蛋白质的理化性质及其分离纯化
蛋白质的分离纯化
蛋白质的分离纯化蛋白质是生命体中最基本的分子之一，它在细胞内发挥着重要的功能。
由于蛋白质的复杂性和多样性，研究人员通常需要从复杂的混合物中分离和纯化蛋白质。
蛋白质的分离纯化是生物化学和生物技术领域中非常重要的一项工作，它为我们深入研究蛋白质的结构和功能提供了必要的条件。
蛋白质的分离纯化可以通过多种不同的方法实现，这些方法包括离心法、凝胶过滤法、电泳法、层析法等。
在选择合适的方法时，研究人员需要考虑到蛋白质的特性以及实验的要求。
离心法是最常用的分离方法之一，在离心过程中，通过调整离心力和离心时间，可以实现不同密度的蛋白质的分层。
这种方法适用于分离大分子量的蛋白质。
凝胶过滤法是利用孔径不同的凝胶将蛋白质分离开来。
通常使用的凝胶有琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶，这些凝胶具有不同的孔径，可以根据蛋白质的分子量选择合适的凝胶进行分离。
电泳法是基于蛋白质的电荷和分子量差异而进行分离的方法。
最常用的电泳方法是SDS-PAGE电泳，通过使用SDS（十二烷基硫酸钠）对蛋白质进行解性和蛋白质间的形成复合物，使得蛋白质在电泳过程中仅仅受到电场力的影响，从而实现蛋白质的分离。
层析法是一种利用物质在载体上的分配和吸附性质进行分离的方法。
常见的层析方法有凝胶层析、亲和层析、离子交换层析等。
凝胶层析是通过利用载体颗粒的孔径进行分离，亲和层析是将特定配体固定在载体上，与目标蛋白质结合，从而实现分离，而离子交换层析是利用载体表面电荷与目标蛋白质的电荷相互作用进行分离。
在进行蛋白质的分离纯化时，需要注意以下几个关键步骤。
首先是样品制备，通常样品要经过细胞破碎、蛋白质提取等步骤，使得目标蛋白质从复杂的混合物中提取出来。
其次是样品的处理，包括去除杂质、调整蛋白质的溶液环境等。
然后是选择合适的分离方法，根据蛋白质的特性和实验要求来确定最适合的方法。
最后是纯化过程中的监测和分析，通过使用各种蛋白质分析方法，如SDS-PAGE、Western blot等，来确定目标蛋白质的纯化程度和鉴定其存在。
蛋白质的特性和分离纯化
∷
5、渗透压法和扩散法
两分子双缩脲与碱性硫酸铜作用，生成紫红色的复合物含有两个或两个以上肽键的化合物，能发生同样的反应肽键的反应，肽键越多颜色越深
受蛋白质特异性影响小
蛋白质定量测定；测定蛋白质水解程度
双向电泳（2D电泳）
第一向电泳：等电聚焦电泳
第二向电泳：SDS-聚丙烯酰胺凝胶
电泳
蛋白质组（proteome）是指一个细胞、一种组织甚至是一种物种的全部蛋白质成分。
蛋白质组学（proteomics）就是研究某种细胞、某种组织或某种物种的全部蛋白质成分的含量、结构、功能和相互作用方式。
蛋白质组学的关键点是将全部蛋白质作为一个整体来研究。
蛋白质的理化性质与分离纯化
生物 化学
1 理化性质
(1) (2) (3) (4) (5) (6)
第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化
酸碱性质
分子量
胶体性质 紫外吸收 变性作用 化学反应
分离纯化 分析鉴定
RT Mr = lim π c→0 c
蛋白质的分子量
化学组成法 SDS-PAGE法 SDS-PAGE法 凝胶过滤法 渗透压法 沉降系数法和沉降平衡法
生物 化学
1 理化性质
(1) (2) (3) (4) (5) (6)
第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化
蛋白质紫外吸收
大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙 氨酸、酪氨酸和色氨酸。 氨酸、酪氨酸和色氨酸。 这三种氨基酸的在280nm 这三种氨基酸的在280nm 附近有最大 吸收，使得大多数蛋白质在280nm 吸收，使得大多数蛋白质在280nm 附近 显示强的吸收。 显示强的吸收。 利用这个性质， 利用这个性质，可以对蛋白质进行定 性鉴定。 性鉴定。
酸碱性质 分子量 胶体性质
紫外吸收
变性作用 化学反应
分离纯化 分析鉴定
生物 化学
1 理化性质
(1) (2) (3) (4) (5) (6)
第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化
