SDSPAGE凝胶电泳n_Western_blot
SDS-PAGE蛋白电泳手册
蛋白电泳手册SDS-PAGE及Western blot蛋白电泳蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象.根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等。
其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用,样品用量少(1-100μg)，分辨率高，凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广泛的应用。
PAGE原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺 (简称Acr) 和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带。
SDS-PAGE原理SDS是一种阴离子表面活性剂，能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。
因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。
这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）。
实验使用过程中，还加入DTT或者***，以打开蛋白间的二硫键，破坏蛋白质的四级结构。
SDS—PAGE最常采用垂直板不连续系统（分离胶与浓缩胶）。
索引蛋白电泳（SDS-PAGE）……………………电泳试剂总表……………………………………………………制胶………………………………上样及电泳……………………染色蛋白提取蛋白定量Bradford蛋白浓度测定试剂盒使用说明BCA蛋白浓度测定试剂盒使用说明Lowry蛋白浓度测定试剂盒使用说明蛋白分子量标准（图）考马斯蛋白胶快速染色液Western blotWestern blotting DAB检测试剂盒Western blotting ECL化学发光检测试剂盒Western blotting 试剂盒使用说明蛋白电泳试剂（部分试剂可以相互替换）系号货号名称1T8060TRIS 三羟甲基氨基甲烷2G8200Glycine 甘氨酸3S8010SDS 十二烷基硫酸钠4A8080Acrylamide 丙烯酰胺5M8200N,N-Methylene Bisacrylamide甲叉双丙烯酰胺6A8090Ammonium Persulfate 过硫酸胺7D8220DTT 二硫糖醇8M8210β-Mercaptoethanol β-***9T8090TEMED 四甲基***10A101030%丙烯酰胺（29:1）11S10514XSDS-PAGE分离胶缓冲液（PH=8.8）12S10524XSDS-PAGE浓缩胶缓冲液（PH=6.8）13P10164×蛋白上样缓冲液(含β-***)P10154×蛋白上样缓冲液(含DTT)15D10701M DTT16A103010%过硫酸氨17T10201M Tris-HCL (PH6.8)18T10101.5M Tris-HCL(PH8.8)19S101010%SDS20T10705×Tris-甘氨酸电泳缓冲液SDS-PAGE如今已形成成熟的方案，实验室可根据自己的情况和习惯来选择试剂。
westernblot电泳原理及步骤
westernblot电泳原理及步骤一、概述西方印迹（w es te rnb l ot）是一种重要的蛋白质分析技术，广泛应用于分子生物学和生物化学研究中。
它通过将待检蛋白质进行SD S-P AG E电泳分离，再转移到聚合物膜上，利用特异性抗原与抗体结合的原理，检测目标蛋白质的存在与表达水平。
二、原理1.SD S-PA GE电泳分离-准备样品：将待检蛋白质样品加入去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合，使蛋白质变性和解聚。
-加载样品：将样品加入聚丙烯酰胺凝胶（p ol ya cr yl am id eg e l）孔上。
-电泳分离：将准备好的凝胶置于电泳槽中，通电使蛋白质在凝胶中由负极向正极运动分离。
2.转膜-准备转膜装置：将P V DF或N C膜与吸水性纸张浸泡后，叠放在转膜装置中，并按压缩成一整体。
-预处理转膜：将转膜装置放入转渍缓冲液中浸泡，使其湿润。
-转移：将电泳完的凝胶与转膜装置层叠，加上固定层叠板，施加压力进行转膜。
3.免疫检测-封闭：将转膜后的膜置于封闭液中，阻断非特异性结合位点，减少背景信号。
-孵育：将膜与目标蛋白对应的一抗抗体孵育，使其与目标蛋白特异性结合。
-洗涤：用洗涤缓冲液洗去非特异性结合的抗体。
-二抗检测：将膜与与一抗相应的辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，二抗与一抗结合形成复合物。
-显示：加入发色底物，与酶催化反应，生成可视化的蛋白质带谱。
三、操作步骤1.准备样品-将待检蛋白质样品加入适量去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合。
-完全溶解样品，可加热至95°C处理。
2.SD S-PA GE电泳分离-准备分离凝胶：根据目标蛋白质的分子量选择合适浓度的凝胶。
-加载样品：用自动吸管或微量注射器将样品均匀地加载到聚丙烯酰胺凝胶孔上。
-启动电泳：将准备好的凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，通电进行电泳。
3.转膜-准备转膜装置：按照转膜装置的说明书操作，准备好转膜膜和膜瓶。
-预处理转膜：将PVD F或N C膜与吸水性纸张浸泡，并放入转膜缓冲液中浸泡片刻。
SDS-PAGE及WesternBlot简明操作指南
SDS-PAGE及WesternBlot简明操作指南SDS-PAGE及Western Blot简明操作指南一．蛋白样品制备推荐使用RIPA裂解液。
一般使用强裂解液，对于coIP可用弱裂解液。
1.准备工作：1)取足量裂解液，加入PMSF和（或）蛋白酶抑制剂；若要检测蛋白磷酸化，推荐加入磷酸酶抑制剂。
置于冰上预冷。
2)准备足量PBS，置于冰上预冷。
3)提前打开离心机预冷至4度。
