γ-干扰素在反相高效液相色谱柱上色谱行为与分离的研究
IFN-γ研究进展与临床应用
IFN-γ研究进展与临床应用作者：李靖，董文学，杨美盼，等来源：《卫生职业教育》 2019年第23期李靖1，董文学2，杨美盼1，马利锋1，康龙丽1（1.西藏民族大学医学部高原相关疾病分子遗传机制与干预研究重点实验室，陕西咸阳712082；2.西藏民族大学医学部基础医学院，陕西咸阳 712082）摘要：干扰素是细胞被病毒感染时产生的一类细胞因子，调控感染后固有免疫和获得性免疫反应。
干扰素γ作为干扰素家族的一员，已被广泛应用于自身免疫疾病的治疗中。
本文概述IFN-γ的定义、结构、理化特性、来源、生物学活性、临床应用等，讨论IFN-γ的应用前景。
关键词：干扰素；IFN-γ；分子结构；作用机制；临床应用中图分类号：R593.2文献标识码：A文章编号：1671-1246（2019）23-0157-03干扰素（Interferon）由英国病毒学家Alick Isaacs和瑞士研究者Jean Lindenmann在研究病毒的干扰现象时发现，他们在鸡胚绒毛膜尿囊膜的培养液中加入流感病毒，发现产生了一类抗病毒物质，并命名为干扰素[1]。
干扰素是细胞被病毒感染时产生的一类细胞因子，调控感染后固有免疫和获得性免疫反应[2]。
国际干扰素命名委员会按干扰素的抗原特异性将其分为3型：IFN-α、IFN-β和IFN-γ，各型又因氨基酸序列的不同分为若干个亚型，IFN-γ可能有4个亚型[3]。
IFN-α和IFN-β属于Ⅰ型干扰素，为病毒或人工合成的聚核苷酸诱导白细胞产生，IFN-γ为特异性抗原（细菌、LPS）、PHA和卡介苗（BCG）等刺激T细胞产生。
因此，干扰素γ（IFN-γ）作为干扰素家族的一员，也是一类多功能、活性高的细胞因子。
1 IFN-γ概述1.1 IFN-γ的分子结构ISG（干扰素基因）为编码IFN-γ的基因，位于人类12号染色体（12q24.1），长6 kb，基因中包含3个内含子和4个外显子。
IFN-γ由146个氨基酸组成，其活性形式为二聚体结构，由两个完全相同的多肽链组合而成，多个内部螺旋（螺旋E、螺旋F）将两部分紧密地连在一起，保持其生物学活性，并确保Ⅱ型干扰素与Ⅰ型干扰素有最低程度的同源性。
γ干扰素释放实验的原理
γ干扰素释放实验的原理γ干扰素（Interferon gamma，IFN-γ）是一种由免疫细胞产生的重要分子信号物质，对机体的免疫反应起着重要的调节作用。
γ干扰素释放实验是一种评估机体免疫功能的常用方法之一，可以检测特定细胞（通常是T细胞）对某种刺激物质引起的γ干扰素分泌反应。
γ干扰素释放实验的原理主要涉及以下几个方面：1. 细胞样本的准备：γ干扰素释放实验通常使用外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）或组织细胞作为细胞样本。
这些细胞样本可以通过静脉采集外周血或组织活检等方式获取。
在实验前，需要对细胞进行处理，如离心、洗涤和培养，以确保细胞的状态良好并有足够的数量。
2. 刺激物质的选择：γ干扰素释放实验中常用的刺激物质主要包括抗原、药物或其他具有免疫刺激性的物质。
抗原可以是病原体的特异性成分，如细菌、病毒或其他微生物产生的蛋白质或多肽。
药物刺激物可以是某些药物对机体免疫系统的直接或间接作用引起的免疫反应。
刺激物质的选择应该与样本来源和实验目的相匹配。
3. 实验方法的选择：γ干扰素释放实验可以通过多种方法进行，如ELISA（酶联免疫吸附测定法），ELISPOT（酶联免疫斑点法），流式细胞术等。
这些方法的选择取决于实验的需要和可用设备的条件。
比较常用的方法是ELISPOT法，该方法可以评估单个细胞生产γ干扰素的能力，形成的斑点数量与细胞产生的γ干扰素水平成正比。
4. 数据分析：γ干扰素释放实验得到的数据需要进行合理的分析和解释。
通常，根据刺激物质和实验目的的不同，可以采用差异分析、统计学方法等对数据进行处理。
数据的分析和解释可以为研究者提供了解细胞免疫功能的信息。
通过γ干扰素释放实验，我们可以了解机体对刺激物质的免疫反应程度和免疫调节功能。
这对于疾病的诊断、药物研发和免疫治疗等方面具有重要意义。
总结回顾：γ干扰素释放实验是一种评估机体免疫功能的方法，通过检测特定细胞对刺激物质引起的γ干扰素分泌反应来评估免疫反应的程度和调节能力。
γ干扰素的抗病机制及临床应用
γ干扰素的抗病机制及临床应用γ干扰素（gamma interferon，以下简称γ干扰素）是一种重要的免疫调节因子，对机体的抗病能力具有关键作用。
本文将探讨γ干扰素的抗病机制及其在临床中的应用。
一、γ干扰素的抗病机制1. 免疫调节作用γ干扰素可促进免疫系统的活化，增强巨噬细胞、T淋巴细胞和自然杀伤细胞的杀伤活性。
它能增强巨噬细胞吞噬效果，提高抗体依赖性细胞毒性（ADCC）反应，抑制病毒复制，并增强细胞介导的免疫反应。
