人周血淋巴细胞分离液技术要求

人外周血淋巴细胞分离液产品技术要求

3.1 产品规格及其划分说明

250ml/瓶、500ml/瓶、

3.2 性能指标

3.2.1 外观

乳光或微乳光液体。

3.2.2 澄清度

比重1.077 –1.080 g/mL

3.2.3 pH值（每升标示量/L）

pH要求为7.1～7.3，允许偏差范围为±0.30。

3.2.4 渗透压/（m0sm/kgH2O）

渗透压为280～340 m0sm/kgH2O

3.2.5 细菌内毒素/（EU/ml）

﹤0.5

3.2.6 无菌检查

3.2.6.1 细菌数

不得检出

3.2.6.2霉菌数

不得检出

3.2.7 细胞分离实验

3.2.7.1 细胞形态

正常。

3.2.7.2细胞分离数量及存活率

数量：90%-95%；存活率：95%-98%

3.2.8 安全性检验项目

抗生素：不得检出。

3.3 检验方法

3.3.1外观检测方法

肉眼观察为乳光或微乳光液体

3.3.2 澄清度的测定

按中华人民共和国药典2010年版二部附录ⅨB进行。

3.3.3 pH值的测定

按中华人民共和国药典2010年版二部附录ⅥH进行。

3.3.4 渗透压的测定

按中华人民共和国药典2010年版二部附录ⅨG进行。

取两次平行测定结果的算术平均值为测定结果，两次平行测定结果的绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值的5℅。

3.3.5 细菌内毒素的测定

按中华人民共和国药典2010年版二部附录ⅪE细菌内毒素检查法中的凝胶法进行。

3.3.6 无菌检查

按中华人民共和国药典2010年版二部附录ⅪH无菌检查法进行，检查项目为细菌数、霉菌数。检测法采用平皿法。

3.3.7 人周边血淋巴细胞分离计数及存活率检测实验

3.3.7.1 人周边血细胞分离实验

3.3.7.1.1方法提要

1）本实验所用容器具及溶液均为无菌，实验操作过程均为无菌操作。

2）分离外周血，并计数分离所得细胞及细胞存活率

3.3.7.1.2 实验试剂和材料

1）人外周血：新鲜血5ml(加肝素抗凝20u/ml)

2）分离液：本产品样品

3）1640无血清培养液

4）10%NCS

5）3%冰醋酸

6）台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒

3.3.7.1.3 仪器

1）医用超级洁净工作台：洁净级别为百级。

2）二氧化碳恒温培养箱：能通二氧化碳气体并且保持二氧化碳体积分数为（5±0.1）℅，能在（37±1）℃恒温。

3）细胞培养瓶：T25型、无菌。

4）玻璃试管

5）血球计数板

6）盖玻片：无水乙醇浸泡并擦干。

7）水平离心机

3.3.7.1.4 实验步骤

1）分离人周血淋巴细胞

A 新鲜血（肝素抗凝20u/ml）＋1640（无血清）培养液按照1：1 稀释

B 在10ml玻璃试管中预先加入淋巴细胞分离液，使分离液：1640：新鲜血=1:1:1(最好用玻璃试管，分离液的量可以增加些）

C 小心的将稀释后的血液加到分离液的上面，开始的加入一定一定要慢，要尽量的贴近液面加。

D 离心：

转速：1500/分

温度：20℃－28℃

时间：20分钟

（注意：不要刹车，这个很重要，不然由于急剧的减速度，会把已经分离的单个核细胞层又弄混了，加速度也最好不要太大)

E取出试管，看看是不是分为好几层,顺次为血浆---单个核细胞淋巴细胞层－－分离液－－红细胞

F用毛吸管吸取上面的血浆层，注意无菌，保存好，备用

G用毛吸管，吸出单个核细胞层（白白的那一层），重悬于（2—5倍体积的不完全培养液中）H离心。转速：2000－2300r/min （转速一定要提高，不然淋巴细胞很难与分离液分开)

时间：10分钟

温度：4℃

I震荡后，用培养液重悬至1ml

J 取100ul重悬液放于96孔板中留着计数用，然后将剩余细胞悬液在离心机上离心

2）计数细胞：计数细胞用的细胞计数板的结构是四个角有4个大正方形，每个正方形有16

个小正方形.

a. 取96板中的细胞悬液10ul，用3％冰醋酸稀释到原来的4倍（这样既能溶解红细胞，又保证细胞浓度不是很大，方便计数）

b. 从上面的稀释悬液中取9ul于细胞计数板上，开始计数细胞

c.计数原则：对于压线的细胞，只说左边的和上边的。总共数4大正方形

d.计算细胞浓度：4大格细胞的平均数x 104 x 4 得到的就是细胞的浓度

e 细胞总数是：细胞浓度x1ml

3）培养：取出离心的细胞，震荡，按照每个孔1－2x106个/ml的浓度，将细胞用10％NCS+1640重悬后加入到24孔板中，然后拿出保存的人血浆，2滴/孔（经验得知这样，淋巴细胞生长情况会更好）。加入rIL-2（重组人白介素-2）

25－50u/孔后，放入培养箱，在（37±1）℃温度条件及（5±0.1）％二氧化碳体积分数条件下进行培养。

3）细胞存活率

用台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒检测分离的淋巴细胞存活率

A台盼蓝染色：吸取100μl重悬的细胞到常规1.5ml或0.5ml离心管内，加入100μl Trypan Blue stain轻轻混匀，染色3min（染色时间可适当延长，但不宜超过10min)。

B 计数：吸取少量经过染色后的细胞，用血细胞计数板计数。通常如果要比较精确地进行定量,每个细胞样品至少数500个细胞，数出蓝色细胞和细胞总数。细胞存活率计算公式如下：细胞存活率＝(细胞总数－蓝色细胞数)/细胞总数×100%

注意事项：

1、试剂(A)、试剂(B)都是无菌的，使用时最好在超净台内进行无菌操作，避免细菌污染。

2、台盼蓝对人体有害，请注意小心操作。

3、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

3.3.7.2 分析结果的表述

分离后的淋巴细胞纯度在90%-95%之间，存活率在95%-98%之间

3.3.8 安全性检验

抗生素残留量：

依据中华人民共和国药典2010年三部附录ⅨA抗生素残留量测定法进行，不得含有青霉素、链霉素以及庆大霉素。

3.4 术语

无