2.裂解样品：（注意保持样品处于冰上，4度离心）1)动物组织：取1g左右置入离心管，加入配制好的裂解液0.5-1ml，置于冰上，用匀浆器充分匀浆；2)悬浮细胞：以6孔板的一个孔为例（面积约10平方cm）；300g离心10分钟，去除培养基，收集细胞；1ml 预冷的PBS重悬后，转移到1.5ml离心管中，300g离心10分钟，去除上清；加入60-200ul裂解液重悬细胞，置于冰上，裂解5-10分钟；裂解期间，每隔一分钟使用涡旋仪震荡5秒或使用移液器吹打5秒。
3)贴壁细胞：以6孔板的一个孔为例（面积约10平方cm）；去除培养基，用1ml PBS洗涤细胞；去除PBS，加入60-200ul裂解液，置于冰上，裂解2-3分钟；用细胞铲刮掉细胞，用移液器转移到1.5ml离心管中；置于冰上，裂解5-10分钟，裂解期间，每隔一分钟使用涡旋仪震荡5秒或使用移液器吹打5秒。
3.收集蛋白：1)将上述裂解样品于4度10000g离心10-20分钟，转移上清至一新的离心管，此即为蛋白样品。
此处样品可于-20或-80度长期保存。
4.蛋白的相对定量：BCA法为保证各样品western上样蛋白量一致，须定量蛋白；推荐相对定量；绝对定量需要在本方法基础上额外做BSA标准曲线。
备注：每个蛋白要做2个重复，blank对照须使用步骤2中的裂解液。
1)参考说明书，配制足量BCA工作液（多配制10%，以免不足）；2)取一96孔酶标板，在要用到的孔中加入上述BCA工作液，每孔100ul;3)在上述孔中分别加入1-2ul各蛋白样品及blank对照；4)将酶标板于37度孵育10-30分钟，直到出现较明显颜色变化即可；5)测定吸光度；6)计算相对蛋白含量：各吸光度去除blank背景，以吸光度最低者为参考，进行归一化处理，即计算吸光度倍数关系；western上样时，须依据此倍数关系调整各样品上样体积，以保证各样品上样蛋白量一致。
Western blot电泳原理
WB原理1、电泳是指带电粒子在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的现象。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）由于无电渗作用，样品用量少（1-100μg），分辨率高，可检出10-9-10-12mol的样品，凝胶机械强度大，重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶。
SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级及三级结构，并与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构。
2、SDS-PAGE原理SDS-PAGE（SDS变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳）的分离原理根据蛋白质的分子量的差异分离蛋白质，样品处理液中通常加入溴酚蓝染料，溴酚蓝指示剂是一个较小的分子，可以自由通过凝胶孔径，所以它显示着电泳的前沿位置，当指示剂到达凝胶底部时，即可停止电泳。
分离胶从加入10%AP和TEMED起至开始出现凝胶的时间为15-20分钟（并不是此时已凝聚完全）。
对浓缩胶最佳聚合速度为8-10min开始可见聚合，可以通过调节AP和TEMED 的加入量来控制。
一般采用恒压浓缩胶80V，分离胶120V，电泳直至溴酚染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳。
蛋白标准品（Molecular Weight Marker），电泳的分离效率，转膜效率以及电泳泳动情况等，皆需通过蛋白标准品来显示。
蛋白质印迹法是将蛋白质混合样品经SDS-PAGE后，分离为不同条带，其中含有能与特异性抗体（或McAb）相应的待检测的蛋白质（抗原蛋白），将PAGE胶上的蛋白条带转移到NC膜上此过程称为blotting，以利于随后的检测能够的进行，随后用牛奶将膜上的非特异性的抗原封闭，将膜与抗血清一起孵育，使第一抗体与待检的抗原决定簇结合（特异大蛋白条带），二抗与一抗结合，即检测样品的待测抗原并可对其定量。
Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
Western blot实验步骤
1.9/ 4× 分 离 胶 缓 冲 液 3.61 （mL） 10% 过硫酸氨（ L ） 112/
168
TEMED（L） 分离范围（kDa）
5.0/7.5 36-150
3.7/5.5 5 1.9/ 3.61 112/ 168 5.0/7.5
SDS-PAGE 蛋白电泳试剂
1. 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体溶液（Acr和Bis)：
丙烯酰胺30g ，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加水100ml ，滤 纸过滤后储存于棕色瓶中，4℃避光保存，pH不得超过 7.0。（光催化或碱催化其发生脱氨基反应）
• 2. 4x分离胶缓冲液 ：Tris 18.17g, 10% SDS 4ml, HCl调pH至8.8, 定容到100ml。
• 7.染色液：称取考马斯亮蓝R-250 2.5g，加入
甲醇450ml，冰乙酸100ml、水650ml。
• 8.脱色液 ：甲醇100ml，冰乙酸700ml，加水 830ml。 • 9.十二烷基硫酸钠（SDS）溶液:10%(w/v) 1g SDS，10ml去离子水配制，室温保存。
SDS-PAGE 电泳采用 Tris- 甘氨酸系统，即按分子克隆 中Sambrook等的方法（Sambrook, 1989）进行
• PVDF膜（ 聚偏二氟乙烯，polyvinylidene fluoride)的预处理 ： 在甲醇浸泡10秒湿润膜，转移缓冲液浸泡10－15 分钟，除去甲醇。PVDF是疏水性的，在转膜缓冲 液里很难浸透，甲醇处理后使更容易浸润，且甲 醇处理活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易 跟带负电的蛋白质结合； • PVDF膜是一种高强度、耐腐蚀的物质，PVDF膜 可以结合蛋白质，而且可以结合小片段的蛋白质， 最初是将它用于蛋白质的序列测定，虽然PDVF膜 结合蛋白的效率没有硝酸纤维素膜高，但由于它 的稳定、耐腐蚀使它成为蛋白测序理想的用品；
western blot原理
western blot原理
