关于HBV耐药检测
乙肝病毒耐药基因测序
SAP MIX的作用
外切酶Exon I 降解定量PCR产物中残 留的单链PCR引物。SAP酶除去定量PCR产物 中残存的脱氧核苷三磷酸的磷酸基团，从 而达到纯化定量PCR产物的目的。
经过SAP MIX 酶解纯化后的定量产物方 可以进行后面的测序PCR反应。
测序PCR循环条件
96℃ 1min → (96℃ 10sec , 50℃ 5sec , 60℃ 4min) ×25 cycles →4℃恒温。
拉米夫定（LAM） 阿德福韦（ADV） 恩替卡韦（ETV)
替比夫定（LDT)
rtV173L rtL180M rtM204V/I/S rtV207I/L/G rtS213T
rtA181V/T/S rtV214A rtQ215S rtN236T rtP237H rtN/H238T/D
rtT184A/I/S rtS202G/I rtM204V/I/S rtM250L/V
↑ 204位点（YIDD）
耐药突变位点命名
• 命名体系将HBV聚合酶蛋白划分成4个区域：终蛋白区、 间蛋白区、rt区和RNA酶区，每个区的氨基酸分别计算位 码。rt区起始于高度保守的EDWGPC DEHG位点，包含 344个氨基酸，拉米夫定治疗相关的变异主要发生在该区， 包括rtL180M和rtM204V/I等。新命名体系包括4个部分， 即所属区域、治疗前氨基酸、变异位码和变异氨基酸，如 rtL180M表示变异发生在rt区的180位点，亮氨酸（L）被 蛋氨酸（M）所取代。应当指出的是，发生变异不一定耐 药，只有当变异株成为优势株时才发生耐药。
• HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者，1、2、3 年时的耐药发生率分别为0%、1.6%、 3.1% • HBeAg阴性者1、2、3年的耐药发生率分 别为0%、3.0%、5.9%~11%
HBV耐药基因突变检测
HBV耐药基因突变检测项目简介：HBV是一种经血液传播的嗜肝DNA病毒，是导致慢性肝炎、肝硬化和肝癌的重要因素。
抗病毒治疗是最常见的乙肝治疗方式。
国内外公认的抗病毒药物主要有干扰素和核苷（酸）类药物两类。
核苷（酸）类药物因口服方便、毒副作用少、病毒载量下降较快而受到广泛关注。
长期服用核苷（酸）类药物易产生耐药。
在用药过程中，患者体内HBV DNA及谷丙转氨酶（ALT）逐渐下降，继而达到一个平稳期，患者病情减轻。
此时，HBV很难被完全清除，而是处于一个低复制非活动时期。
随着用药时间的延长，对药物敏感的野生株数量下降，具有耐药突变的变异株因对药物不敏感，而得以不断复制、增加，从而导致HBV DNA及ALT重新上升，使得肝炎复发。
耐药发生的直接后果即为药物疗效的降低和丧失，具体表现为肝炎复发、肝病急性加重、肝硬化，甚至出现肝衰竭。
乙型肝炎病毒耐药是指在核苷酸类似物作用下，药物靶乙型肝炎病毒 P 基因中的某些位点发生改变，导致这种药物对乙型肝炎病毒的抑制作用下降或消失。
自拉米夫定上市以来，目前经美国FDA 批准先后上市的核苷酸类似物有阿德福韦、恩替卡韦和替比夫定。
这些药物作用下出现的病毒耐药均与乙型肝炎病毒 P 基因变异有关。
如拉米夫定耐药相关突变位点为D 区M204V/ I、B 区L180M，阿德福韦相关突变位点为D 区N236T、B 区A181V，替比夫定为M204I，L180M，病毒只需要1 个上述位点突变就可发生对这些药物耐药。
而对恩替卡韦耐药必须建立在拉米夫定耐药基础上(L180M +M204I/V)，同时出现Al84G 或S202I 或M250V 突变。
随着用药时间推移，各类核苷酸类似物发生耐药的几率是不尽相同的。
其中拉米夫定几率最高，而恩替卡韦由于具有较高耐药基因屏障，所以产生耐药的几率最低，在用药后的4 年内都维持在1.1%。
因此通过检测HBV耐药基因突变点有助于判断治疗的效果、制定个体化抗病毒治疗方案。
乙型肝炎病毒耐药基因及分型检测
乙型肝炎现状如何？乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）感染引起的、以肝脏炎性病变为主，并可引起多器官损害的一种疾病，主要存在于肝细胞内，可引起肝细胞炎症、坏死和纤维化。