2. 抑制炎症反应γ干扰素能抑制多种炎症因子的产生，包括肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）等。
它通过抑制炎症反应的发生和进一步发展，减轻组织损伤和疾病的严重程度。
3. 促进细胞凋亡γ干扰素可以通过多个途径促使肿瘤细胞发生凋亡。
它能够激活凋亡相关的信号通路，抑制肿瘤细胞的增殖和生存，从而达到抑制肿瘤发展的效果。
4. 抗病毒作用γ干扰素在抵抗病毒感染方面具有重要作用。
它能够抑制病毒的复制和传播，增强抗病毒免疫反应，提高机体的抗病毒能力。
临床应用于治疗乙型肝炎、丙型肝炎等病毒感染性疾病时，显示出明显的疗效。
二、γ干扰素的临床应用1. 肿瘤治疗γ干扰素能够通过多种机制抑制肿瘤的生长和转移。
它可激活免疫细胞，增强免疫杀伤效应，对多种实体肿瘤显示出一定的抑制作用。
此外，γ干扰素还能通过抑制血管生成和改变肿瘤细胞的凋亡信号通路来影响肿瘤的生长和进展。
2. 感染性疾病治疗γ干扰素在感染性疾病的治疗中具有广泛的应用前景。
它可以增强机体的抗病毒能力，抑制病毒的复制和传播，加速疾病的康复。
临床上常用于治疗乙型肝炎、丙型肝炎等病毒感染性疾病，也可用于治疗结核病、艾滋病等疾病的辅助治疗。
3. 免疫性疾病治疗γ干扰素可以调节机体的免疫反应，对于某些免疫性疾病具有治疗效果。
例如，对于类风湿关节炎、克罗恩病等自体免疫性疾病，γ干扰素可通过调节免疫系统功能，减轻病情，改善患者的生活质量。
γ干扰素释放试验标准操作流程
γ干扰素释放试验标准操作流程γ干扰素释放试验标准操作流程概述•γ干扰素释放试验（gamma interferon release assay）是一种用于检测某些感染病原体引起的细胞免疫反应的方法。
•本文将详细说明γ干扰素释放试验的标准操作流程，包括前期准备、实验步骤、数据分析等内容。
前期准备1.确保实验室拥有所需设备和试剂。
2.准备受试者血样（采用血液抽取方法）。
3.验证实验室的操作人员已经接受相关培训，熟悉操作步骤和安全注意事项。
实验步骤1.血样准备–将采集的血样转移到合适的试验管中，确保血样完整且无凝块。
–使用离心机离心血样，将血细胞和血浆分离开来。
2.细胞培养–取得合适的细胞培养板，加入培养基。
–将离心后的血细胞加入培养基中，控制细胞密度在合适范围内。
–孵育细胞，保持适当的温度、湿度和二氧化碳浓度。
3.刺激试剂添加–在培养的细胞上加入激发剂，如特定抗原。
–同时设置阴性对照（如未加刺激剂的细胞）和阳性对照（如已知患者血样）。
4.孵育试验–将细胞培养板放入恒温箱中，保持合适的孵育时间和条件。
–注意观察培养过程中的任何异常变化，记录相关信息。
5.液相检测–采用合适的方法（如ELISA等）检测培养液中的γ干扰素水平。
–按照厂家指南操作试剂盒，记录结果并进行质量控制的数据分析。
1.收集所有实验数据，包括阳性对照、阴性对照和受试者样本的γ干扰素水平测定结果。
2.进行质量控制分析–首先，检查实验数据是否符合预期的范围。
–其次，对比阳性对照和阴性对照的水平，确保实验结果可靠。
3.数据解释–根据实验结果判定受试者是否对特定抗原产生γ干扰素反应。
–结合临床资料和相关标准，进行结果的解读和诊断。
结论•本文提供了γ干扰素释放试验标准操作流程的详细说明，以帮助实验室完成该项实验。
•严格按照操作流程进行实验可提高实验的可重复性和结果的准确性。
•数据分析部分应根据实验目的和临床背景进行合理解读，以辅助疾病的诊断和研究。
γ-干扰素释放试验在结核病诊断中的价值研究
γ-干扰素释放试验在结核病诊断中的价值研究摘要：目的：探究γ-干扰素释放试验在结核病诊断中的研究价值为结核病的诊断提供更多依据。
方法：收集乐山市人民医院2020年1月到2022年12月的IGRA检测结果。
结果：在6697份IGRA检测样本中，阳性率为53.7%。
其中，2020年阳性率为55.4%；2021年阳性率为55.1%；2022年阳性率为50.8%。
2020年男性就诊患者阳性率为61.4%；女性就诊患者阳性率为48.4%。
2021年男性就诊患者阳性率为58.5%；女性就诊患者阳性率为50.8%。
2022年男性就诊患者阳性率为58.7%；女性就诊患者阳性率为39.7%。
结论：乐山地区IGRA检出率相对较高，IGRA可以作为辅助诊断活动性结核的手段，敏感度较好，阴性预测值高，对于结核的排除有较高的价值。
但其特异性不理想，需要注意鉴别诊断。