Western Blot是一种常用的分子生物学实验技术，旨在检测和
分离特定蛋白质的方法。
该技术基于蛋白质的分子量差异和亲和性分离效应。
首先，蛋白质样品需要经过电泳分离，通常是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行分离。
SDS-PAGE中，样品中的
蛋白质会被不带电的SDS包膜所覆盖，使得蛋白质带有负电荷。
之后，这些带有负电荷的蛋白质会被电场引力依据其分子量大小而迁移，从而在聚丙烯酰胺凝胶上分离得到。
然后，将经过分离的蛋白质转移到一个膜上，通常是聚乙烯二醇或聚维尼尔丙烯酰胺膜。
这个过程被称为电转移。
转移到膜上的蛋白质保持了相同的排列方式，以便进行后续的检测。
接下来，膜被孔隙充满的非特异性蛋白质、胶原蛋白等阻塞物浸泡，以防止非特异性的蛋白质与特定抗体非特异地结合。
在这之后，将特定的一抗（一种针对感兴趣蛋白质的抗体）加入膜上与特定的蛋白质结合形成复合物。
经过洗涤，使非特异性抗体被彻底洗除。
为了检测复合物，通常需要给予一抗一个标记。
通常使用放射性同位素（如^125I），酶（如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）或荧光标记剂。
标记剂的选择取决于进一步检测的方法。
最后，利用放射活性计数器、酶连显色法或荧光显微镜等设备
对膜进行成像，可量化检测特定的蛋白质。
总之，Western Blot技术利用蛋白质的分子量差异和亲和性分离效应，将蛋白质分离、转移到膜上、与特定抗体结合，并通过标记剂检测来获得特定蛋白质的信息。
这是一种广泛应用于生物学研究中的分析工具。
westernblot原理及过程
westernblot原理及过程
1、Western Blot的原理是：蛋白质是带电的，在聚丙烯酰胺凝胶中通过SDS-PAGE分离蛋白质后，蛋白质被固定在凝胶中。
当凝胶被转移到支持物（例如NC膜或PVDF膜）上时，蛋白质在膜上保留其电荷。
通过针对特定氨基酸序列的特异性抗体作为探针检测蛋白质的位置。
这种技术的作用是对细胞或组织提取的蛋白混合物中的某一特异蛋白进行鉴别和半定量分析。
2、Western Blot的过程大致分为以下几步：
蛋白提取：从细胞或组织中提取总蛋白质混合物。
蛋白定量：确定凝胶中蛋白质的浓度。
SDS-PAGE电泳：通过SDS-PAGE分离蛋白质混合物。
电转印：将分离的蛋白质从凝胶转移到支持物（例如NC膜或PVDF 膜）上。
封闭：用含有去污剂和牛血清白蛋白的溶液处理膜，以封闭膜上的任何未结合位点。
抗原-抗体免疫反应：使用特异性抗体检测目标蛋白质的位置。
蛋白检测：使用化学发光剂检测膜上的目标蛋白质。
SDS-PAGE电泳、westernblotting过程中常见问题以及解决方法
SDS－PAGE电泳过程中常见问题以及解决方法几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行，而所有条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并进可能减少其相互间的聚集，最常用的就是SDS－PAGE 电泳技术，关于大家在此过程中经常遇到的问题进行一些讨论：Q：SDS－PAGE电泳的基本原理？A：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠）， SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
Q：配胶缓冲液系统对电泳的影响？A：在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。
在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。
由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。
当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。
所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。
western blot实验实验步骤
western blot实验实验步骤
Western blot实验步骤如下：
收集蛋白样品：使用细胞裂解液，对贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品进行裂解。
然后测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
SDS-PAGE凝胶配制：参考一些文献资料进行配制。
样品处理：在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。
上样与电泳：将处理后的蛋白样品冷却到室温后，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。
SDSPAGE凝胶电泳n_Western_blot
Pro1- Pro2
Gly- Cl-
-
积层胶
分离胶
+
浓缩效应
凝胶由两种不同的凝胶层组成。上层为浓缩胶，下层 为分离胶。在上下电泳槽内充以Tris-甘氨酸缓冲液(pH8.3)， 这样便形成了凝胶孔径和缓冲液pH值的不连续性。在浓 缩胶中 HCl几乎全部解离为Cl-，但只有极少部分甘氨酸 解离为H2NCH2COO-。蛋白质的等电点一般在pH5左右， 在此条件下其解离度在HCl和甘氨酸之间。当电泳系统通 电后，这3种离子同向阳极移动。其有效泳动率依次为Cl＞蛋白质＞H2NCH2COO-，故C1-称为快离子，而 H2NCH2COO- 称为慢离子。
及与其它物质分子之间的非共价键，使蛋白质 变性而改变其原有的构象，并同蛋白质分子充 分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。
强还原剂巯基乙醇（现在常用二巯
基苏糖醇，DTT）打开蛋白质分子内的
二硫键使这种结合更加充分。
基本原理之二
结合了SDS的蛋白质在水溶液中的形状类似于长 椭圆棒，不同的蛋白质-SDS复合物其椭圆棒的短 轴长度恒定，而长轴的长度则与蛋白质分子量的 大小成正比。 这样的蛋白质-SDS复合物在电场作用下，其迁移 率便不再受蛋白质原有的净电荷及形状等因素的 影响，而主要取决于其分子量大小这一因素。根 据这一特点，就可以将各蛋白组分按分子量大小 分开。