蛋白质变性、 蛋白质变性、沉淀与凝固 蛋白质的变性作用(denaturation) 变性后的蛋白质由于疏水基团 某些物理或化学因素，： 某些物理或化学因素，破坏蛋白质的结构 变性蛋白质的性质改变： 变性蛋白质的性质改变 状态， 状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生 的暴露而易于沉淀， ，溶解度下降 物理性质：旋光性改变， ①的暴露而易于沉淀，但沉淀的蛋白 ， 物理性质：旋光性改变 溶解度下降， 理活性丧失，称为蛋白质的变性。 理活性丧失，称为蛋白质的变性。 沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等； 沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等； 质不一定都是变性后的蛋白质。 质不一定都是变性后的蛋白质。 蛋白质变性的实质是次级键的断裂和重排， 蛋白质变性的实质是次级键的断裂和重排， 化学性质：官能团反应性增加， ② 化学性质：官能团反应性增加，易被 有些变性蛋白质在一定条件下还 不涉及肽键的断裂。 不涉及肽键的断裂。 蛋白酶水解。 蛋白酶水解。 引起蛋白质变性的因素 。 可以复性，是可逆变性。 生物学性质：原有生物学活性丧失， ③可以复性，是可逆变性 生物学性质：原有生物学活性丧失， 物理因素： ① 物理因素：高温、高压、紫外线、电离 抗原性改变。 抗原性改变。 高温、高压、紫外线、 加热使蛋白质变性并凝聚成块状 辐射、超声波、机械剪切等； 辐射、超声波、机械剪切等； 称为凝固。因此， 强碱、有机溶剂 化学因素：强酸、 ② 称为凝固。因此，凡凝固的蛋白质 、重 化学因素：强酸、强碱、有机溶剂、 金属盐等。 金属盐等。 一定发生变性。 一定发生变性。
蛋白质的分离纯化(1)
白质的净电荷为零时的pH称等电点（pI）。
蛋白质等离子点： 没有其他盐类干扰时, 蛋白质质子供体基团解离出来
的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的pH称为等 离子点。
二、蛋白质的紫外吸收性质
蛋白质溶液能吸收一定波长的紫外光，主要是由带 芳香环的氨基酸决定的。其在280nm处对紫外吸收能力 的强弱顺序为：
电
电
泳
泳
方
方
向
向
等电聚焦电泳
SDS-PAGE
双向电泳后的凝胶经染色蛋白呈现二维分布图，水平方向反映 出蛋白在pI上的差异，而垂直方向反映出它们在分子量上的差别。
所以双向电泳可以将分子量相同而等电点不同的蛋白质以及等 电点相同而分子量不同的蛋白质分开。
5.层析聚焦(P310)
是根据蛋白质的等电点差异分离蛋白质混合物的柱层析方法。
(polyacrylaminde gel electrophoresis) 电泳
PAGE
样品浓缩成很薄的起始区带（0.1mm）
它以聚丙烯酰胺 凝胶为支持物，一般 制成凝胶柱或凝胶板 （不连续体系）。
浓缩胶 分离胶
凝胶的浓度（孔径大小）、 缓冲液组分和离子强度、 pH以及电场强度都是不同的
分离成单区带
依次洗脱收集后， 通过紫外吸收法测定吸 收峰。
这样大小不同的蛋白 质就被分离开来了。
（二）根据蛋白质溶解度不同的纯化方法
（蛋白质的胶体和沉淀性质）
主要方法： 1：等电点沉淀和PH值控制 2：蛋白质的盐溶和盐析 3：有机溶剂分级分离法 4：改变温度
1.等电点沉淀和PH值控制
即在不改变其它条件的情况下，PH处于等电点时的蛋白质 溶解度达到最低点。而位于等电点两侧的PH条件下蛋白质的溶
简述一般根据蛋白质的哪些性质分离、纯化蛋白质
离子交换层析 带正电的离子交换树 脂结合带负电的蛋白。
（四）利用选择性吸附的纯化 方法
疏水作用层析是根据蛋白质表面的疏 水性差别。
在疏水作用层析中，不是暴露的疏 水基团促进蛋白质与蛋白质之间的相互 作用，而是连接支持介质(如琼脂糖)上 的疏水基团与蛋白质表面上暴露的疏水 基团结合。
由于疏水作用层析要求盐析化合物 如硫酸铵的存在以促进蛋白质分子表面 的疏水区暴露。为使吸附达到最大，可
电泳法原理
2、离子交换层析法
蛋白质对离子交换剂的结合力取 决于彼此间相反电荷基团的静电吸引， 而这和溶液的pH有关，离子交换剂有阳 离子交换剂 （羧甲基纤维素 ）和阴离子 交换剂（二乙氨基乙基纤维素 ），当被 分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱 时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白 质被吸附在离子交换剂上，随后用改变 pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱 下来。
（2）pH值带净电荷越多，它的溶解度就越大。改 变pH值可改变蛋白质的带电性质，因而就改 变了蛋白质的溶解度。远离等电点处溶解度 大，在等电点处溶解度小，因此用中性盐沉淀 蛋白质时，pH值常选在该蛋白质的等电点附 近。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱 而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致 蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋 白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用 偏碱性的提取液。
