第七章 植物基因工程的目的基因

化学农药长期使用使病原体逐步产生抗性。
2、利用基因工程培育抗病虫品种的优点
抗性资源非常丰富； 抗性具有连续性和整体性； 育种周期短、成本低； 育成品种具有不污染环境及抗病虫害物质不易被环
境因素所破坏；
二、Bt基因及其应用
1、 Bt基因的作用原理
苏云金杆菌产生的由一种或多种蛋白组成，具有高度 特异性杀虫活性的蛋白。又称 －内毒素或杀虫结晶 蛋白（IPC).
因和其它类型的抗虫基因。
二、 蛋白酶抑制剂基因及其应用
蛋白酶抑制剂是一类蛋白质，在大多数植物的种子和块 茎中，其含量可高达总蛋白的1－10％。
1、抗虫原理： 蛋白酶抑制剂与昆虫消化道内蛋白消化酶相结合，形成 酶抑制剂复合物，阻断或减弱蛋白酶对外源蛋白质的水 解作用，导致蛋白质不能被正常消化；酶抑制剂复合物 能刺激昆虫过量分泌消化酶，使昆虫产生厌食；蛋白酶 抑制剂可通过消化道进入昆虫淋巴系统，干扰昆虫的蜕 皮过程和免疫功能，使昆虫不能正常发育。
IPC通常以原毒素形式存在，当昆虫取食IPC后，在 昆虫的消化道内，原毒素被活化，活化的IPC能与昆 虫肠道上皮细胞上面的特异性蛋白结合。结合以后的 IPC全部或部分嵌合于细胞膜中，使细胞膜产生一些 孔道，从而导致细胞由于渗透平衡被破坏而破裂。昆 虫幼虫将停止进食，最终死亡。
2、IPC的分类
IPC划分为四种类型： 类型I：具有抗鳞翅目昆虫的活性； 类型II：抗鳞翅目和双翅目昆虫； 类型III：抗鞘翅目昆虫； 类型IV：抗双翅目昆虫。
2、抗虫原理
植物凝集素主要存在于细胞的蛋白粒中，当被昆虫取 食后，外源凝集素在昆虫的消化道中与肠道食膜上的 糖蛋白相结合，从而影响营养的吸收，同时，凝集素 还可能在昆虫的消化道内促进消化道中的细菌繁殖， 达到杀虫目的。
3、应用
目前，豌豆凝集素、麦胚凝集素褐雪花凝集素等植 物凝集素的编码基因已经分离获得，并被成功导入 烟草、莴苣、玉米等植物中；
第七章 植物基因工程的目的基因
第一节 抗植物虫害基因及其利用 第二节 抗植物病毒基因及其利用 第三节 抗植物真菌病害基因及其利用 第四节 抗非生物胁迫基因及其利用 第五节 改善作物品质的基因及其利用 第六节 雄性不育的基因及其利用
第一节 抗植物虫害基因
一、概述
据Oerke等（1994）统计全球粮食总产量每年因虫 害造成的损失达14％。
3、蛋白酶抑制剂基因的应用
目前在植物抗虫基因工程中应用广泛且研究比较深入 的蛋白酶抑制剂基因重要是：cpti基因、pi－II基因和 水稻巯基蛋白酶抑制剂基因。
利用cpti基因转化烟草、水稻、油菜、白薯、苹果和杨 树等，另外用pi－II和水稻巯基蛋白酶抑制剂基因转化 烟草。
优点：蛋白酶抑制剂基因抗虫谱广泛。 问题：在转基因植物中的表达水平。
抗稻瘟病转溶菌酶基因
植物防卫反应主要表现
1）增强细胞壁结构 富含羟脯氨酸糖蛋白褐富含甘氨酸蛋白，两种蛋
白增加可巩固细胞壁的结构； 木质素可抵抗微生物的降解，在植物受病原体侵
染时合成增加，可增强细胞壁的强度。 2）诱导产生或激活抗菌物质 硫堇； 植物抗毒素，如类黄酮、类萜； 几丁质酶和 －1，3－葡聚糖酶； 抗病蛋白（PR）、植物凝集素等；
转抗草丁膦水稻
一、耐除草剂基因及其应用
1、概述
