶状体蛋白(上图c, d)和大肠杆菌NANC离子通道蛋白(下图f)
a-螺旋/β-折叠蛋白质
细胞表面标志蛋白CD98(图d)及糖酵解的绝大多数酶蛋白 (图a)
a-螺旋+β-折叠类蛋白质
人TBP与双螺旋DNA复合物(1CDW.pdb)
（四）四级结构的主要类型和特征
有独立三级结构的单元通过非共价键聚集成的非共价 复合物称为四级结构，其所含独立三级结构单位为亚 基(subunit)。形成四级结构全部依靠非共价键相互 作用，且来自不同亚基的二级结构间可发生强的相互 作用以稳定四级结构，如生成跨亚基的更大β折叠结 构或α螺旋聚集体；其中，氢键、疏水相互作用和静 电作用是主要维持力。为了形成稳定的四级结构，必 然要求相互作用的任两个蛋白质间在空间外形互补以 增加接触面且理化性质互补。这些特征也是预测蛋白 质间相互作用时有用的辅助判据。
（1）主链骨架围绕中心轴盘绕形成右手螺旋； （2）螺旋每上升一圈是3.6个氨基酸残基，螺距为 0.54nm； （3）相邻螺旋圈之间形成许多氢键； （4）侧链基团位于螺旋的外侧。
2. β折叠(βsheets) 的结构特征为：
（1）若干条肽链或肽段平行或反平行排列成片； （2）所有肽键的C=O和N—H形成链间氢键； （3）侧链基团分别交替位于片层的上、下方。
3. 蛋白质三级结构中二级结构的折叠和组装
按二级结构组装模式对蛋白质进行分类对解析蛋 白质高级结构形成规律和预测蛋白质功能有重要 帮助。蛋白质二级结构组装模式主要是全α螺旋 、全β折叠、α螺旋/β折叠，还有少量α螺旋+β 折叠类。
全a-螺旋蛋白质
人血清白蛋白(上图a,b)和细菌视紫红质(下图 a-c)
人细胞珠蛋白(2DC3.pdb)的第121到140位残基 对应的a-螺旋侧面和顶部(N端)视图
第二章蛋白质化学蛋白质的结构(共67张PPT)
肽键为一平面
相邻的a碳原子呈反式构型
3、肽的命名及结构
• 1、根据所含AA数目：二肽、三肽、四肽等 • 2、根据来源和功能：如，脑啡肽、短杆菌肽S等。 • 3、肽结构：自然界中存在的肽有开链式结构和
环状结构。环状结构中没有游离的氨基末端和 游离的羧基末端，微生物中常见，如，短杆菌 肽S 。
4、多肽链的表达式
〔1〕组成蛋白质的多肽链数目； 2、根据来源和功能：如，脑啡肽、短杆菌肽S等。
2、亚基间呈特定的三维空间排布，依赖次级键维持其结构稳定 ．
〔2〕多肽链的氨基酸顺序； 3、蛋白质分子中亚基可相同，也可不相同。
常用的有巯基乙醇(mercaptoethanol) 、巯基乙酸(mercaptoacetic acid) 、二硫苏糖醇(dithiothreitol, DTT)等。 硼氢化锂〔LiBH4〕
2H2O
GSSG
NADP+
GSH复原酶
NADPH+H+
2. 多肽类激素及神经肽
• 体内许多激素属寡肽或多肽
• 神经肽(neuropeptide)
(三)蛋白质一级结构的测定
要求
• 样品必须是均一的。纯度在>97%以上 • 知道蛋白质的相对分子质量
• (1)组成蛋白质的多肽链数目 (2)多肽链的氨基酸种类、数目及排列顺序; (3)多肽链内或链间二硫键的数目和位置。 ★其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白 质高级结构及其生物功能的根底。
化学裂解法
溴化氰法〔CNBr〕:特异性水解对Met羧基形成的 肽键 羟胺法:羟胺专一裂解Asn-Gly的肽键，酸性条件下 裂解Asn-Pro肽键。
酶水解法〔专一性高，水解产率高〕
胰蛋白酶: 胰凝乳蛋白酶〔糜蛋白酶〕: 胃蛋白酶:
《蛋白质结构》PPT课件 (2)
• 具有手性：右手扭曲 (right-handed twist)
3. β-迂回（β- meander）: • 三个以上相邻β-sheet通过短链连接形成
三个
四个
（β-meander） （希腊钥匙）
五个 （双希腊钥匙）
4. β- 折叠筒
(β- sheet barre l)：
(1)印第安花蓝： 如 木瓜蛋
白酶
(2)希腊钥匙： 如 胰凝乳
蛋白酶
(3)闪电结构 如 磷酸丙糖异构
5. -helix-β-turn - -helix：
• 如某些噬菌体的阻遏 蛋白分子中的操纵子 结合部位； Cu-Zn SOD； 木瓜蛋白酶； 胰凝乳蛋白酶等
• 是蛋白质与DNA相互作 用的主要方式之一
-helix-β-turn- -helix
• 非典型-螺旋： N-H···O三原子不在
一条线且距离较远，常 出现在-螺旋末端。溶 菌酶、胰岛素、肌红蛋 白等
2 γ-系螺旋：
H O
- N [ CH R - CO - NH ]n CH R - C -
• 环内原子数: N=3n+5 ( n = 1, 2, 3 ……) • 代表: γ-螺旋 (5.117-helix)
第五节 结构域
一 概念：多肽链在二级结构或超二级结构基础上形成的三
级结构局部折叠区，为紧密球体，是相对独立的结构、功 能和折叠单元。
二 结构域的特性：
1. 结构域的大小: 40aa~400aa, 平均100~200aa 2. 结合方式：或单一短链相连，或大面积接触 3. 结构域与功能域 4. 结构域通常是一个折叠单元 5. 结构域的运动
Φ=00，ψ=00 多肽主链构象
二 Ramachandran 图(拉氏图， map)
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It works by cleaving the N-terminal AA off and leaving the rest of the peptide intact. The Edman method can be repeated on the peptide remaining after the reaction, so this is a very effective method for obtaining AA sequence information. In fact the whole sequence of a peptide containing many AAs can be determined by Edman method.