关键词：结核；IGRAAbstract:Objective:To explore the research value ofγ-interferon release test in tuberculosis diagnosis and provide more evidence for tuberculosis diagnosis.Methods: The results of IGRA detection in Leshan People's Hospital from January 2020 to December 2022 were collected.Results: Among the 6697 IGRA test samples, the positive rate was 53.7%. Among them, the positive rate in 2020 was 55.4%; The positivity rate in 2021 was 55.1%; The positivity rate in2022 was 50.8%. In 2020, the positive rate of male patients was 61.4%; The positive rate of female patients was 48.4%.In 2021, the positive rate of male patients was 58.5%; The positive rate among women presenting to the clinic was 50.8%. In 2022, the positive rate of male patients was 58.7%; The positive rate of female patients was 39.7%.Conclusion:The detection rate of IGRA in Leshan area is relatively high,and IGRA can be used as an auxiliary means to diagnoseactive tuberculosis, with good sensitivity and high negative predictive value, which has high value for the exclusion of tuberculosis. However, its specificity is not ideal, and differential diagnosis is required.Keywords:Tuberculosis;IGRA结核病（Tuberculosis，TB）是严重威胁人类健康的疾病，每年有数百万人死于结核病，据世界卫生组织2019年发布的全球结核病报告指出，2018年全球新增约1000万结核病例，约150万人死于结核病。
两种IGRA检测方法诊断结核分枝杆菌潜伏感染的效能分析
两种IGRA检测方法诊断结核分枝杆菌潜伏感染的效能分析发表时间：2014-07-08T16:04:16.390Z 来源：《中外健康文摘》2014年第1期供稿作者：栗方芝李娜娜石亚萍贺仁忠（通讯作者）陈玲[导读] 结核病是由结核分枝杆菌（MTB）引起的一种严重危害人类健康的慢性传染病。
栗方芝李娜娜石亚萍贺仁忠（通讯作者）陈玲（贵州省遵义医学院附属医院呼吸二科呼吸医学研究室贵州遵义 563003）【摘要】目的比较γ-干扰素释放试验TB-IGRA和T-SPOT.TB检测结核分枝杆菌潜伏感染的效能和一致性。
方法分别用TB-IGRA和T-SPOT.TB两种方法对18例志愿者、4例涂阳肺结核患者及1例非结核分枝杆菌感染者的外周血标本中特异性γ-干扰素的含量进行检测，进行平行比较分析。
结果 TB-IGRA法和T-SPOT.TB法的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值均为100%,2种方法的Youden指数均为1，差异无统计学意义(P＞0.05)。
结论 TB-IGRA和T-SPOT.TB两种方法在诊断结核分枝杆菌潜伏感染方面有较好的效能和一致性，有临床应用价值，阴性结果在结核病鉴别诊断中有较重要的临床意义。
【关键词】结核分枝杆菌潜伏感染 γ-干扰素释放试验 TB-IGRA T-SPOT.TB【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085（2014）01-0026-02 【Abstract】 Objective To compare efficiency and consistency of type interferon gamma release assay on detecting mycobacterium tuberculosis latent infection by two different methods of TB-IGRA and T-SPOT.TB. Method Detect the specific