的形状，使得SDS-PAGE电泳的泳动率不再 受蛋白质原有电荷与形状的影响。因此，
各种SDS-蛋白质复合物在电泳中不同的泳 动率只反映了蛋白质分子量的不同。
但在SDS-PAGE电泳中，由于SDS这种阴离 子表面活性剂以一定比例和蛋白质结合成复合物， 使蛋白质分子带负电荷，这种负电荷远远超过了 蛋白质分子原有的电荷差别，从而降低或消除了 蛋白质天然电荷的差别； 此外，由多亚基组成的蛋白质和SDS结合后 都解离成亚单位（注意SDS结合蛋白质的前提条 件是有还原剂DTT，就能更好结合），这是因为 SDS破坏了蛋白质氢键、疏水键等非共价键。
免疫荧光、SDS-PAGE、Western-blot实验技术
小心仔细。
Western Blot常见问题分析
SDS-PAGE电泳
胶不平？ 凝胶漏液？
➢ 胶板洗刷干净 ➢ 加入APS和TEMED的量要合适 ➢ 加入试剂后摇匀，使其充分混
合，防止部分胶块聚合不均匀 ➢ 温度合适，受热不均匀导致胶
凝胶浓度与蛋白分离范围
凝胶浓度（％） 线性分离范围（KD)
15
10-43
12
12-60
10
20-80
8
30-90
操作步骤：采用垂直式电泳槽装置
配制分离胶(12%)（1.0mM的玻璃板）
ddH2O 30%丙烯酰胺贮存胶 1.5M Tris-HCl 10% SDS 10% AP TEMED
3.3ml 4.0ml 2.5ml 0.1ml 0.1ml 4.0μlห้องสมุดไป่ตู้
三、Western blotting
印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后 利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。
1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC 膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的 方法，称为Southern印迹法。
间接法
1.固定 2.通透（选做） 3.封闭（选做） 4.一抗孵育 5.荧光二抗孵育 每步都需要PBS或PBST洗涤3次，每次5分钟。
补体法
利用补体反应，通过形成抗原-抗体-补体复合物发射荧光
二、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分 子量。强阴离子去污剂SDS与某一还原剂（如巯 基乙醇或二硫苏糖醇DTT）并用，通过加热使蛋 白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同 密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。采用 考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。 因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表
western blot实验内容
western blot实验内容Western Blot实验内容可以简单描述为一种生物化学分析技术，主要用于检测特定蛋白质在细胞或组织中的存在和表达水平。
该实验通常包括以下步骤：1. 样品制备：首先，从细胞培养物或组织中提取蛋白质。
这可以通过细胞裂解和蛋白质提取试剂盒等方法来完成。
2. SDS-PAGE电泳：将提取的蛋白质样品通过SDS-PAGE凝胶电泳进行分离。
在SDS-PAGE中，样品中的蛋白质按照大小被分离成不同的带状条带。
3. 转印：将分离的蛋白质通过电泳转印技术转移到聚丙烯酰胺薄膜（或称为膜）上。
膜可以是尼龙膜或聚乙烯膜。
4. 阻断：将膜置于含有蛋白质阻断剂（如牛血清蛋白或脱脂奶粉）的缓冲液中，以阻止非特异性结合。
5. 一抗孵育：将膜与特异性抗体（一抗）一起在某种缓冲液中孵育。
这些一抗可以结合到目标蛋白质上。
6. 洗涤：通过多次洗涤，去除与一抗非特异性结合的蛋白质。
7. 二抗孵育：膜与与一抗的物种不同的次级抗体（二抗）一起在缓冲液中孵育。
二抗与一抗结合，形成复合物。
8. 洗涤：去除与二抗非特异性结合的蛋白质。
9. 显色：将特定酶底物添加到膜上，使目标蛋白质变色。
例如，常用的酶底物是辣根过氧化物酶（HRP）和4-氨基乙基硅烷（DAB），可以生成棕色的色斑。
10. 图像获取和分析：使用相应的设备（如基于膜的成像系统）捕捉膜的图像，并使用分析软件定量分析蛋白质的表达水平。
通过Western Blot实验，研究人员能够检测和定量不同细胞组分中蛋白质的存在和表达水平，从而深入了解生物系统的功能和调控机制。
western blot实验原理
western blot实验原理Western blot实验是一种常用于检测特定蛋白质的定性和定量的方法。
该方法基于蛋白质电泳分离和免疫检测的原理。
首先，需要将待测蛋白样品经过电泳分离。
通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）将蛋白质按照分子量大小分离成不同的条带。
分离的蛋白质在凝胶中具有负电荷，因为SDS使蛋白质带有负电荷，且聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以使蛋白质按照大小排列。
随后，将分离的蛋白质转移到固体膜（通常是聚偏氟乙烯膜或硝酸纤维素膜）上，这个步骤被称为蛋白质印迹。
印迹可以通过两种主要的方法进行：湿式印迹和半干印迹。
湿式印迹是通过将蛋白质和膜浸泡在缓冲液中，使蛋白质从凝胶转移到膜上。
半干印迹是通过将蛋白质和膜一起放置在专门的仪器中，使其通过电流迁移至膜上。
印迹后，蛋白质会被固定在膜上。
接下来，需要进行蛋白质的检测。
在Western blot实验中，通常使用特异的抗体将待测蛋白质标记出来。
这些抗体可以结合到膜上的特定蛋白质上。
抗体之后，还会使用特定的探针（比如酶标记的二抗或放射性同位素标记的二抗）来可视化目标蛋白质的位置。
这些探针会与抗体结合并产生显色。
最后，对膜上的蛋白质进行成像和分析。
成像通常使用化学发光系统、放射性探测器或紫外线照射等方法。
通过成像，可以观察到蛋白质在膜上的位置和相对含量。
根据标准品的质量和待测蛋白质的强度，可以定量分析目标蛋白质在样品中的含量。