乙型肝炎病毒（HBV）感染呈世界性分布,全球约有3.6亿感染者，每年约有100万人死于与HBV相关的肝脏疾病.我国属于感染的高发区，现有的慢性HBV感染者约9300万例。
乙型肝炎病毒（HBV)基因分型的临床意义HBV根据DNA差异可分为A、B、C、D、E、F、G、H八种类型，不同型别在流行特征，致病性，对药物治疗反应等方面存在差异，其中，我国以B型和C型为主,感染HBV基因型B的患者发生肝纤维化及肝细胞癌的平均年龄要比感染HBV基因型C的患者的年龄大。
通过分型检测，可判断病毒复制活跃程度及突变发生率情况.研究表明，与HBV—B型相比,C型复制较活跃，不易发生HBeAg血清转换；HBV—B型易产生前C区突变，C型核心启动子区变异发生率更高，与重型肝炎发病机制密切相关，可作为肝癌高危指标之一.同时,HBV-B、C型患者易产生拉米夫定耐药突变，通过分型检测，可指导临床治疗方案制定，有针对性进行临床治疗，更大程度上提高患者的生活质量.乙肝的治疗方式有哪些?HBV感染主要的治疗方法是抗病毒治疗，国内外普遍使用的药物有干扰素和核苷（酸）类。
由于干扰素需要反复注射，且副作用较多,近年来,核苷(酸）类似物（NA)已成为抗HBV感染的主要方法之一，NA因其抑制病毒复制能力强、使用方便、耐受性好且疗效确切，适用于不同阶段的肝病患者,是长期治疗的合理选择.但随着治疗时间的延长,往往会出现病毒耐药株，从而需要监测乙型肝炎病毒耐药基因型，指导临床用药。
乙肝病毒产生耐药的机理是什么?HBV对某种药物的耐药性一般是指由HBV基因组上某些位点的变异导致这种药物对HBV的抑制作用减弱或无作用。
通常分为以下几种：(1）原发性耐药变异：指药物作用靶位的基因及其编码的氨基酸发生变异,导致变异病毒株对治疗药物的敏感度下降；（2）继发性耐药变异(又称补偿性耐药变异)：指由于原发性耐药变异病毒株复制能力下降,在原发性耐药变异的基础上，病毒株也可在其他位点发生变异,这些变异可部分恢复变异病毒的复制能力或可导致变异病毒对药物敏感度的进一步下降；（3）基因型耐药:指检测到已在体外的表型分析研究中被证实与抗病毒药物耐药相关的HBV变异；（4)表型耐药：通过体外复制系统证实检测到的HBV变异会降低其对抗病毒药物的敏感度。
HBV病毒变异耐药的检测方法
二、HBV基因变异主要的检测方法对于核苷酸类似物耐药的检测，欧美国家多采用IN—NO—LIPA方法，其灵敏度和特异性都比较高，但试剂盒非常昂贵，在我国尚难推广普及。
目前国内检测HBV基因耐药变异的方法主要有以下几种，各有其优缺点。
下面将逐一阐述。
（一）聚合酶链反应一逆向点杂交（PCR—RBD）技术利用PCR—RBD技术可实现一次检出10余种至几十种突变位点。
首先设计带标记的靶序列扩增引物和检测各种耐药突变位点的特异性探针，将各探针固化在尼龙膜上，制成能够检测所有耐药相关SNP突变位点和类型的检测膜条；然后用PCR对检测区域的HBVDNA片段进行扩增，并将扩增产物与检测膜条进行杂交，通过加入四甲基联苯胺进行显色，便可直接判断有无基因耐药突变和突变的类型等结果。
刘彦辰等利用该技术建立了LAM、ADV、ETV3种NA药物相关的10个耐药位点上的突变检测，检测结果与直接测序法一致。
（二）聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR—RFLP）用特异性引物PCR扩增目的DNA，再用限制性内切酶消化切割扩增产物，然后通过凝胶电泳分辨不同HBV突变类型产生的由不同片段长度构成的多态性来判断有无基因耐药变异。
该方法较简便，具有一定的敏感性和特异性，可检测数量占HBV准种池5％的耐药变异株；曾被国内外众多实验室应用于LAM耐药变异的检测工作中，近来国内也建立了基于该技术的ADV耐药变异检测方法。
但所需的限制性内切酶类型较多，有些耐药突变很难找到合适的限制性内切酶。
因此，可检测的突变类型有限，对于少数耐药变异位点监测不失为一种简便、快速且廉价的方法。
但随着多种NA的相继问世和HBV耐药变异位点的不断出现，该方法将难以胜任多位点变异的检测。
（三）基因芯片（gene chip）技术亦称DNA芯片（DNA chip）或DNA微阵列（DNA microarray）技术，其基本原理与RBD技术相似，是将大量特定的基因片段或寡核苷酸片段作为探针有序和高密度地排列、固定在玻璃或膜等载体上，然后与待测有标记的样品核酸按碱基配对的原则杂交，然后检测结果。