IFN-γ of 18 volunteers, 4 patients with smear positive pulmonary tuberculosis, 1 case of non tuberculous mycobacterial infection for parallel comparative analysis by the two different methods. Results Sensitivity, specificity, positive predictive value, and negative predictive value of TB -IGRA and T-SPOT.TB were 100%, Youden index of the two methods was 1, indicating no statistically significant (P > 0.05). Conclusion TB-IGRA and T-SPOT.TB have good consistency in the diagnosis of mycobacterium tuberculosis latent infection with a good clinical application value, and the negative result has a valuable significance in the differential diagnosis of tuberculosis.【Key words】Mycobacterium tuberculosis Latent infections Interferon gamma release assay TB-IGRA，T-SPOT.TB结核病是由结核分枝杆菌（MTB）引起的一种严重危害人类健康的慢性传染病，本世纪80年代中期以来在全球出现回升趋势，结核分枝杆菌潜伏感染(LTBI)的早发现、早诊断是预防与控制结核病的重要手段之一[1，2]。
高效液相色谱分析法概述
高效液相色谱分析技术及其新的发展与应用余建军(陕西科技大学生命科学与工程学院，西安710021)1 高效液相色谱法概述高效液相色谱法（high performanc，liquid chromatography，HPLC）是在经典液相色谱法基础上发展起来的一种新型分离、分析技术。
经典液相色谱法由于使用粗颗粒的固定相，填充不均匀，依靠重力使流动相流动，因此分析速度慢，分离效率低。
新型高效的固定相、高压输液泵、梯度洗脱技术以及各种高灵敏度的检测器相继发明，高效液相色谱法迅速发展起来[1]。
高效液相色谱法与经典液相色谱法比较，具有下列主要特点：（1）高效由于使用了细颗粒、高效率的固定相和均匀填充技术，高效液相色谱法分离效率极高，柱效一般可达每米104理论塔板。
近几年来出现的微型填充柱（内径lmm）和毛细管液相色谱柱（内径0.05umm），理论塔板数超过每米105，能实现高效的分离。
（2）高速由于使用高压泵输送流动相，采用梯度洗脱装置，用检测器在柱后直接检测洗脱组分等，HPLC完成一次分离分析一般只需几分钟到几十分钟，比经典液相色谱快得多。
（3）高灵敏度紫外、荧光、电化学、质谱等高灵敏度检测器的使用，使HPLC 的最小检测量可达10-9～10-11g（4）高度自动化计算机的应用，使HPLC 不仅能自动处理数据、绘图和打印分析结果，而且还可以自动控制色谱条件，使色谱系统自始至终都在最佳状态下工作，成为全自动化的仪器。
（5）应用范围广（与气相色谱法相比）HPLC 可用于高沸点、相对分子质量大、热稳定性差的有机化合物及各种离子的分离分析。
如氨基酸、蛋白质、生物碱、核酸、甾体、维生素、抗生素等。
（6）流动相可选择范围广它可用多种溶剂作流动相，通过改变流动相组成来改善分离效果，因此对于性质和结构类似的物质分离的可能性比气相色谱法更大。
（7）馏分容易收集更有利于制备2 色谱法分类高效液相色谱法按固定相不同可分为液-液色谱法和液-固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液-液色谱）和吸附色谱法（液-固色谱）等[2]。
结核分析杆菌y-干扰素体外释放定量试验对诊断结核病的应用价值 裴新发
结核分析杆菌y-干扰素体外释放定量试验对诊断结核病的应用价值裴新发摘要：目的观察分析结核分枝杆菌特异性抗原y-干扰素释放试验（IGRA）对诊断结核病的应用价值。
方法选择我院2017年2月至2018年2月收治的疑似活动性结核患者84例患者的细菌学、影像学、病理学结果作为观察组，进行回顾性整理并随访，同时选择健康人84例作为对照组，用来识别和判断疑似结核病患者的是否真正的患病。