总结起来，Western blot实验是一种基于蛋白质电泳分离和免疫检测的方法，通过分离、转移到膜上、检测和成像的步骤，可以定性和定量检测特定蛋白质。
westernblot煮蛋白要点
westernblot煮蛋白要点Western blot煮蛋白是一种常用的蛋白质检测技术，通过分离蛋白质、转移到膜上、染色等步骤，可以检测特定蛋白质在混合蛋白质中的存在和表达水平。
下面将详细介绍Western blot煮蛋白的要点。
第一要点：样品制备在进行Western blot煮蛋白实验前，首先需要提取蛋白质样品。
常用的方法包括细胞裂解液裂解、组织研磨、血清、尿液等来源的蛋白质提取。
在提取过程中需要添加蛋白酶抑制剂和磷酸化酶抑制剂，以保护蛋白质的完整性和活性。
第二要点：SDS-PAGE电泳提取的蛋白质样品需要进行SDS-PAGE电泳分离。
SDS-PAGE电泳是一种以聚丙烯酰胺凝胶为分离介质，通过电场作用将蛋白质按照大小分离的方法。
在电泳过程中，蛋白质会从凝胶上向下迁移，最终形成蛋白质条带。
第三要点：转印完成SDS-PAGE电泳后，需要将分离的蛋白质转移到膜上。
这个步骤称为电泳转印。
常用的转印方法有湿式转印和半湿式转印。
转印过程中，蛋白质会被转移到膜上并固定在上面，为后续的染色和检测提供条件。
第四要点：染色转印完成后，需要对膜上的蛋白质进行染色。
染色可以选择各种染色剂，如Ponceau S染色、Coomassie蓝染色或银染色。
染色后的膜上会出现蛋白质条带，可以根据条带的位置和强度进行进一步的分析。
第五要点：免疫检测Western blot的关键步骤是免疫检测。
在此步骤中，需要将膜与特异性抗体反应，通过抗体与蛋白质的结合来检测特定蛋白质的存在和表达水平。
免疫检测的结果可以通过化学发光或荧光等方法来观察和记录。
第六要点：数据分析最后一步是数据分析。
通过Western blot的结果，可以得到目标蛋白质的表达水平和其他相关信息。
通过比较不同样品之间的差异，可以得出结论并进行进一步的实验设计和研究。
总结：Western blot煮蛋白作为一种常用的蛋白质检测技术，具有高灵敏度和特异性，广泛应用于生物医学研究中。
western blot 实验原理
western blot 实验原理Western blot是一种常用的蛋白质分析技术，通过将待检测样品中的蛋白质分离并转移到膜上，然后使用特异性的抗体探针进行特定蛋白质的检测。
Western blot实验主要包括以下步骤：1. 样品制备：待检测样品通常经过细胞裂解或组织研磨，提取蛋白质。
蛋白质溶液经过蛋白浓度测定后，可进行下一步实验。
2. SDS-PAGE电泳：蛋白质溶液经过加入含有SDS（十二烷基硫酸钠）的样品缓冲液，并在电泳条件下，通过聚丙烯酰胺凝胶（Polyacrylamide gel）分离蛋白质。
在电泳过程中，SDS会使蛋白质变成带负电荷的线性结构，相同大小的蛋白质在凝胶中的迁移速度也相似。
3. 蛋白质转移：将分离后的蛋白质从凝胶中转移到聚氟乙烯（PVDF）或硝酸纤维素（nitrocellulose）膜上。
转移通常通过将膜和凝胶在电流作用下接触，使蛋白质通过电场转移到膜上。
4. 阻断：将转移后的膜放入含有蛋白质的牛乳或鸡蛋清中，使未特异性结合位点被占据，阻断非特异性结合。
通过此步骤可以减少假阳性的可能性。
5. 抗体探针结合：将特异性抗体溶解在牛乳或鸡蛋清中，并将膜与抗体溶液接触。
抗体将与目标蛋白质特异性结合。
6. 信号检测：使用染色剂或酶标记的抗体来检测抗体-目标蛋白质结合的位置。
这些检测方法可以根据被标记物的类型而有所不同，如酶方法、放射性方法和荧光方法等。
7. 结果分析：使用成像系统（如X射线胶片或数码成像设备）捕捉膜上的信号，并在计算机软件中进行定量和定性分析。
Western blot技术可以用于检测蛋白质的表达水平、翻译后修饰以及蛋白质相互作用等，广泛应用于生物医学研究、生物制药和临床诊断等领域。
SDS-PAGE凝胶电泳及Western blot 检测技术
Pro1- Pro2
Gly- Cl-
-
积层胶
分离胶Biblioteka +浓缩效应
凝胶由两种不同的凝胶层组成。上层为浓缩胶，下层 为分离胶。在上下电泳槽内充以Tris-甘氨酸缓冲液(pH8.3)， 这样便形成了凝胶孔径和缓冲液pH值的不连续性。在浓 缩胶中 HCl几乎全部解离为Cl-，但只有极少部分甘氨酸 解离为H2NCH2COO-。蛋白质的等电点一般在pH5左右， 在此条件下其解离度在HCl和甘氨酸之间。当电泳系统通 电后，这3种离子同向阳极移动。其有效泳动率依次为Cl＞蛋白质＞H2NCH2COO-，故C1-称为快离子，而 H2NCH2COO- 称为慢离子。
5）根据需要转移的蛋白质的分子量设定恒定 工作电流及转移时间，一般分子量20 KD的蛋 白质从0.5mm厚的凝胶上转移可设电压50V， 时间约需10-30min，分子量大的蛋白质转移需 要的时间相应增加，但是在实验中可以发现， 蛋白质的分子量>100KD时，即使转移4560min 膜上吸附的蛋白质的量仍不理想。另外， 如果用Tris-甘氨酸缓冲液，电压为40V，需1-4 h。
当蛋白质的分子量在15,000～200,000之间时， 样品的迁移率与其分子量的对数呈线性关系。
符合如下方程式：Lg MW =－b m R + K 其 中，MW 为蛋白质的分子量，m R 为相对迁移率，b 为斜率，K为截距。当条件一定时，b与K均为常数。
因此通过已知分子量的蛋白与未知蛋白
的比较，就可以得出未知蛋白的分子量。
浓缩胶
浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小， 孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过 大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的 区带。 当样品液和浓缩胶选Tris/HCl缓冲液，电级液 选Tris/甘氨酸。电泳开始后，HCl解离成氯离 子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白 质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离 子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。
SDS-PAGE和WesternBlot技术
转膜条件： 推荐：300V ，2小时；根据蛋白大小以及胶厚度的不同而不同。