美国每年用在除草剂上的费用大约是50亿美元； 除草剂的应用取决于作物对除草剂的敏感性、杂草
的性质和施用除草剂的费用； 传统解决除草剂对作物伤害的途径：
1）应用对作物伤害小的除草剂和施用方法； 2）通过杂交育种方法，把和栽培作物亲缘关系近 的野生植物的对除草剂的抗性引入到栽培品种中。
RIP选择性作用于60S核糖体大亚基，抑制肽链衍伸 不同的RIP分别对病毒、真菌和昆虫具有不同的抗性
应用： 目前，在大麦、玉米、水稻等作物中均分离到RIP基因 单基因பைடு நூலகம்化其它作物； RIP和几丁质酶基因、葡聚糖酶基因组成多价体协同转
化作物；
第三节 抗非生物胁迫基因
包括两部分：耐除草剂基因和其它非生物胁迫 基因
Monsanto公司的kishore等（1995）从E.coli中分离出一 个对草甘膦具有相当强耐性的EPSPS的突变体－SM-1， 其对草甘膦的耐性提高了800倍，其原因是编码草甘膦 基因的一个氨基酸序列发生了改变。
4、除草剂的降解和解毒基因及应用
和靶位点突变抗性相比，其特点是： 1) 降解抗性可能涉及多于一种基因或物质参与， 分离基因困难； 2) 靶位点突变抗性可能会使作物大幅度减产，二 降解抗性产生的负面效应小得多； 3）降解系统产生的抗性专一性很强，效率很高。
一、几丁质酶和β－1，3葡聚糖酶基因
1、作用原理
几丁质酶存在于植物和微生物中，为单基因所编码， 具有降解几丁质的作用。病原真菌细胞壁中几丁质的 降解，不仅破坏细胞新物质的沉积，致使病原体死亡， 而且产生的细胞壁碎片具有诱导物作用，刺激寄主植 物产生抗病反应。几丁质酶活性的增强也往往伴随着 －1，3－葡聚糖酶及其他抗病PR蛋白的形成，共同发 挥植物的防卫作用。
3）阿特拉津：是三嗪除草剂的主要代表，主要作用是 抑制植物叶绿体的光合作用。
4）磺酰脲类除草剂：它是通过抑制支链氨基酸合成过 程中的一个关键酶－乙酰乳酸合成酶（ALS）来表现其 除草剂作用。
3、靶蛋白抗性基因及其应用
抗EPSPS抑制剂基因
两种策略：1）EPSPS的过量产生； 2）应用编码点突变的靶蛋白基因。
2、蛋白酶抑制剂的分类
植物中存在三类蛋白酶抑制剂： 丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶
抑制剂，其中丝氨酸蛋白酶抑制剂与抗虫关系密切。 丝氨酸蛋白酶抑制剂有6个家族，其中豇豆胰蛋白酶抑
制剂（CpT1）和马铃薯蛋白酶抑制剂II（Pi－II)的抗虫 效果最为理想。 巯基蛋白酶抑制剂对于利用巯基蛋白酶消化植物蛋白的 昆虫有特殊抗性。目前，对水稻巯基蛋白酶抑制剂的研 究日趋活跃，发现其对许多害虫的肠道消化酶具有明显 的抑制作用。
三、植物凝集素基因及其应用
1、植物凝集素的基本特性 植物凝集素是非免疫来源的糖蛋白或结合糖的蛋白质，
它们能凝集细胞和（或）沉淀糖蛋白。 凝集素广泛存在于植物界，在各种组织器官中均有发
现，尤以豆科植物种子中含量最为丰富。 雪花莲凝集素对于蚜虫、叶蝉、稻褐飞虱等同翅目吸
食性害虫具有极强的毒性。
乙酰CoA转移酶基因
乙酰CoA转移酶具有使除草剂草丁膦代谢失活的作用。 其作用机制在于在乙酰CoA存在的情况下，乙酰CoA转 移酶催化乙酰CoA与草甘膦的游离氨基结合，使L－草 丁膦转变为乙酰－L－草丁膦，从而失去除草剂活性。