降解反应分三步
1. 偶联 PITC的异硫氰酸酯基与蛋白的 自由－氨基作用，产生苯氨基硫甲酰蛋 白质。 2. 裂解 PTC－蛋白质在无水条件下酸裂 解，切下反应的那个残基，暴露出下一 个自由－氨基。 3. 转化 ATZ－氨基酸不稳定，在三氟乙 酸水溶液条件下，转化成稳定的PTH－氨 基酸。 4. PTH－氨基酸的鉴定 薄层层析，HPLC, GC(气相色谱），质谱分析等。
质谱仪组成： 离子源，质量分析器，检测器
一. MALDI – MS
电离基本原理： 将分析物分散在基质分子中
并形成晶体。激光照射晶体时，使基质晶 体升华，基质和分析物膨胀并进入气相。
The MALDI instrument is a matrix assisted laser desorption ionisation - time-of-flight （TOF) mass spectrometer，specifically for high throughput mass mapping of peptide digest fragments originating from proteins excised from 2D-gels i.e. proteomics.
Cleavage Cyclization Released ATH-AA
第二节 生物质谱技术
Mass Spectrometry (MS)
软电离技术：
是带电原子，分子
或分子碎片按质荷比(m/z)的大小顺序排列的图谱。 离子化过程中不会破坏分子结构
电喷雾电离（ESI ) (Fenn et al. 1989) 基质辅助激光解析电离（MALDI) (Karas and Hillenkamp,1998)
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蛋白质结构分析技术
• • • • • •
蛋白质的氨基酸序列分析 生物质谱 X-射线晶体衍射技术 核磁共振 溶液中蛋白质分子构象的研究方法 蛋白质组
Synopsis:
第一节 蛋白质和多肽的 氨基酸序列分析
1. A practical approach to determining amino acid sequence requires a method to remove one amino acid at a time from a polypeptide chain. 2. This is achieved by the use of phenylisothiocyanate（异 硫氰酸苯酯）as the N-terminal labelling reagent, the Edman method. 3. This technique can only deal with chains of 20 to 60 amino acids, and most proteins are much larger. 4. To complete the process, selective hydrolysis of the polypeptide chain cuts very long polypeptides into specific fragments of more manageable size.
原理
化学试剂与蛋白质和多肽的羧基反应， 反应后的C末端衍生物被切割下来，通 过HPLC系统进行分析。
步骤 1. 活化 2. 酰胺化保护侧链羧基 3. 烷基化 4. 修饰Thr和Ser的羟基 5. 裂解和衍生
Protein-COOH
1 time
Alkylation
Protein-TH
Protein-ATH
一. N端序列分析
Sanger was the first person to determine a protein sequence, for insulin in 1953. The problem: after labelling the N-terminal amino acid, the polypeptide chain must be hydrolysed to isolate and identify the labelled amino acid. What's needed is a way to remove the first amino acid without having to hydrolyze the whole chain. This was solved by Per Edman, in Sweden in 1956, by using the reagent phenylisothiocyanate to label the N-terminal end of the polypeptide sample.
蛋白序列仪 最早，很少用 2. 固相序列分析仪 有些氨基酸不能正确测定 3. 气相顺序仪 灵敏度很高，降低费用 4. 新型蛋白测序仪 快速可靠，高自动化
二. C端序列分析 适用
1. 2. 3. 4. 鉴定重组蛋白是否正确表达 大规模生产时质量控制 N端封闭蛋白的分析 DNA探针的设计
1. MALDI离子源 电离技术的关键----基质的使用 基质的作用：样品离子形成过程中充当 质子化或去质子化试剂，使样品分子带 上正电荷或负电荷。 常用基质： SA(芥子酸） DHB(龙胆酸） CCA(a-氰基-4-羟基肉桂酸）