Western 流程
• 试剂准备 • 样品准备 • 含量测定 • SDS-PAGE • 转膜
• 免疫反应
• 化学发光 • 凝胶图像分析
免疫反应前准备—封闭
为防止一抗或/和二抗与膜的非特异性结合产生的高背景，因此需要进行膜 的封闭，常用的封闭液：
浓缩胶 分离胶
作用
使蛋白样品浓缩 使蛋白样品分离
缓冲液PH
pH6.8Tris-Cl pH8.8Tris-Cl
凝胶浓度
低，2-5%
高，根据蛋 白大小
不连续电泳
浓缩胶工作原理-浓缩效应
• 凝胶由两种不同的凝胶层组成。上层为浓缩胶，下层为分离胶。 浓缩胶为大孔胶，缓冲液pH6.8，分离胶为小孔胶，缓冲液pH8.8。 在上下电泳槽内充以Tris—甘氨酸缓冲液(pH8.3)，这样便形成了 凝 胶孔径和缓冲液pH值的不连续性。在浓缩胶中 HCl几乎全部解 离 为Cl-，但只有极少部分甘氨酸解离为H2NCH2COO-。蛋白质的 等 电点一般在pH5左右，在此条件下其解离度在HCl和甘氨酸之 间。当电泳系统通电后，这3种离子同向阳极移动。其有效泳动 率依次为Cl-＞蛋白质＞H2NCH2COO-，故C1-称为快离子，而 H2NCH2COO- 称为慢离子。电泳开始后，快离子在前，在它后面 形成离子浓度低的区域即低电导区。电导与电压梯度成反比， 所以低电导区有较高的电压梯度。这种高电压梯度使蛋白质和 慢离子在快离子后面加速移动。在快离子和慢离子之间形成—个 稳定而不断向阳极移动的界面。由于蛋白质的有效移动率恰好 介于快慢离子之间，因此蛋白质离子就集聚在快慢离子之间被 浓缩成—条狭窄带。这种浓缩效应可使蛋白质浓缩数百倍。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及western
• 4.指示剂成微笑符号（指示剂前沿呈现向上的曲 线形），说明凝胶的不均匀冷却，中间部分冷却 不好，导致分子有不同的迁移率所致 • 5.指示剂成微笑符号（指示剂前沿呈现向下的曲 线形），由于电泳槽的装臵不合适，尤其是凝胶 和玻璃板组成的“三明治”底部有气泡或靠近隔 片得凝胶聚和不完全 • 6.凝胶时间不对。通常胶在30min-1H内凝。如果 凝的太慢，可能是TEMED，APS剂量不够或者失效。 APS应该现配现用，TEMED不稳定，易被氧化成黄 色。如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量过多， 此时胶太硬易裂
（7）10%过硫酸铵(AP) （8）TEMED（四甲基乙二胺） （9）样品溶解液： SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+ 溴酚蓝 （2mg）+甘油（2g）+ 0.05mol/L pH8.0Tris-HCl （2ml），最后定容至10ml。 （10）固定液：50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。 （11）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上 述固定液250ml，过滤后备用 （12）脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水 定容至1000ml （13）电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05mol/LTris0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g，甘 氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容 至1000ml
二
抗
1. 同 上 铺 好 保 鲜 膜 ， 加 1 ： 1000 的 二 抗 1000ul （ 1ul mouse 抗 人 IgG-HRP+ 999ul 抗体稀释液） 2. 同上蛋白面朝下放好尼龙膜，要避免产生 气泡 3. 盖上平皿，同上RT孵育2 hours 4. TBST 10min ×2 ； TBS 10min×1
SDS—PAGE电泳westernblot最终
（一）SDS—PAGE电泳1.试剂配置a)30%母液丙烯酰胺，甲叉丙烯酰胺，加入纯水定容到100ml过滤保存于4℃（30天内用完）b)10％SDS SDS 10g加入90ml蒸馏水缓慢搅拌溶解后定容到100mlc)6NHcld)Tris-Hcl，PH=碱加纯水至60ml调解PH值到定容到100ml 储存于4度1Le)M Tris-Hcl，PH=6gTris碱加纯水至60ml调解PH值到定容到100ml ，储存于4度500mlf)还原型5XSD S上样缓冲液mol/L Tris•HCl（），二硫叔糖醇（DTT，），SDS ，溴酚蓝，甘油混匀后，分装于离心管中，4℃保存20mlg)10×电泳缓冲液碱甘氨酸10gSDS 溶于蒸馏水，定容到1L保存于4℃如果有沉淀，平衡到室温。
用时每50ml10×电泳缓冲液加入450ml蒸馏水混匀即可。
1Lh)10%过硫酸铵（APS）100mg溶于1ml蒸馏水中i)胶的选择a)组装玻璃板用1大1小两块干净玻璃板组装模具，用夹子夹好，底部要平，如果用旧槽底部可以用封口膜以防漏胶b)把组装好的玻璃板固定在模具上c)按照需要在4ml小管中配置如表的浓缩胶和分离胶缓冲（浓缩胶先不加TEMED）d)用枪小心加入分离胶缓冲液到离上缘4-5cm（3240ul），从玻璃板的左侧加，从右侧加入纯水到上缘e)凝固20分钟以上观察试管中剩余的凝胶凝固情况，如果凝固很好，倒掉玻璃板内的水，用吸水纸小心尽量吸干水，注意滤纸不要碰到分离胶f)浓缩胶缓冲液加入TEMED用枪加入胶槽，尽力不要产生气泡，如果有小的气泡可以轻微敲打玻璃板使气泡上升g)斜着插入梳子后摆正（为了不产生气泡）h)把蛋白样品与上样缓冲液混合，煮沸5分钟，13000转离心5分钟。
蛋白上样量一般在30-100μg （95或100度3min）。
i)浓缩胶大概40分钟凝固。
等胶凝固后，左右各一下缓慢取下梳子。
用手擦掉玻璃板上凝固的胶，防止加样的时候加不进去。
western blot原理电泳
western blot原理电泳Western blot原理电泳技术是一种分离和检测蛋白质的方法，广泛应用于生物医学研究中。
其原理电泳是利用电场作用力将带电粒子（如蛋白质）在凝胶中排列，形成不同的带，进而实现其分离。