拉米夫定致HBV基因耐药检测方法及临床进展
拉米夫定致ＨＢＶ基因耐药检测方法及临床进展拉米夫定等核苷（酸）类似物长期治疗最重要的问题是基因突变导致耐药的产生。
现就拉米夫定基因耐药检测方法及临床进展作一综述。
1 基因耐药检测方法基因耐药是指乙肝病毒基因发生特定的突变，并在体外实验中证实与耐药有直接关系。
HBV复制过程中一个显著特点是以RNA为中间体进行逆转录，这一个过程因其DNA多聚酶缺乏校对功能而易发生变异，其变异发生率比一般DNA 病毒大约10，000倍，各种类型变异均可发生，各编码区亦均可发生变异，P区编码HBV DNA聚合酶，为拉米夫定作用靶点，其突变导致耐药的发生。
常用的检测方法如下。
1.1 核苷酸序列测定：将PCR扩增与核酸序列分析技术结合，直接测定HBV DNA聚合酶基因序列，可以检测出多位点的变异，称为PCR-序列分析，简称直接测序。
是分析病毒基因的金标准，其主要优点是可检测出新的变异株，这对服用过抗病毒药物治疗的患者检测出未知的耐药突变株特别重要。
其不足之处在于很难检测突变株与野生株混合感染（突变病毒占30%仍较难检测）[1]。
另外操作费时，费力，检测成本高，及检测结果分析技术难度较大等限制了其在大规模标本临床检测中的应用。
现代DNA测序大都应用循环测序的技术，采用新型的超纯热稳定多聚酶，快速结合核苷酸，其方法简单易行，大大提高了测序的自动化程度，有望弥补既往测序方法的不足。
1.2 聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）：限制性片段长度多态性（RFLP）技术的原理是PCR扩增目的DNA，扩增产物在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段，继之在电泳上形成不同长度的DNA片段条带。
因此凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变（新产生和去除酶切位点）和一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可用此方法检测。
其灵敏度和特异性好，且可以用于混合感染的检测。
另外实验简单、快速，无需特殊仪器等特点，使之在大规模临床检验中应用广泛。
利用一代测序进行HBV基因分型和耐药检测
龙源期刊网 利用一代测序进行HBV基因分型和耐药检测
作者：鲁旖
来源：《健康必读（上旬刊）》2019年第10期
【摘 ;要】目的：建立利用一代测序进行乙型肝炎病毒基因分型和耐药分析的方法。
方法：查阅文献及利用NCBI设计引物，摸索和优化PCR扩增条件，PCR产物用一代测序进行测序分析。
结果：本方法所用引物及PCR产物能用于一代測序进行HBV基因分型和耐药检测。
结论 ;建立了利用一代测序进行乙型肝炎病毒基因分型和耐药分析的方法，为临床诊治提供个性化诊疗依据。
【关键词】乙型肝炎病毒;基因测序;基因分型
【中图分类号】R54 ;;;;;【文献标识码】A; ;;;;【文章编号】1672-3783（2019）10-0286-02
乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）基因组DNA是不完全双链的环状DNA，由一条不完整的正链和一条不闭合的负链组成。
;;HBV基因型包括A～I，我国以B型和C为主。
HBV耐药检测的临床检测意义
无耐药性。
影响耐药产生的因素
病毒
病毒复制水平 产生耐药所需要的置换位点的数目（基因屏 障） 突变对病毒生存率的影响
药物
抗病毒效果 药物暴露量
治疗方案的 选择与优化
患者
抗病毒治疗史 依从性 免疫状态 变异在被感染细胞内长期存在,如 HBV cccDNA
避 免 单 药 序 贯
尽量避免单药序贯治疗：有临床研究显
示，因对某一核苷（酸）类发生耐药而
先后改用其它苷（酸）类药物治疗，可
筛选出对多种核苷（酸）类耐药的变异 株。因此，应避免单药序贯治疗。
HBV基因型耐药
指HBV基因组中的某些位点发生改变，导致这
种药物对HBV的抑制作用下降或消失
这种HBV基因变异与HBV的耐药性有直接因果
