发育翻译作业

专业：生物技术年级：2008级姓名：王凤华学号：2008442045 NO信号在胚胎干细胞的内皮分化中的作用Role of Nitric Oxide Signaling in Endothelial Differentiation of EmbryonicStem CellsNgan F. Huang , Felix Fleissner , John Sun , and John P. Cooke摘要细胞中调控胚胎干细胞分化的信号通路是相互联系的。

一氧化氮（NO）是一种强有力的血管扩张剂，它可以通过激活可溶性鸟苷环化酶使细胞产生环磷酸鸟苷（cGMP），以调节细胞内其他信号通路。

NO在成人内皮细胞（EC）中有重要作用，因此我们推测NO可能在胚胎干细胞向内皮细胞（EC）发生中也发挥关键性作用。

本实验发现，起初经NO合成酶（NOS）抑制剂NG-硝基精氨酸甲酯（L- NAME）处理11天后的小鼠胚胎干细胞与对照组内皮细胞并无不同。

然而，在14天后L- NAME处理的细胞表面EC标记物CD144 、Flk1及内源性一氧化氮合成酶明显减少。

在L- NAME的存在下，由ESC分化的EC的血管形成受阻。

为了了解L - NAME的前期与后期之间影响差异，实验检测了NOS的各个亚基含量。

与分化14天后细胞相比，观察到在胚胎干细胞中NOS和sGC亚基存在低水平的表达。

与NO供体或NOS、sGC活性相一致，细胞内cGMP水平，在未分化的胚胎干细胞在第7天处于低水平，无法检测出，14天左右稳定的增多。

表达依赖于内源性NO，受一氧化氮合成酶激活的cGMP 在第14天产生量受到L-NAME的抑制。

数据表明，一氧化氮合酶的元件存在于胚胎干细胞中，但直到后期分化才进行表达。

在此期间，一氧化氮合成酶抑制剂能够减少EC标记物的表达并损伤血管功能。

一前言多能干细胞，如胚胎干细胞（ESCs），具有无限再生及形成3胚层构成的血系统[1,2]的能力，在再生医学上存在巨大的治疗潜力。

因此,胚胎干细胞被认为是一种潜在的无限再生细胞来取代受损组织。

就心血管疾病而言，胚胎干细胞已成功地在体外分化为心血管组织，如内皮细胞，心肌细胞和血管平滑肌细胞，并被证实对临床前期的心肌梗死及外周动脉疾病具有巨大的效益[3-6]。

然而，调控胚胎干细胞分化的信号通路是相互联系的，由许多信号分子组成。

一氧化氮(NO)是各种信息分子中最为重要的一个，它是一种寿命较短的自由基，由一氧化氮合成酶(NOS)在氧化精氨酸时产生。

一氧化氮生物效应是通过激活可溶性鸟苷环化酶间接来合成环磷酸鸟苷(cGMP)发挥的。

随后，产生的cGMP调节环鸟苷酸依赖性蛋白激酶、磷酸二酯酶及离子通道的活性[8]。

通过这种方式, 一氧化氮调节不同成年哺乳动物的心血管、中枢神经系统和免疫系统的细胞过程。

一些报告还表明一氧化氮对心脏细胞分化中也起作用[9-12]。

此外，新生儿二叶主动脉瓣缺陷及心房和心室的小叶间隔缺陷都与一氧化氮合成酶脱偶联有关。

但是关于一氧化氮在胚胎干细胞向内皮细胞分化中所扮演的角色我们知道的很少。

在成年哺乳动物研究中，人类和其它生物的发育特征都已表明一氧化氮是一种强有力的分裂素和生长因子，对内皮细胞和血管再生有重要作用。

由于一氧化氮在保持成年人内皮细胞增长中扮演的重要角色，因此我们猜测它在内皮分化中也扮演着重要的角色。

本文主要介绍了一氧化氮信号元件在内皮分化中的差异表达和一氧化氮合成酶抑制剂在内皮分化中的影响。

二本论2.1材料和方法2.1.1 ESC培养和分化小鼠胚胎干细胞（D3；ATCC，Manassas，V A）经常在有丝分裂不活跃的胚胎成纤维细胞（MEF）上培养，以白血病抑制因子为生长介质[18]。

对于分化的研究上，胚胎干细胞首先用胰蛋白酶进行分离处理，然后移植到含有明胶涂层生长培养基中，37℃培养60min，消耗掉剩余胚胎成纤维细胞。

接下来，将浓度为106胚胎干细胞转移到超低粘性的内皮细胞分化培养基内引发胚体（EB）的形成，该培养基由α-minimum Eagle’s培养基，10%的胎牛血清（FBS），1%青霉素/链霉素，0.05mMβ-巯基乙醇(Sigma，St.Louis,MO)组成[12]。

经4天悬浮培养后，将胚体转到0.2％明胶涂层平板和分化培养基中进行附着培养。

对于指定细胞的处理，在分化培养基中加入一氧化氮合酶抑制剂NG -硝基精氨酸甲基酯( L–NAME，10−5M or 10−4M；Sigma)或二甲基亚砜(DMSO)作为空白对照。

定时更换培养基，在特定的时间点上，测定对样品的基因表达，蛋白表达量，进行血管状形成实验或cGMP活性测定。

2.1.2 定量聚合酶链式反应将样品溶解在Trizol(Invitrogen, Carlsbad, CA)中，使用RNEasy分离试剂盒(Qiagen,Valencia, CA)将总RNA进行分离。