Western blot技术则是在此基础上，加入了蛋白质转移和特异性探针检测的步骤，更加精准地检测目标蛋白质。
下面将详细介绍Western blot技术的原理和步骤。
一、Western blot技术的原理Western blot技术主要分为以下三个步骤：SDS-PAGE电泳、蛋白质转移和探针检测。
其中，SDS-PAGE电泳步骤主要用于分离蛋白质，蛋白质转移步骤则将蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶上，探针检测步骤则用于检测目标蛋白质。
1. SDS-PAGE电泳SDS-PAGE电泳是Western blot技术的第一步，主要用于分离蛋白质。
其中，SDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子表面活性剂，能够使蛋白质分子带有负电荷，从而将其在电场作用下沿凝胶中移动。
同时，SDS还能够破坏蛋白质的三级结构，使其线性化，从而更容易被电泳分离。
而PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）则是一种常见的电泳分离方法，可通过调整凝胶的浓度和电场强度，实现对蛋白质的大小分离。
2. 蛋白质转移蛋白质转移是Western blot技术的第二步，主要用于将分离后的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶上，以便后续的探针检测。
蛋白质转移有两种常见的方法：湿式和半干式。
其中，湿式转移速度较慢，但转移效率较高；而半干式转移速度快，但转移效率较低。
在蛋白质转移的过程中，需要用到膜和转移缓冲液等试剂。
3. 探针检测探针检测是Western blot技术的第三步，主要用于检测目标蛋白质。
探针是一种特异性抗体或其他识别蛋白质的分子，可与目标蛋白质结合形成复合物，从而实现其检测。
探针检测的方法主要有两种：原位检测和传递检测。
其中，原位检测是将探针标记在一定的酶、荧光或放射性同位素上，直接检测其信号；而传递检测则是通过次级抗体与探针结合，再与标记有酶、荧光或放射性同位素的第三抗体结合，最终实现目标蛋白质的检测。
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实验中各成分作用
聚丙烯酰胺 SDS 甘氨酸 上样缓冲液 固定液 染色剂
被激活的单体和未被激活的单体反 应开始了多聚链的延伸，正在延伸的多 聚链也可以随机地通过bis的作用进行交 叉互联成为网状结构，最终多聚物聚合 成凝胶状，而其孔径大小等特征由聚合 条件及单体浓度决定。
十二烷基硫酸钠(SDS)
Pro1- Pro2
Gly- Cl-
-
积层胶
分离胶
+
浓缩效应
凝胶由两种不同的凝胶层组成。上层为浓缩胶，下层 为分离胶。在上下电泳槽内充以Tris-甘氨酸缓冲液(pH8.3)， 这样便形成了凝胶孔径和缓冲液pH值的不连续性。在浓 缩胶中 HCl几乎全部解离为Cl-，但只有极少部分甘氨酸 解离为H2NCH2COO-。蛋白质的等电点一般在pH5左右， 在此条件下其解离度在HCl和甘氨酸之间。当电泳系统通 电后，这3种离子同向阳极移动。其有效泳动率依次为Cl＞蛋白质＞H2NCH2COO-，故C1-称为快离子，而 H2NCH2COO- 称为慢离子。
3、将PVDF膜在100%甲醇中润湿2-3 s，再用 超纯水漂洗2-3min，然后在阳极缓冲液Ⅱ中平 衡至少15min。 4、电泳结束后将凝胶在阴极缓冲液中平衡 5min。
5）在转移槽的阳极板上按以下顺序放臵：在阳 极缓冲液Ⅰ中浸过的Whatman 3mm滤纸， PVDF膜，凝胶，在阴缓冲液中浸过的Whatman 3mm滤纸。 6）根据需转移蛋白质的特性设臵合适的电流及 时间，一般原则为1.8mA/cm2, 1 h。由于半干式 转移不易散热，电印迹宜在4℃环境中进行（冰 柜或冰库中）。
甘氨酸
样品和浓缩胶中的氯离子形成移动界面的先导
边界,而甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的
两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域, 它 推动样品中的蛋白质前移并在分离胶前沿积聚。
此处pH值较高， 有利于甘氨酸的离子化， 所形成的甘氨酸离子穿过堆集的蛋白质并紧随 氯离子之后，沿分离胶泳动。从移动界面中解 脱后，SDS-蛋白质复合物成一电位和pH值均匀 的区带泳动穿过分离胶，并被筛分而依各自的 大小得到分离。
SDS-PAGE凝胶电泳及 Western blot 检测技术
SDS-PAGE凝胶电泳
实验原理 实验步骤 注意事项 电印迹 SDS-PAGE的优点 SDS-PAGE的缺点 实验常见问题及处理 小技巧
实验原理
背景 基本原理 分类 分离范围 实验中各成分作用
背景
1967年由Shapiro建立。 1969年由Weber和Osborn进一步完善。
分离范围
SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围取决于用于灌胶的 聚 丙烯酰胺的浓度和交联度。在没有交联剂的情况下聚合的 丙烯酰胺形成毫无价值的粘稠溶液，而经双丙烯酰胺交联 后凝胶的刚性和抗张强度都有所增加，并形成SDS蛋白质 复合物必须通过的小孔。这些小孔的孔径随 “甲叉双丙烯 酰胺～丙烯酰胺” 比率的增加而变小，比率接近 1：20 时 孔径达到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰 胺～丙烯酰胺”为1：29 配制，试验表明它能分离大小相 差只有3% 的蛋白质。
分离胶内的电荷 效应
样品进入分离胶后，慢离子甘氨酸全部解离 为负离子，泳动速率加快，很快超过蛋白质，高 电压梯度随即消失。此时蛋白质在均一的外加电 场下泳动，但由于蛋白质分子所带的有效电荷不 同，使得各种蛋白质的泳动速率不同而形成一条 条区带。
与SDS结合的蛋白质的构型也发生变化， 在水溶液中SDS-蛋白质复合物都具有相似
根据需要转移的蛋白质的分子量设定恒定 工作电流及转移时间，一般分子量20 KD的蛋 白质从0.5mm厚的凝胶上转移可设电压50V， 时间约需10-30min，分子量大的蛋白质转移需 要的时间相应增加，但是在实验中可以发现， 蛋白质的分子量>100KD时，即使转移4560min 膜上吸附的蛋白质的量仍不理想。另外， 如果用Tris-甘氨酸缓冲液，电压为40V，需1-4 h。