超滤技术的应用 有很好的前景，应引 起足够的重视。
2、密度梯度（区带）离心
蛋白质沉降不仅决定于它的大小，而且也 取决于它的密度。蛋白质颗粒在具有密度梯度 的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量 和密度小的颗粒沉降的快，并且每种蛋白质颗 粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时， 即停止不前，前后各种蛋白质在离心管中被分 离成各自独立的区带。
蛋白质分离纯化原理
蛋白质分离纯化原理
蛋白质分离纯化的原理主要基于其在溶液中的物理化学性质的差异。
以下是几种常见的蛋白质分离纯化方法及其原理：
1. 溶液pH调节：许多蛋白质在不同pH值下的带电性质不同，可以利用溶液pH的调节来使具有不同电荷的蛋白质发生电离，从而实现分离纯化。
例如，利用离子交换层析法，可以根据蛋白质的带电性质来选择性地吸附和洗脱目标蛋白质。
2. 亲和层析法：某些蛋白质具有与特定小分子结合的能力，可以利用这种亲和性质来实现蛋白质的分离纯化。
常见的亲和层析包括亲和吸附、亲和洗脱和竞争洗脱等步骤。
例如，利用亲和层析柱上特异性结合靶蛋白质的配体，可以选择性地富集和纯化目标蛋白质。
3. 分子量筛选：利用蛋白质的分子量差异进行分离纯化。
常见的方法包括凝胶过滤层析（Gel filtration chromatography）和凝胶电泳（Gel electrophoresis）。
在凝胶过滤层析中，根据蛋白
质的分子量大小，通过孔径大小不同的凝胶来分离不同大小的蛋白质。
而在凝胶电泳中，蛋白质会受到电场的作用而迁移，根据蛋白质在凝胶中的迁移速率和电荷大小来分离不同的蛋白质。
4. 溶剂萃取：利用不同溶剂对蛋白质的亲水性和亲油性差异进行分离的方法。
例如，利用氯仿和甲醇的溶解性差异，可以将蛋白质从溶液中提取至有机相中。
5. 冷沉淀：利用低温和高盐浓度的方法使蛋白质从溶液中沉淀出来。
具有固定温度和浓度阈值的蛋白质会在特定条件下沉淀而分离纯化。
生物化学 第7章 蛋白质理化性质及其分离纯化
蛋白质的沉淀可分为
不变性沉淀∶用于分离活性的天然蛋白质产品。 如：酶、抗体等。
变性沉淀∶用于生物制品中除去蛋白质。
变性后的蛋白质由于 疏水基团的暴露而易 于沉淀，但沉淀的蛋 白质不一定都是变性 后的蛋白质。
变性不一定沉淀，沉淀也不一定变性
使蛋白质沉淀的方法
1. 等电点沉淀 2. 盐析 3. 有机溶剂沉淀 4. 重金属盐沉淀 5. 生物碱试剂沉淀 6. 热变性沉淀
去除尿素 β-巯基乙醇
有活性
无活性
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P300
四、蛋白质的沉淀
当破坏了维持蛋白质胶体稳定的水化膜和表面
电荷，蛋白质胶体失去稳定性，从溶液中析出，这 种现象称为蛋白质的沉淀（precipitation）。
应用:
（1）蛋白质分离纯化 （2）解毒 （3）临床检验 （4）低温贮存
根据蛋白质电离性质，可利用电泳的实 验方法，将蛋白质进行分离、纯化和鉴 定。
电泳（electrophosesis) 带电粒子在电场中向电性相反的电
极移动的现象。
蛋白质在等电点pH条件下，不发生电泳 现象。
电泳（electrophosesis)
二、蛋白质的胶体性质
真溶液的溶质分子的颗粒大小<1nm； 胶体溶液中溶质分子的颗粒大小在1-100nm； 蛋白质分子的相对分子量在1-100万，其颗粒大
盐析（NH4）2SO4
盐析
向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质会 沉淀析出
蛋白质分子表面的疏水区域，聚集了许多水分子，高 盐浓度使水化层被破坏，暴露出的疏水区域，它们发 生相互作用而沉淀
蛋白质是两性电解质。在溶液中的带 电状况主要取决于溶液的pH值。
蛋白质的理化性质及分离分析
食品加工，消毒灭菌等； 非蛋白生物物质提取纯化，终止酶促反应；
生产生活中不利的一面：
活性蛋白制品（酶、抗体）的分离提取和保存；
四、蛋白质的沉淀作用
1. What’s precipitation of protein?
外加一些因素去除蛋白质胶体的稳定因素后，使蛋 白质分子相互聚集而从溶液中析出的现象称为沉淀 （precipitation）。 变性后的蛋白质由于疏水 基团的暴露而易于沉淀， 但沉淀的蛋白质不一定都 是变性后的蛋白质。
蛋白质仍能保持生物活性的沉淀方法
（1）盐析—中性盐沉淀
What’s salt precipitation of protein?