干扰素α治疗
普通干扰素 PegIFN加大篇幅 干扰素抗病毒疗效的预测因素
(1) 治疗前ALT水平较高；(2) HBV DNA< 2108 拷贝／ml；[< 4107 IU/mL] (3) 女性； (4) 病程短；(5) 非母婴传播；(6) 肝组织炎症坏死较重，纤维化程
度轻；(7) 对治疗的依从性好； (8) 无HCV、HDV或HIV合并感染；（9）
2014-03
背景资料
HBV属嗜肝DNA病毒，基因组长约3.2kb，
为部分双链环状DNA HBV的抵抗力较强，但65℃10 h、煮沸10 min或高压蒸气均可灭活HBV 环氧乙烷、戊二醛、过氧乙酸和碘伏对 HBV也有较好的灭活效果
背景资料
HBV 侵入肝细胞后，部分双链环状 HBV DNA 在细
A181V（替诺福韦，阿德福韦，拉米夫定、替比夫定和恩替卡韦）
hbv基因与耐药检测临床版
contents
目录
• HBV基因概述 • HBV耐药性检测 • HBV基因与耐药性的关系 • HBV基因与耐药性检测的临床应用 • 未来展望与研究方向
01 HBV基因概述
HBV基因结构
HBV基因由3200个核苷酸组成， 分为四个部分：核心区、X基因、
前C区和C区。
前C区和C区是HBV基因中最重 要的部分，编码HBeAg和
监测
通过定期检测HBV基因和耐药性，可 以监测病毒的变异和耐药性的发展， 及时调整治疗方案。
治疗方案选择
个体化治疗
根据HBV基因型和耐药性检测结果，为 患者制定个体化的治疗方案，提高治疗 效果。
VS
避免耐药性
通过检测耐药性，可以避免使用无效或易 产生耐药性的药物，减少耐药性的发生。
治疗效果评估
病毒载量变化
耐药性产生
HBV基因变异导致病毒对药物的敏感性降低，使得药物治疗效果不 佳，甚至无效。
变异类型
常见的HBV基因变异包括点突变、插入突变和缺失突变等，其中点突 变是最常见的变异类型，也是导致耐药性的主要原因。
耐药性产生的影响
疾病进展
HBV耐药性产生后，病毒复制不受控制，疾病进展加速，肝衰 竭和肝细胞癌等并发症的风险增加。
耐药性基因型与表型关系
研究HBV基因型与表型之间的关系，通过基因型预 测表型耐药性，为临床治疗提供指导。
耐药性传播与进化
研究HBV耐药性在不同地区、不同人群中的 传播和进化规律，为全球范围内的耐药性监 测提供支持。
个体化治疗策略的探索
个体化治疗方案制定
根据患者的基因型、表型及临床特征， 制定个体化的治疗方案，提高治疗效
低，从而产生耐药性。
HBV耐药检测的临床检测意义
耐药者，亦可加用阿德福韦酯联合治
疗。对于阿德福韦酯耐药者，可加拉 18
避 尽量避免单药序贯治疗：有临床
免 单
研究显示，因对某一核苷（酸）
药
序 类发生耐药而先后改用其它苷
贯
（酸）类药物治疗，可筛选出对
多种核苷（酸）类耐药的变异株。
因此，应避免单药序贯治疗。
19
基因型耐药
➢
指基因组中的某些位点发生改变，导致这种药物对的抑制作用下降或消失
➢
这种基因变异及的耐药性有直接因果关系，通过这些变异位点的检测可判断有无耐药性。
20
影响耐药产生的因素
病毒
病毒复制水平 产生耐药所需要的置换位点的数目（基
药物
抗病毒效果 药物暴露量
因屏障）
治疗方案的
突变对病毒生存率的影响
选择及优化
患者
抗病毒治疗史 依从性 免疫状态 变异在被感染细胞内长期存在,如
总体AE 与
LAM相
3~4 CK↑更高
52w 7.5% (3.1%) 104w 12.9%(4.1%)
似
抑制HBV 替诺福韦酯 作用优于
ADV
无耐 药发 生
核苷（酸）类似物治疗的相关问题
治疗前 基线检测
治疗中 指标监测
预测疗效
优化治疗
密切关注 依从性
少(罕)见 不良反应 预防处理
生 病 建其 化 毒 议他 学 学 肝血 指 指 穿指 标 标 刺标
建议治疗
>，>
考虑抗病毒
正常,>,如肝活检 ≥ 或≥或≥
积极抗病毒
有疾病进展者(如脾脏增大)建议肝穿刺
必要时抗病毒
11
干扰素α治疗
➢ 普通干扰素
乙肝患者耐药性检测重要性
乙肝患者耐药性检测重要性
标签：乙肝宜昌国中堂耐药性检测作用
专家指出，科学检查才是规范、准确治疗的关键所在。
很多乙肝患者在接受治疗的时候，都会出现耐药的情况。
那么为了避免耐药情况的发生，在接受治疗前，乙肝病毒耐药检测是一种很好的选择。