并随访治疗效果，与IGRA检查方法对照，评价IGRA的临床应用价值，结果结核病例IGRA检测敏感性为85.27%，特异性为81.03%，阳性预测值81.04%，阴性预测值86.12%。
结论 IGRA作为活动性结核病的辅助检查手段，具有较高的特异性，同时对肺结核外其他结核的临床诊断价值也较高，可为菌阴患者、肺外结核等特殊情况结核病患者进行抗结核治疗提供依据。
关键词：结核病；y-干扰素释放试验；临床应用价值结核病作为一种传染病，严重危害着人类的健康，近年来，随着人口大规模的流动，结核病与艾滋病同时流行及多重耐药结核菌菌株的出现，该病患病率呈上升趋势。
据世界卫生组织（WHO）估计，全球约1/3人口携带结核分枝杆菌，每年死于结核病的人数约200万。
中国结核病人数居世界第二位[1]，目前结核病诊断主要依据临床症状、胸部X线片及细菌培养和涂片抗酸染色等，这些传统诊断方法费时费力且检出率低，延误了早期诊治的最佳时机，而如何快速、准确诊断结核病也逐渐成为临床关注的重要问题。
近年来，以T细胞免疫为基础的体外酌鄄干扰素释放试验（IGRA）被证实在结核分枝杆菌感染检测中有较好的特异性和敏感性。
笔者通过对该院收治的疑似结核病患者采用IGRA诊断，以探讨其临床应用价值，现做如下报告：1资料与方法1.1一般资料选择我院2017年2月至2018年2月收治的疑似活动性结核患者84例患者的细菌学、影像学、病理学结果作为观察组，进行回顾性整理并随访，同时选择健康人84例作为对照组，用来识别和判断疑似结核病患者的是否真正的患病。
发热患者中γ干扰素释放实验QuantiFERON-TB Gold In-Tube不确定结果及影响因素
文献标识码 A
DOI 10． 11768 / nkjwzzzz20190409
Factors associated with indeterminate results of QuantiFEＲON-TB Gold In-Tube Test in adult patients with fever ZHU Lin，CHEN Tao，NING Qin* ． Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030 ，China
素。方法： 选择感染科因发热收治入院的病例，统计患者一般状况、实验室检查包括 γ 干扰素释放实验 QFT-GIT，血
常规、血清白蛋白、补体、降钙素原（ PCT） 、超敏 C 反应蛋白（ hs-CＲP） 、乳酸脱氢酶（ LDH） 、血清铁蛋白（ SF） 等炎症指
标，并进行统计学分析。结果： 215 例患者中，QFT 试验阳性 83 例，阴性 66 例，不确定结果 66 例。QFT-QIT 不确定组
Abstract Objective： To evaluate the associated factors of indeterminate results of QuantiFEＲON-TB Gold In-Tube Test （ QFT-GIT） in adult patients admitted with fever． Methods： We retrospectively enrolled patients admitted with fever in department of infectious diseases to collect general conditions，laboratory examinations including QFT-GIT，blood routine test， albumin level，serum complement，inflammatory indicators such as PCT，hs-CＲP，LDH，SF，and final diagnosis． Ｒesults： 215 hospitalized patients with fever were retrospectively enrolled into this study，among which there were 83 positive cases， 66 negative cases and 66 indeterminate cases． The age，the levels of SF and LDH in patients with indeterminate results were significantly higher than those in patients with determinate results （ P ＜ 0． 01 or P ＜ 0． 05） ． Meanwhile，lymphocyte counts， serum albumin level，serum complements C3 and C4 levels in patients with indeterminate results were significantly lower than those in patients with determinate results （ P ＜ 0． 