盐溶作用 盐析作用
蛋白质仍能保持生物活性的沉淀方法
（1）盐析—中性盐沉淀
What’s salt precipitation of protein? 定义：在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以 破坏蛋白质的胶体性质，使蛋白质从溶液中 沉淀析出，称为盐析（salt precipitation）。 作用机制: 中和电荷的同时破坏水化膜;
蛋白质的理化性质 及分离分析
蛋白质的理化性质
一、两性性质及等电点 二、胶体性质 三、变性与复性作用 四、蛋白质的沉淀作用 五、沉降作用 六、蛋白质的颜色反应 七、蛋白质的紫外吸收性质
一、蛋白质的两性解离与等电点
蛋白质分子中氨基酸残基的侧链上存在游离的 氨基和羧基，因此蛋白质与氨基酸一样具有两 性解离性质，具有特定的等电点（pI）。
沉降速度法测定分子量的原理； 梯度离心分离蛋白质（氯化铯）；
六、蛋白质的颜色反应
1. 双缩脲反应 2. 茚三酮反应 3. 考马斯亮蓝G250 4. 福林酚试剂反应 5. 黄色反应--芳香族氨基酸的特有反应 6. 米伦氏反应—酪氨酸的特有反应 7. 乙醛酸反应—色氨酸的特有反应 8. 坂口反应—精氨酸特有的反应
蛋白质的理化性质和分离纯化
一、蛋白质的两性电离
蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，
氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条
件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。
* 蛋白质的等电点( isoelectric point, pI) 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成 正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电 荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。
名词解释
等电点（pI） 肽键和肽链 肽平面及二面角 二级结构 三级结构 四级结构 超二级结构 蛋白质变性与复性 分子病 肽 一级结构 结构域
三、是非题 1.构成蛋白质的20种基本氨基酸除脯氨酸外，在结 构上的共同点是与羧基相邻α-碳原子上都有一个氨 基。( ) 2.一个氨基酸在水溶液中或固体状态时是以两性离 子形式存在。( ) 3. .构型的改变必须有旧共价键的破坏和新共价键的 形成，而构象的改变则不发生此变化。( ) 4.肽的命名是从肽链的游离氨基开始的。( ) 5.蛋白质分子中肽链能自由旋转。( ) 6.所有的蛋白质都具有一、二、三、四级结构。.( )
（二）蛋白质的胶体性质
蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自
1 万 至 100 万 之 巨 ， 其 分 子 的 直 径 可 达 1 ～
100nm，为胶粒范围之内。
* 蛋白质胶体稳定的因素 颗粒表面电荷
水化膜
水化膜
+ + + + + + +
带正电荷的蛋白质 脱水作用
酸 碱 在等电点的蛋白质 脱水作用 碱
术。
（四）层析
层析(chromatography)分离蛋白质的原理 待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固 态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋
蛋白质的分离、纯化
胰岛素的分离纯化
胰岛素是一种由胰腺分泌的激素， 具有降低血糖的作用。胰岛素的 分离纯化通常采用离子交换色谱
和结晶法。
胰岛素的分离纯化对于治疗糖尿 病具有重要意义。纯化的胰岛素 可以用于注射，帮助糖尿病患者
控制血糖水平。
在胰岛素的分离纯化过程中，需 要特别注意避免蛋白质的聚集和 变性，以确保产品的安全性和有
利用半透膜，根据不同物质之间的分 子大小和形状差异进行分离。
色谱分离
利用不同物质在固定相和流动相之间 的吸附、分配等作用力差异进行分离。
蛋白质的纯度鉴定
化学分析
电泳分析
利用蛋白质中的特定化学基团进行定量分 析，如测定氨基酸组成和序列、测定肽键 等。
利用不同蛋白质在电场中的迁移率差异进 行分离，再通过染色或放射自显影等技术 进行检测。
有机溶剂沉淀法
利用有机溶剂降低水的介电常数，使 蛋白质发生沉淀。常用的有机溶剂有 乙醇、丙酮等。
离心法
高速离心法
利用高速旋转产生的离心力使溶液中 的悬浮颗粒沉降，从而实现蛋白质的 分离。
超速离心法
在高速离心的基础上，利用密度梯度 离心技术，将不同密度的蛋白质进行 分离。
膜分离法
微滤
利用微孔滤膜，将溶液中的悬浮颗粒和微生物截留，从而实现蛋白质的分离。
蛋白质在水中的溶解度 受pH、离子强度、温度 等因素影响。不同蛋白 质具有不同的溶解度。
蛋白质的分离纯化方法
沉淀法
利用蛋白质的溶解度差异，通过改变 某些条件（如pH、离子强度、温度 等）使蛋白质沉淀析出。
离心分离
利用离心机的高速旋转产生的离心力， 根据不同物质之间的密度和沉降系数 差异进行分离。
膜分离
血红蛋白的分离纯化通常采用色谱技术，如凝胶过滤色谱和离子交换色谱。这些技术可以根据蛋白质 的大小、电荷和疏水性等性质进行分离。
