蛋白质杂交技术

（三）转膜缓冲液
39mmol/L 甘氨酸 48mmol/L Tris碱 0.037% SDS
20% 甲醇
（四）染色液与脱色液 1．考马斯亮蓝R250染液 100mg考马斯亮 蓝R250溶于40ml 乙醇，加10ml冰醋酸，补 水至100ml。 2．考马斯亮蓝脱色液 40ml 乙醇，加10ml 冰醋酸，补水至100ml。 3．丽春红S贮存液 2g丽春红S，30g三氯乙 酸，30g磺基水杨酸，加水至100ml。
经双丙烯酰胺交联后丙烯酰胺凝胶的 刚性和抗张强度都有所增加，形成的小 孔必须能够允许SDS蛋白复合物通过
这些小孔的孔径随双丙烯酰胺、丙烯 酰胺比率的增加而变小，比率接近1:20 时孔径达到最小值。一般按双丙稀酰胺、 丙烯酰胺为1:29配制
表1 SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围
丙烯酰胺浓度 （％）
2×蛋白上样缓冲液 100mmol/L Tris·Cl(pH 6.8) 200mmol/L二硫苏糖醇（DTT） 4% SDS(十二烷基硫酸钠) 0.2% 溴酚蓝 20%甘油
（二）SDS-PAGE试剂 1．30%丙烯酰胺溶液 丙烯酰胺30g、双
丙烯酰胺0.8g，溶于100ml水中，过滤后贮
于褐色瓶中低温保存，可用一个月。
溶液成分 （ml）
5%积 层胶
水
3.4
30%丙稀酰胺 0.83
1.5mol/L
－
Tris(pH8.8)
1.0mol/L Tris(pH6.8)
0.63
10%SDS
0.05
10%过硫酸胺 0.05
TEMED
0.005
总体积（ml） 5
不同浓度的分离胶 6% 8% 10% 12% 5.3 4.6 4.0 3.3 2.0 2.7 3.3 4.0
2．Tris缓冲液 （1）1.5mol/L Tris(pH8.8)/积层胶缓冲液： Tris碱 18.17g，用HCl调pH8.8，加水至 100ml。 （2）1.0mol/L Tris(pH6.8)分离胶缓冲液： Tris碱 12.11g，用HCl调pH6.8，加水至 100ml。
3．10% SDS 可用去离子水配成贮存液 保存于室温。 4．10%过硫酸胺 过硫酸胺提供丙烯酰胺和双丙烯酰胺 聚合所必需的自由基。 可用去离子水配制小量的贮存液并保 存于4℃冰箱中。 由于过硫酸胺会缓慢分解，故应隔周 重新配制。
2.5 2.5 2.5 2.5
－ －－
－
0.1 0.1 0.1 0.1
0.1 0.1 0.1 0.1
0.008 0.006 0.004 0.004
10 10 10
10
15% 2.3 5.0 2.5
－ 0.1 0.1 0.004 10
（3）迅速在两板的间隙灌注丙烯酰胺溶 液，留出积层胶所需空间（梳子的齿长 再加1cm）。然后小心的在丙烯酰胺溶液 上加一层去离子水。凝胶垂直放置于室 温下。 （4）分离胶聚合完全后（约30min）， 倾斜倒出覆盖的去离子水。 （5）配制5%积层胶。
检测DNA可用Southern印迹法
检测RNA可用Northern印迹法
检 测 蛋 白 质 同 样 有 蛋 白 质 印 迹 法 （Western印迹法）
蛋白质印迹是将蛋白质转移到固相支 持物上，然后利用抗体与附着于固相支 持物上的靶蛋白发生特异性的抗原抗体 结合反应
一、原理
待测 样 品经 过 SDS 聚丙 烯酰 胺 凝胶电 泳 （SDS-PAGE）
使用时，将1份上述贮存液加9份去离子 水即为丽春红S应用液，使用后应废弃。
（五）封闭液
5％脱脂奶粉 0.01% 防沫剂A 0.02%叠氮钠 溶于磷酸盐缓冲液（PBS）
三、实验方法
（一）样品前处理 细菌一般直接用蛋白上样缓冲液裂解； 真核细胞或哺乳动物组织通常加细胞裂解 液，机械或超声波室温匀浆0.5min～1min。 4℃ 10,000g～13,000g离心5min，取上清 按照每4μl蛋白样品加入1μl 5×蛋白上样缓 冲液的比例混合。100℃水浴加热3min～ 5min，以充分变性蛋白。 冷却到室温，上样到SDS-PAGE胶加样孔
被转移到固相支持物上，固相支持物以非 共价键的形式吸附蛋白质
以固相支持物上的蛋白质为抗原，与对应 的抗体发生特异性的抗原抗体结合反应
与酶或同位素标记的第二抗体发生反应
经过底物显色或放射自显影，以检测电泳 分离的靶蛋白。
Western印迹有SDS-PAGE的高分辨力
固相免疫测定的高特异性和敏感性，可 测出1ng～5ng中等大小的蛋白质。
由于蛋白质的电泳分离几乎总是在变性 的条件下进行，因此，不存在溶解、聚集 以及靶蛋白与外来蛋白的共沉淀等问题。
还具有简便、标本可长期保存、结果便 于比剂 1．细胞裂解液
20mmol/L Tris(pH 7.5) 150mmol/L NaCl 1% Triton X-100 焦磷酸钠，β-磷酸甘油，EDTA，正钒酸钠 (Na3VO4)亮抑肽素等多种蛋白酶抑制剂
5．TEMED（N,N,N′,N′－四甲基乙二胺） 通过催化过硫酸胺形成自由基而加速丙烯 酰胺与双丙烯酰胺的聚合。 6．Tris-甘氨酸电泳缓冲液 配成10×贮存液备用，在900ml去离子水 中溶解30g Tris碱和144g甘氨酸，然后加入 10g SDS，用HCl调pH至8.3，用去离子水 补至1000ml。 使用前用去离子水稀释成1×应用液。
（二）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
原理是根据大多数蛋白质都能与阳离子 表面活性剂SDS按重量比结合成复合物
使蛋白质复合物所带的负电荷远远超过 天然蛋白质分子所带的负电荷，消除了 不同蛋白质分子的电荷效应
蛋白质分子的迁移速率完全取决于分子 量的大小，从而达到了分离不同分子量 大小蛋白质的目的
胶有效分离范围取决于用于灌胶的聚 丙烯酰胺的浓度和交联度。
15
线性分离范围 （kD）
12～43
10
16～68
7.5
36～94
5
57～212
1．SDS聚丙烯酰胺凝胶的灌制
（1）安装玻璃板
（2）确定凝胶溶液体积，按所需丙烯酰 胺浓度配制一定体积的分离胶溶液。
依次混合各成分（见下表） 一旦加入TEMED，马上开始聚合，故 应立即快速旋动混合物并进入下步操作
表2 积层胶、分离胶所需溶液成分的配比