7）转移结束后，将膜在超纯水中漂洗2～3次， 每次5min，除去Tris和甘氨酸。然后将膜臵于 滤纸上将其自然晾干后，再在20%甲醇溶液稍 微润湿一下即可在白光（如日光灯）下看到灰 白色的蛋白质带印迹，因而可省去染色步骤， 切下此印迹进一步分析。但是当电泳前样品中 含有较多的杂蛋白及盐时，用此法不易分辨， 仍需染色。
SDS是阴离子型表面活性剂，它能 按一定比例与蛋白质分子结合成带负 电荷的复合物，再与PAGE技术结合， 则谱带差异更加明显、清晰，并可测 定蛋白质分子量。
SDS带有大量负电荷，当其与蛋 白质结合时，所带的负电荷大大超过 了蛋白质原有的负电荷，因而消除或 掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的 差异，使蛋白质均带有相同密度的负 电荷，因而可利用分子量的差异将各 种蛋白质分开。
6）转移完毕后将膜去下在超纯水中漂洗2～3次，每次 5min，以洗去膜上沾有的在电泳和电印迹过程中使用 的缓冲液。 如果用做氨基酸分析：转移缓冲液首选 CAPS，这是 因为CAPS对以后的氨基酸组成分析、蛋白质序列测定 影响小，另外CAPS在pH 11时有很好的缓冲能力，并 保证绝大多数蛋白质都带负电荷向正极移动。 Western blot：通常用Tris-甘氨酸系统也可以进行电印 迹，但转移结束后需对膜漂洗更完全以去除可能沾附 的缓冲液离子及其他杂质。
上样缓冲液
为什么要上样缓冲液？
蛋白上样缓冲液(SDS-PAGE loading buffer)是一种以 溴酚蓝为染料，5倍浓缩的SDS-PAGE凝胶电泳上样缓 冲液,用于常规的SDS-PAGE蛋白电泳样品上样。 本产品分为还原型和非还原型两种，还原型上样缓 冲液中的巯基可使蛋白分子的链内二硫键和链间二硫键 断裂，使通过二硫键连接的各亚单位彼此分离，在电泳 凝胶上显现多个蛋白条带，选购和使用时请务必注明， 仔细区分。
水浴式电印迹方法
（采用Bio-Rad公司的Mini-Protean III系列） 1）将转移膜剪成和凝胶一样大小。 2）将PVDF膜在100%甲醇中均匀润湿（约2-3 秒），再在水中漂洗2-3min，然后在转移缓冲 液中平衡至少15min。
3）电泳结束后，将凝胶在转移缓冲液中平衡 5min。 4）将凝胶臵于也在缓冲液中浸泡过的 Whatman 3mm滤纸上，然后将PVDF膜覆于 凝胶上，再盖上一张浸湿的滤纸（避免在每一 层间留有气泡），最后将它们一起夹入转移盒 中。
经过电泳分离后蛋白质在凝胶中难于进行 进一步分析
如氨基酸序列分析、氨基酸组成分析等，需将 它们转移至有一定韧性并且化学惰性的高分子 支持物上,目前最常用的是PVDF(聚偏氟乙烯)一 类膜，其中Perkin-Elmer公司提供的ProBlott膜 具有吸附蛋白质能力强的特性，特别适合于氨 基酸组成分析和序列分析。 下面介绍两种电印迹方法。
半干式转移
（Semi-dry transfer）
1、将膜和滤纸剪成和凝胶相同大小。 2、准备转移缓冲液。
阳极缓冲液Ⅰ：0.3M Tris,10%甲醇， pH10.4; 阳极缓冲液Ⅱ：25mM Tris,10%甲醇，pH10.4; 阴极缓冲液：25mM Tris, 40mM 6-氨基己酸，10%甲醇， pH9.4(也可以用40mM甘氨酸代替)。 水浴式转移用的CAPS缓冲液：也可用于半干式转移，但 转移效率不及上述系统，尤其当蛋白含量甚少时，希望 蛋白质尽量多地转移至膜上以便下一步分析。 我们实验室：25mM Tris 192mM甘氨酸, 无SDS
凝胶的筛分特性取决于它的孔径，而孔径又是灌 胶时所用丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数。 用5～15%的丙烯酰胺所灌制凝胶的线性分离范围 如下表：
双丙烯酰胺～丙烯酰胺摩尔比为 1：29
丙烯酰胺浓度（%） 15 线性分离范围（kD） 12～43
10
7.5 5.0
16～68
36～94 57～212
电转移
浓缩胶
浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小， 孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过 大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的 区带。 当样品液和浓缩胶选Tris/HCl缓冲液，电级液 选Tris/甘氨酸。电泳开始后，HCl解离成氯离 子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白 质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离 子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。
他们发现样品介质和丙烯酰胺凝 胶中加入离子去污剂（SDS）以后,蛋 白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚 基分子量的大小,电荷因素可以忽视.
四甲基乙二胺(TEMED) 丙烯酰胺
共聚合
激活作用
聚丙烯酰胺
N,N’-亚甲基双丙烯酰胺 过硫酸胺(AP)
激活作用
基本原理之一
阴离子去污剂SDS破坏蛋白质分子之间
及与其它物质分子之间的非共价键，使蛋白质 变性而改变其原有的构象，并同蛋白质分子充 分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。
强还原剂巯基乙醇（现在常用二巯
基苏糖醇，DTT）打开蛋白质分子内的
二硫键使这种结合更加充分。
基本原理之二
结合了SDS的蛋白质在水溶液中的形状类似于长 椭圆棒，不同的蛋白质-SDS复合物其椭圆棒的短 轴长度恒定，而长轴的长度则与蛋白质分子量的 大小成正比。 这样的蛋白质-SDS复合物在电场作用下，其迁移 率便不再受蛋白质原有的净电荷及形状等因素的 影响，而主要取决于其分子量大小这一因素。根 据这一特点，就可以将各蛋白组分按分子量大小 分开。
当蛋白质的分子量在15,000～200,000之间时， 样品的迁移率与其分子量的对数呈线性关系。
符合如下方程式：Lg MW =－b m R + K 其 中，MW 为蛋白质的分子量，m R 为相对迁移率，b 为斜率，K为截距。当条件一定时，b与K均为常数。