蛋白质分离纯化的一般原则
蛋白质分离纯化的一般原则蛋白质是生物体内重要的功能分子，它们在细胞的结构和功能中扮演着重要角色。
蛋白质的纯化和分离是研究蛋白质结构和功能的基础。
本文将介绍蛋白质分离纯化的一般原则和方法。
蛋白质分离纯化的一般原则是根据蛋白质的物理化学性质进行选择性分离。
蛋白质具有不同的分子量、电荷、溶解性、亲疏水性等特性，可以通过这些特性来实现蛋白质的分离纯化。
蛋白质分离纯化的第一步是提取蛋白质。
提取蛋白质的方法有多种，常见的包括机械破碎、超声波破碎、溶剂提取等。
提取蛋白质的目的是将其从细胞或组织中释放出来，为后续的分离纯化步骤做准备。
蛋白质的分离纯化可以通过多种方法来实现。
其中最常用的方法是色谱技术。
色谱技术基于蛋白质的物理化学性质，将混合溶液中的蛋白质分离开来。
常见的色谱技术包括凝胶过滤色谱、离子交换色谱、亲和色谱、逆相色谱等。
凝胶过滤色谱是一种基于蛋白质分子量的分离方法。
其原理是通过孔径大小选择性地分离不同分子量的蛋白质。
凝胶过滤色谱常用于蛋白质的初步分离和浓缩。
离子交换色谱是一种基于蛋白质电荷的分离方法。
其原理是通过蛋白质与离子交换基质之间的相互作用来实现分离。
离子交换色谱可以根据蛋白质的电荷性质选择性地分离不同电荷的蛋白质。
亲和色谱是一种基于蛋白质与亲和基质之间的特异性相互作用来实现分离的方法。
亲和色谱可以利用蛋白质与亲和基质之间的特异性结合，选择性地分离目标蛋白质。
逆相色谱是一种基于蛋白质亲疏水性的分离方法。
其原理是利用蛋白质与逆相基质之间的亲疏水作用来实现分离。
逆相色谱可以根据蛋白质的亲疏水性选择性地分离不同性质的蛋白质。
还有一些其他的蛋白质分离纯化方法，如电泳、超高速离心、超滤等。
这些方法在特定的实验条件下可以实现蛋白质的分离纯化。
蛋白质分离纯化的一般原则是根据蛋白质的物理化学性质进行选择性分离。
通过选择合适的分离纯化方法，可以有效地分离出目标蛋白质，并去除其他杂质。
蛋白质的纯化程度越高，其质量和活性也就越好，对于后续的研究和应用具有重要意义。
蛋白质的理化性质和分离纯化
（二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀
*使用丙酮沉淀时，必须在0～4℃低温下进行， 丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白 质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以 外，也可用乙醇沉淀。
*盐析(salt precipitation)是将硫酸铵、硫酸钠 或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面 电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质 沉淀。
❖ 4.肽的命名是从肽链的游离氨基开始的。( )
❖ 5.蛋白质分子中肽链能自由旋转。( )
❖ 6.所有的蛋白质都具有一、二、三、四级结构。.( )
❖ 7.蛋白质在pl时其溶解度最小。( ) ❖ 8.pH2.3时，所有氨基酸都带正电荷。.( ) ❖ 9.SDS—PAGE中,肽链越长，结合的SDS分子越多，
（四）蛋白质的紫外吸收
由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸 和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收 峰 。 蛋 白 质 的 OD280 与 其 浓 度 呈 正 比 关 系 ， 因 此可作蛋白质定量测定。
（五）蛋白质的呈色反应
⒈茚三酮反应(ninhydrin reaction)
蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚 三酮反应。
❖ 7.肽键在下列哪个波长具有最大光吸收？（ ） ❖ (A）215nm （B）260nm （C）280nm （D）340nm
（E）以上都不是 ❖ 8.有一多及经酸水解后产生等摩尔的Lys、Gly和Ala。如用胰蛋白酶水解
该肽，仅发现有游离的Gly和一种二肽。下列多肽的一级结构中，哪一个 符合该肽的结构？（ ）
❖ 3.肽链中,共有______个原子同在一个肽平面上。
❖ 4.β-折叠结构的氢键是由邻近两条肽链中一条的______基因 与另一条的_____基之间所形成。
蛋白质纯化方法及原理
蛋白质纯化方法及原理
蛋白质纯化是一种分离和提纯蛋白质的方法，原理是根据蛋白质的物理性质和生物学特征，采用一系列的变换步骤，将所需的蛋白质从蛋白质混合物中分离出来。
可分为三大类：
1. 根据蛋白质的物理性质，采用沉淀、离心或逆流等方法进行纯化。
如：沉淀法：硫酸铵沉淀，盐析沉淀，硝酸铵沉淀；离心法：离心管分离，离心膜分离；逆流法：分子量膜逆流，水溶性膜逆流。
2. 根据蛋白质的生物学特征，采用亲和纯化法，如：抗原-抗体亲和纯化，蛋白质A-转移因子亲和纯化，抗原-转移因子亲和纯化，磷酸化蛋白质-磷酸化转移因子亲和纯化等。
3. 其他纯化方法，如：硅胶柱层析，色谱纯化，胶体免疫沉淀法，细胞外基质凝集，模式分离，DNA结合能力分离等。
Pr结构4
E.都属于色蛋白类
5． 有一血清清蛋白(pI＝6．85)的混合物，在哪种条件下电泳分 离效果最好?