水解酶基因
水解酶在利用基因工程获得除草剂抗性方面使一类极 好的酶。Stalker等（1991）从土壤中分离出溴苯腈的 降解基因，该酶能够完全把溴苯腈转变为无活性产物， 将该基因导入烟草，使烟草获得高水平的溴苯腈抗性。
二、抗其他非生物胁迫基因
一）概述
向植物导入抗这类逆境胁迫的基因有两类： 第一类基因编码产物是在植物的抗性中直接起保护作
用的蛋白质。这些蛋白分为五种： 1）合成渗透调节物质的关键酶类，如脯氨酸合成酶 2）具有解毒作用的酶类，如SOD； 3）保护生物大分子及膜结构的蛋白质，如抗冻蛋白 4）具保护作用的蛋白酶类； 5）水通道蛋白；
2）引入酶或酶系统，在除草剂发生作用前将其降解或 解毒。
2、几种主要除草剂及其作用机理
1）草甘膦：是一种广谱、非选择性的有机磷类除草 剂。它可以特异性地抑制植物和细菌中莽草酸羟基乙 烯转移酶（EPSPS)的活性达到除草作用。
2）草丁膦：是有机磷类除草剂，是非选择性广谱除 草剂Basta的活性成分，强烈抑制谷胱甘肽合成酶 （GS)的活性。
3、Bt基因的简并性修饰
密码子均具有种的特异性或称种偏爱性； 高等植物种单、双子叶植物之间密码子的使用频率也
有明显差异，这种密码子的偏爱性直接影响基因的转 录水平和mRNA的稳定性； 未加改造的bt基因在转基因植物中表达水平很低，只 占植株内全部可溶性蛋白的0.001%以下。通过改造， 表达产物占细胞可溶性蛋白的0.03-0.1%才具较强的 毒杀作用。
5、Bt基因应用中存在问题及对策
存在的主要问题是： 昆虫可能对转bt基因植物产生抗性
对策： 1）使用组织专一性启动子或化学诱导启动子； 2）通过对bt基因进行修饰，使IPC在植物中高剂量表达； 3）遗传工程植株核非工程植株混种，以保证在繁育群体
种保留一部分未经选择的害虫； 4）同时使用两种以上bt基因转化农作物或联合使用bt基
第二代转bt基因植物 特点： 1）转基因植物的种类增加； 2）bt基因植物中的表达水平大大提高；这 主要是通
过对Bt基因进行修饰和使用新的启动子来实现的。 采用的启动子类型包括：
CaMV35S组成型启动子； 玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶启动子； 玉米花粉特异性启动子； 1，5－二磷酸核酮糖羧化酶小亚基启动子。
该类植物抗虫基因工程研究还刚开始，获得的转基 因植物是否对人、畜无害，还有待进一步证实。
四、其它抗虫基因
淀粉酶抑制剂基因 胆固醇氧化酶基因 营养杀虫蛋白基因 系统肽基因 核糖体失活蛋白基因 几丁质酶基因 异戊烯转移酶基因
第二节 抗植物真菌病害基因
概述 植物病害中真菌病害占绝大多数，控制真菌病 害的关键，取决于对植物与病原真菌相互作 用的分子机制的 了解。
如果作物不打农药可造成的产量损失：小麦52％、 玉米59％、大豆58％、棉花84％。
我国统计结果，因虫害水稻每年减产10％、小麦减 产20％、棉花减产30％以上。
1、利用化学农药的弊端
化学农药在食物中的残留，危机人类健康和造成严 重环境污染；
化学农药对有益昆虫的毒害，危机多种生物资源， 破坏生态平衡；