那么，乙肝病毒耐药变异检测有什么样的作用呢？
1、对乙肝患者进行乙肝病毒变异耐药检测，可以更加准确的了解乙肝患者的病情，确定乙肝患者体内的乙肝病毒是否出现变异，及变异类型，有利于临床诊断及医生的对症下药。
2、通过乙肝病毒变异耐药检测技术，医生能够完全掌握患者的病情，比如病毒的类型、数量、传染性大小、病毒对何种药物不起效对何种药物敏感、是否变异，等等。
反映病情变化的一切详细指标。
3、通过乙肝病毒变异耐药检测还可以了解到乙肝患者容易对哪类药物产生耐药，避免了盲目用药的现象出现，同时还能够以检查结果为依据，判断治疗效果，根据患者的具体病情对患者制定最佳的治疗方案，有利于患者病情早日康复。
乙型肝炎病毒对恩替卡韦耐药的检测和初步耐药规律研究的开题报告
乙型肝炎病毒对恩替卡韦耐药的检测和初步耐药规律研究
的开题报告
一、研究背景及意义
乙型肝炎病毒（HBV）是一种具有广泛传播和严重危害的病毒，感染者约有2亿至3亿。
目前已有多种抗病毒药物用于HBV感染的治疗，其中恩替卡韦是一种广泛应用的抗病毒药物。
然而，近年来报道了恩替卡韦耐药现象的出现，这给HBV感染的治疗带来了严重挑战。
因此，对HBV感染者进行恩替卡韦耐药检测和初步耐药规律的研究是十分必要的。
二、研究内容及方法
本研究旨在开展对HBV恩替卡韦耐药的检测和初步耐药规律研究。
具体内容包括以下两个方面：
1. 恩替卡韦耐药检测方法的建立
使用克隆技术构建含有HBV全长基因的表达载体，并通过共转染法将该表达载体和分别含有不同点突变的载体共转染至HEK293T细胞中实现HBV突变体的构建。
利用构建好的突变体进行恩替卡韦耐药检测，并比较其耐药程度。
2. 初步耐药规律的探究
收集临床恩替卡韦耐药的患者样本，并对其进行突变检测，以了解不同突变类型与恩替卡韦耐药的关系。
三、预期结果及意义
本研究预期将开发出一种简便、快速、准确的恩替卡韦耐药检测方法，并初步探究HBV突变与恩替卡韦耐药的关系，为临床医生提供更为精准的治疗方案，改善病人治疗效果。
此外，研究结果还能为HBV感染的治疗提供理论指导和实践参考。
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1. HBV 常见变异位点及相关药物
现阶段核苷(酸)类似药物被用于临床抗乙型肝炎病毒的主要是拉米夫定（LAM ）、恩替卡韦（ETV ）、 替比夫定（LdT ）、恩曲他滨（FTC ）、阿德福韦（ADV ）等几种药物,其中拉米夫定（LAM ）耐药变异位点为V173L 、L180M 、A181V/T 、M204V/I/S 等位点的变异，恩替卡韦（ETV ）耐药变异位点为
I169T 、T184A/G/I/S 、L180M 、S202G/I 、M204V/I/S 、M250V 等，替比夫定（LdT ）耐药变异位点常见L180M 、A181V/T 、M204V/I/S ，恩曲他滨（FTC ）耐药变异位点多见于V173L 、L180M 、M204V/I/S ，阿德福韦（ADV ）耐药位点为A181V/T 、N236T 等。
2. HBV 耐药检测常见方法比较
Sanger 测序法：该方法被认为是检测HBV 基因型变异的金标准，能够检测已知和未知的变异位点，但是该方法只能定性不能定量，且操作程序较复杂，对病毒突变检测的灵敏度不高，仅能检测出20-30%以上的突变株。
焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术：适于已知短序列的测序分析，其可重复性和精确性能与Sanger 测序法相媲美，而速度却大大的提高，还具备同时对大量样品进行测序分析的
能力，为大通量、低成本、适时、快速、直观地进行单核苷酸多态性(single nucle—otide potymorphisms，SNPs)研究和临床检验提供了非常理想的技术操作平台。
该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，操作非常简便。
其具有以下优点：不需要制胶，不需要毛细管，也不需要荧光染料和同位素，序列分析简单，结果准确可靠，在临床检测应用上有优势。
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