A.pH4.9 B.pH5.9 C.pH6.5
D.pH8.6
E.pH3.5
6. 经凯氏定氮法测定，一血清标本的含氮量为10g/L ，那么，蛋白 质的浓度是多少？ A. 52.5g/L C. 62.5g/L B. 57.5g/L D. 67.5g/L
电泳
带电粒子在 电场力作用 下向着所带 电荷相反的 方向泳动的 现象叫电泳。 利用这一原 理，可以将 蛋白质进行 分离纯化。
板状电泳
等电聚胶电泳
(isoelectric focusing gel IEF)
SDS-PAGE separates proteins by MW
2. 有机溶剂沉淀法：
②有机溶剂浓度不能太高，Pr沉淀后立即分离
（三）层析
（chromatography)
定义：利用混合物中各组分理化性质的差异，在 相互接触的两相（固定相与流动相）之间的分 布不同而进行分离分析的技术方法。 方法：离子交换层析；凝胶层析；吸附层析及亲 和层析等。
离子交换层析法
定义:
利用离子交换树脂作为支持物，将带有不同 电荷的Pr进行分离的方法。 分类:阳离子交换树脂,如羧甲基纤维素等， 阴离子交换树脂,如二乙基氨基乙基纤维素等 原理:带正电荷多的Pr与树脂结合较强，而带正电荷 少的Pr与树脂结合则较弱。用不同浓度的阳离子 洗脱液，如NaCl溶液进行梯度洗脱，通过Na+的离 子交换作用，可以将带有不同正电荷的Pr进行分 离。
8-蛋白质化学6-理化性质与分离分析
蛋白质的理化性质、测定及分离纯化一、蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质及应用●蛋白质分子量大，是一种胶体溶液；●具有特定的空间构象，分子量一定→分子筛层析；●在大部分pH条件下，蛋白质分子同时存在两种电荷→等电点沉淀，盐溶，盐析，电泳，离子交换层析等；●一般而言，蛋白质分子上同时存在疏水和亲水区域→有机溶剂沉淀，疏水层析(反相层析)。
蛋白质的胶体性质蛋白质分子量大，介于一万到百万之间，故其分子的大小已达到胶粒1-100 nm 范围之内。
球状蛋白质的表面多亲水基团，具有强烈吸引水分子的作用，使蛋白质分子表面常为多层水分子所包围--水化膜，从而阻止蛋白质颗粒的相互聚集。
与低分子物质相比，蛋白质分子扩散速度慢，不易透过半透膜，粘度大，在分离提纯蛋白质过程中，可以利用蛋白质的这一性质，将混有小分子杂质的蛋白质溶液置于半透膜制成的透析袋或管内，浮于流动水或适宜的缓冲液中，小分子杂质皆易从袋中透出，保留了比较纯的蛋白质--透析(dialysis)。
颗粒大小：在1-100 nm之间，属胶体，因此溶于水，成为亲水胶体。
稳定亲水胶体的因素：水化膜、表面电荷相同不通透性：半透膜(semipermeable membrane)蛋白质溶液是一种分散系统，蛋白质分子颗粒是分散相，水是分散介质。
分散相质点小于1 nm为真溶液，大于100 nm为悬浊液，介于1-100 nm为胶体溶液。
透析即用半透膜（透析袋）将大分子蛋白质分离出来。
在生物大分子制备过程中除去盐、少量有机溶剂、生物小分子杂质和浓缩样品，透析法最简便。
●透析时，小于MWCO（截留分子量）的分子在透析膜二边溶液浓度差产生的扩散压作用下渗过透析膜，其速度与浓度梯度、膜面积及温度成正比。
欲快速透析可采用直径较小的透析袋以增加膜面积。
常用温度：4℃，升温、更换袋外透析液或用磁力搅拌器，均能提高透析速度。
蛋白质大分子溶液在一定溶剂中超速离心时可发生沉降。
沉降速度与向心加速度之比值即为蛋白质的沉降系数S。
蛋白质的分离与纯化
蛋白质分离纯化的技术流程
蛋白质的分离：利用蛋白质的物理性质和化学性质进行分离，如离心、过滤、沉淀等。
蛋白质的纯化：通过一系列的层析技术、电泳技术等，将蛋白质从复杂的混合物中分离 出来，得到高纯度的蛋白质。
蛋白质的检测：利用蛋白质的生物活性或化学性质进行检测，如免疫分析、质谱分析等。
蛋白质的保存：将分离纯化后的蛋白质进行适当的保存，如低温、干燥等，以保持其生 物活性和稳定性。
蛋白质的稳定性和活性：在分离和纯化过程中，如何保持蛋白质的稳定性和活性是一个重要的问题。一些物理和化学因素可能会导致 蛋白质变性或失活，从而影响其结构和功能。
生物安全和伦理问题：在分离和纯化过程中，需要考虑生物安全和伦理问题。例如，某些病毒或细菌可能会污染蛋白质样 品，因此需要采取适当的措施来确保样品的安全性。同时，在研究过程中也需要遵守伦理规范，确保研究符合道德要求。
步骤：平衡、上 样、洗脱、再生
优点：分辨率高、 分离效果好
疏水相互作用色谱法
原理：利用蛋白质的疏水性差异进行分离
填料：疏水性配基附着在硅胶或琼脂糖颗粒上 操作条件：通过改变流动相的离子强度或极性，选择性地对蛋白质进行洗 脱 应用：适用于蛋白质的精细分离纯化，特别是那些具有强疏水性的蛋白质
亲和色谱法