根据产品说明书，使用Superscript II逆转录酶（Invitrogen 公司），逆转录合成第一链cDNA。

用来进行TaqMan荧光定量PCR检测的引物成分包括Flk1，CD144（维生素E -钙粘蛋白），血管性血友病因子（VWF），一氧化氮合酶，可溶性鸟苷酸环化酶（SGC）的组成亚基α2、sGCα3（原名sGCα1），sGCβ2，sGCβ3（原名sGCβ1），二甲基精氨酸二甲胺水解酶（DDAH1），DDAH2（全部来自应用生物系统公司，福斯特城，加利福尼亚州）。

18S引物可以从Shetzline等中获得[19]。

定量PCR中，一个7300的实时PCR 系统进行40个周期（应用生物系统公司）。

这些数据通过ΔΔCt法评估[20]，数据处理为18s 管家基因表达的相对值（n=3）。

2.1.3 免疫印迹在指定的时间点，将样本溶解在含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液中(Pierce，Rockford，IL)，并通过BCA蛋白试剂盒检测法(Pierce)获取总蛋白量。

同时，将获得蛋白样品通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分离，然后转移到硝酸纤维素膜(Invitrogen,Carlsbad,CA)上。

将膜首先放在5%的牛血清白蛋白（BSA）中处理，然后用以下的抗体孵育：FLk1抗体（Cell Signaling Technology, Danvers,MA），一氧化氮合酶(BD Biosciences,San Diego,CA)，或α-微管蛋白（Cell Signaling Technology）。

应用辣根过氧化物酶（HRP）标记的二级抗体，采用化学发光检测试剂盒(Amersham,Piscataway,NJ)对结果进行检测。

蛋白质数量的量化为α-微管蛋白的相对值（n=3）。

2.1.4 免疫荧光染色法将与抗体sGCα3(Sigma,St.Louis,MO)，sGCβ3(Sigma)，eNOS，或者CD144 (BD Biosciences, San Diego, CA)结合的样品固定在4%多聚甲醛进行免疫荧光染色[21]。

在用荧光显微镜(Nikon,Burlingame,CA)的观察前，进一步用Hoechst 33342对细胞核染色(Invitrogen,Carlsbad,CA)，然后用SPOT RT彩色摄像机(Diagnostic Instruments，Sterling Heights,MI)对所看到的图像进行拍摄。

2.1.5 cGMP的活性为了研究内源性及外源性NO在不同分化时间点释放时的贡献，培养细胞要在含有钙离子载体A23187 (2×10−5M；Sigma)，BAY-41-2272 (BAY41,10−5M；EMD Chemicals，Gibbstown,NJ)，(±)-S-亚硝基N -乙酰(SNAP,10−4M, EMD Chemicals)，或者DMSO空白对照的DMEM培养基中孵育30分钟。

此外，为了探知L-NAME对cGMP活性的影响。

存在或缺失L-NAME的细胞经14天分化后，进一步在DMEM培养液中进行孵育，并对其进行以下添加处理：(1) A23187 (2×10−5M), (2) BAY41(10−5M), (3) SNAP(10−4M), (4) BAY41+SNAP,(5)BAY41+A23187,(6) DMSO 空白对照，所有培养基进一步补充cGMP磷酸二酯酶抑制剂（IBMX，10-3M；Sigma）。

30分钟后，将细胞溶解到0.1 N的盐酸中并按说明书(Cayman Chemical,Ann Arbor,MI)规定检测cGMP的活性。

对于每个样品，cGMP的活性为正常情况下总蛋白含量，如可通过BCA蛋白定量法检测评估（n=3）。

2.1.6 流式细胞仪(FACS)与血管形成实验经过在L-NAME(10-4M或10-5M)3周的分化，胚胎干细胞分化的内皮细胞(ESC-ECs)，通过FACS法纯化。

细胞经分离缓冲液(Invitrogen,Carlsbad,CA)分离后，转入10%的正常小鼠血清, 然后先用抗-CD144抗体孵育(BD Biosciences,San Diego,CA)，用别藻蓝蛋白(APC)-共轭二抗再次孵育，免疫球蛋白G同型抗体处理作为对照。

细胞用流式细胞仪纯化(BD Biosciences)。

为了进行血管形成实验，经L-NAME处理诱导的纯净ESC-ECs以1×105细胞密度移植到含有生长因子少的基底膜上（最好在没有L-NAME的分化培养基上）。

24h后，将细胞固定到4%的多聚甲醛中。

在10×焦距下照下相衬图像，分支点数根据美国国立卫生研究院ImageJ 软件版本进行量化[22]。

2.1.7 统计分析所有数据都表示为平均值±标准差。

统计分析的实现通过对2组数据比较进行T -检验或是单向方差Holm的多重比较分析（ANOV A）。

在一段时间内重复测量样品，反复对进行Holm 的调整方差分析。

具有统计学意义的概率P < 0.05。

2.2结果2.2.1 L-NAME对胚胎干细胞向内皮细胞分化的影响为了研究L- NAME对胚胎干细胞内皮分化中的作用，本次试验用L-NAME对正在分化的胚胎干细胞处理14天并对内皮细胞基因进行了定量PCR。

14天后，相对于对照组（P＜0.01）( 图1A )而言，34%成熟内皮标记物CD144在L-NAME存在下明显受到抑制。

10-5M或10-4M 的L–NAME处理分别使eNOS表达下调50% 和52%。

同样，内皮祖细胞标记物FLK1在10-5M或10-4M的L– NAME（P＜0.01）处理下，其表达水平也下调了34%或33%( 图.1C )。