蛋白质的分离技术
沉淀法
原理：通过改变蛋白质的溶解度或带电状态，使其从溶液中析出 方法：包括盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法等 优点：操作简单、成本低 缺点：可能会产生大量杂质，影响蛋白质的纯度
离心分离法
原理：利用离心机的高速旋转产生 的离心力使不同密度的蛋白质分离
优点：操作简便，分离效果好
在农业领域的应用
提高农产品品质和产量 培育抗逆性强的新品种 促进植物生长和发育 增强植物抗病虫害能力
蛋白质的理化性质
蛋白质的理化性质蛋白质是生物体中最为重要的大分子有机化合物之一，其具有多种理化性质，这些性质直接影响着蛋白质的功能和结构。
本文将着重介绍蛋白质的理化性质，包括分子质量、氨基酸组成、等电点、溶解性、热稳定性和光学性质等方面。
分子质量蛋白质的分子质量通常是指相对分子质量，用该蛋白质的分子质量与碳12的质量相对比得到。
蛋白质的分子质量因其组成氨基酸的种类、序列和数量而异。
一般来说，蛋白质的分子质量范围从数千到数十万不等。
氨基酸组成蛋白质是由氨基酸通过肽键连接而成的，不同蛋白质中的氨基酸组成各异。
氨基酸的类型和数量直接影响着蛋白质的结构和性质。
常见的氨基酸包括20种标准氨基酸，它们各自具有独特的化学结构和性质。
等电点蛋白质的等电点是指在该蛋白质溶液中，净电荷为零的pH值。
蛋白质的等电点与其氨基酸组成密切相关。
当蛋白质的溶液pH值低于等电点时，蛋白质带有正电荷，而当溶液pH值高于等电点时，则带有负电荷。
等电点对于蛋白质在电泳分离和纯化过程中具有重要的意义。
溶解性蛋白质的溶解性在很大程度上取决于其氨基酸组成和环境条件。
一些蛋白质在水中易溶解，而另一些可能需要特定的溶剂或特定的pH值才能溶解。
溶解性对于蛋白质的结构和功能具有重要影响，不溶解的蛋白质可能会失去其生物活性。
热稳定性蛋白质的热稳定性是指其在高温下是否能够保持其原有的结构和功能。
蛋白质的热稳定性受其组成氨基酸的性质和序列的影响。
一些蛋白质在高温下能够保持稳定，而另一些则易于发生变性和失活。
光学性质一些蛋白质具有旋光性，即其能够使得通过它们的光发生旋转现象。
这种旋光性取决于蛋白质分子中的手性氨基酸，如L-氨基酸和D-氨基酸。
光学性质对于鉴定和纯化蛋白质具有一定的重要性。
综上所述，蛋白质具有丰富的理化性质，包括分子质量、氨基酸组成、等电点、溶解性、热稳定性和光学性质等。
这些性质对于蛋白质的结构和功能具有重要的影响，也在蛋白质的研究和应用中发挥着重要的作用。
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第三节蛋白质的理化性质
及其分离纯化一、蛋白质的理化性质
（一）蛋白质的两性电离
（二）蛋白质的胶体性质
（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固（四）蛋白质的紫外吸收
（五）蛋白质的呈色反应
（一）蛋白质的两性电离
蛋白质是由氨基酸构成的，其两端及侧链都含有可解离的酸性基团或碱性基团，
因此在不同pH
的介质中，蛋白质的带电状
态就不同。
Pr
NH3+
COOH
Pr
NH3+
COO-
Pr
NH2
COO-O H-
H +
O H-
H +
兼性离子
pH=pI
阳离子pH<pI 阴离子pH>pI
蛋白质的等电点（pI）
•概念：当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。
•pI是蛋白质的特征性常数。
•利用蛋白质两性电离的性质，可通过电泳、离子交换层析、等电聚焦等技术分离蛋白质。
•pH >pI 带负电荷
•pH <pI 带正电荷
•体内多数蛋白pI为5.0左右，
pH为7.45 时多数蛋白带负电荷。
•如pI 偏于碱性－碱性蛋白质
鱼精蛋白组蛋白•如pI 偏于酸性－酸性蛋白质
胃蛋白酶丝蛋白
（二）蛋白质的胶体性质
•颗粒大小：在1～100nm之间。
属胶体。
因此溶于水，成为亲水胶体。
•稳定亲水胶体的因素：
水化膜
表面电荷
不通透性：半透膜
毛细血管壁
--
-
-
-
-
-
--
-
-
-+
+
+
+
+
+
+
+++
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
（三)蛋白质的变性、沉淀和凝固
1.变性（denaturation）
•概念: 在某些理化因素作用下，蛋白质分子的特定空间构象被破坏，从而导致理化性质的改变和生物活性的丧失。
•变性本质：二硫键和非共价键的破坏引起空间结构的改变，不涉及一级结构的改变。
天然状态，
有催化活性
非折叠状态，
无活性，
二硫键被还原
天然状态，
二硫键恢复，
而且正确配对
尿素或2-巯基乙醇
去除
变性因素
核糖核酸酶
•变性因素：
物理因素：加热、加压、超声波、
紫外线
化学因素：胍、脲、有机溶剂、
强酸强碱、SDS
-巯基乙醇、
重金属离子
生物碱试剂
•蛋白质变性后的理化和生物学性质改变：
溶解度↓
生物活性丧失及易被蛋白酶水解
粘度↑
结晶能力消失、
•应用：消毒灭菌
低温保存生物制剂
•复性(renaturation)：蛋白质的变性程度较轻，去除变性因素后，又恢复了原有的空间构象和生物活性。
•不可逆变性
2. 沉淀(precipitation)
•蛋白质的沉淀：蛋白质的肽链相互聚集而从溶液中析出的现象。
++++
+++-------+-蛋白质胶体颗粒的沉淀（沉淀）
（疏水胶体）（疏水胶体）
•蛋白质的凝固作用（coagulation）
•蛋白质经强酸、强碱作用发生变性后，仍能溶解于强酸或强碱溶液中，若将pH 调至pI，则变性蛋白质立即结成絮状的不溶解物，此絮状物仍可溶解于强酸和强碱中。
如再加热则絮状物可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中，这种现象称为蛋白质的凝固作用。
（四）蛋白质的紫外吸收
•波长：280nm
•引起紫外吸收的因素：主要是色氨酸和酪氨酸( Trp, Tyr)的共轭双键。
•可用于蛋白质的定量
（五）蛋白质的呈色反应•茚三酮反应：肽和氨基酸的自由氨基与茚三酮生成蓝紫色化合物。
•双缩脲反应：蛋白质和肽类分子中的肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈紫红色。
•呈色反应可用于蛋白质的定性和定量。
二、蛋白质的分离和纯化
（一）丙酮沉淀及盐析
（二）电泳
（三）透析
（四）层析
（五）分子筛
（六）超速离心
（一）丙酮沉淀及盐析原理：破坏亲水胶体的两个稳定因素。
•丙酮沉淀：0～4℃，10倍于蛋白质体积
的丙酮，沉淀后立即分离。
•盐析：将大量中性盐（如硫酸铵）加到蛋白质溶液中，破坏蛋白质在水
溶液中的稳定因素，而使之从溶
液中沉淀析出的现象。
（二）电泳（electrophoresis）◆蛋白质在电场中可向其所带电荷相反的方向移动，这种现象叫电泳。
◆由于不同的蛋白质带电多少、分子量大小及分子形状不同，因此在电场中泳动的速度就不同，从而可将蛋白质分离开来。
◆应用：分离蛋白质和测分子量
（三）透析（dialysis）
◆蛋白质是高分子化合物，不能透过半透膜。
将蛋白溶液装入用半透膜制成的透析袋中，可将蛋白质溶液中的小分子化合物除去，这种方法叫透析。
◆如在袋外放吸水剂（如聚乙二醇）还可达到浓缩的目的。
◆应用：除盐和浓缩
超滤
◆利用超滤膜在压力下使大分子滞留，而小分子及溶剂滤过的方法叫超滤。
◆超滤法在蛋白质溶液除盐、浓缩及分离纯化中有广泛的应用。
（四）层析（chromatography）
◆离子交换层析：根据蛋白质的电荷与层析载体（离子交换剂）电荷之间的相互作用而达到分离目的。
◆应用：分离蛋白质
阴离子交换树脂
（五）分子筛
◆根据多孔载体对不同大小，形状的蛋白分子的排阻能力不同而将各个组分分开的一种层析，又称凝胶过滤层析。
◆应用：分离蛋白质、除盐
（六）超速离心
（ultracentrifugation）•不同蛋白质的密度与形态各不相同，在离心力场中沉降的速度也不同，从而将其分离。
•蛋白质在离心场中的行为用沉降系数（S）表示。
•S与蛋白质大体上和分子量成正比关系。
•S与蛋白质的密度和形状相关，如分子量相同，紧密颗粒的摩擦系数小－沉降快；而疏松颗粒的摩擦系数大－沉降慢。
•应用：蛋白质的分离纯化和测分子量。
多肽链AA序列分析
改进的Sanger法
1.分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成。
2.测定多肽链的N-端与C-端的氨基酸残基。
3.把肽链水解成肽段，再分离纯化肽段。
4.测各肽段的氨基酸排列顺序。
5.经过组合排列对比，得出完整肽链中氨
基酸顺序。
水解肽链的方法及特征
裂解剂裂解位点
胰蛋白酶Lys、Arg（C）
胰凝乳蛋白酶Phe、Tyr、Trp（C）
弹性蛋白酶Ala、Gly、Ser、Val（C）胃蛋白酶Phe、Trp、Tyr（N）
溴化氰Met（C）
羟胺Asn—Gly
通过核酸推演的方法
分离编码蛋白质的基因
测DNA序列
排列出mRNA的序列
按照三联体密码推演出氨基酸的序列
本次课重点
◆蛋白质的三、四级结构
◆蛋白质的pI
◆维持蛋白质胶体稳定的因素
◆蛋白质的变性
◆蛋白质的紫外吸收
◆蛋白质分离纯化的方法及基本原理
复习题
1.名词解释：肽单元模序结构域
蛋白质的一、二、三、四级结构2.蛋白质的基本组成单位是什么？有多少种？按侧链的结构和功能不同可分为几类？各包括哪些氨基酸？
3.蛋白质的二级结构有几种？各有何特征，由什么化学键维持？。