01 or P ＜ 0． 05） ． Multivariate logistic regression analysis revealed that hypoproteinemia （ OＲ： 1． 156； 95% CI： 1． 028-1． 299） ，lymphocytopenia （ OＲ： 6． 009； 95% CI： 2． 147-16． 817） ，and increased white blood cell counts （ OＲ： 0． 800； 95% CI： 0． 680-0． 941） were significant predictors of QFT indeterminate results． Conclusion： Indeterminate results of QFT-GIT were not infrequent in patients with fever，especially in patients with hypoproteinemia，lymphocytopenia and strong inflammatory response．
高效液相色谱法概述
高效液相色谱法概述摘要：本文概述了高效液相色谱的产生、发展，分类、应用、存在问题及发展前景。
关键词：高翔液相色谱、分类、应用高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC) 是利用高压输液泵驱使流动相通过装填固定相的色谱柱，按照固液相之间的分配机制对混合物进行分离的方法。
一、高效液相色谱的产生及发展在过去三十多年里, HPLC 已经成为一项在化学科学中最有优势的仪器分析方法之一, 1994年, HPLC 的市场销售量是14亿美元, 就是一个较好的证据。
现在, HPLC 几乎能够分析所有的有机、高分子及生物试样。
、1941年, 马丁( Matin) 和辛格( Synge) 用一根装满硅胶微粒的色谱柱, 成功地完成了乙酰化氨基酸混合物的分离, 建立了液液分配色谱方法, 他们也因此获得了1952年诺贝尔化学奖。
从此开启了色谱技术的发展，紧接其后的塔板理论、速率理论的建立，使得色谱技术和理论得到了迅速的发展。
HPLC 的第一个雏形是由斯坦因( Stein) 和莫尔( Moo re) 于1958年发展起来的氨基酸分析仪( AAA) , 这种仪器能够进行自动分离和蛋白质水解产物的分析, 由于这种研究的重要性, 别的研究者也被吸引来进行这一方面的重要课题的研究, 最终直接促成了HPLC 方法的建立。
在此期间, 哈密顿( Hamiton) 在柱效率和选择性方面的成就而使得他的工作特别有价值。
在六十年代早期的相关进展是莫尔( Moo re) 发展起来的凝胶渗透色谱( GPC) 。
不久以后, 华特斯(Waters) 有限公司制造了商业GPC 仪, 这种仪器经过微小的改进之后可用于HPLC 分离。
在1968～1971年间, 推出了第一台普遍适用的HPLC 商用系统。
1971年以后, 对映体( 手性异构体) 和大生物分子如蛋白质的HPLC 分离逐步建立起来。
到了八十年代中期, HPLC 分析技术很明显成了一种成熟的技术, 激动人心的新发展日益减少, 许多领先研究者纷纷转向相关领域的研究, 如超临界流体色谱法( SFC) 毛细管电泳( LZE) 、制备色谱法( PC) 等等。
猪干扰素-γcDNA的克隆和原核表达
参 考 文献
结 果 成分提 取率 基本 相 当 ， 省 时 省工 ， 省 能耗 等 角 度 考 虑 ， 从 节 确定 设计提 取 时间 为 １￣２ｍ ｎ ０ ０ ｉ 进行 试验 研究 。 ３３温 度 对 黄 连 提 取 结 果 具有 显 著 性 作 用 随 着 温 度 增 加 ， ．
扰 素 一 ７Ｄ ｅ ＮＡ 基 因 。将 获 得 的 猪 干 扰 素 一 ７Ｄ ｅ ＮＡ 基 因 克 隆 入 原 核 表 达 载 体 ｐ Ｖ２ ０中 ， 装 成 原 核 表 达 载 体 ｐ Ｖ２ ０ Ｂ ２ 组 Ｂ ２ 一 ｅ ｏＦ 。将 这 个 表 达 载 体 转 化 入 大 肠 杆 菌表 达 菌株 Ｄ ａ Ｂ ２ Ｐ ＩＮ７ Ｈ５ 和 Ｌ １中 ， 度诱 导 培 养后 ， 行 Ｓ Ｓ Ｐ ＧＥ 实验检 测 。 结 果 温 进 Ｄ— Ａ 特 异 表 达 带 约 在 １ Ｋ 的位 置 ， 证 实在 茵 株 Ｄ ａ和 Ｂ ２ ７Ｄ 并 Ｈ５ Ｌ １中的 表 达 量 没 有 明 显 的 差 异 ， 表 达 量 都 约 占细 茼 总 蛋 白 的 其
Ｐ ａ ｍａｅ ｔ ａ ｈ ｒ ｃｕ ｉ ｌ ｃ ＣＯ． ｄ ， ｈｊ ｚ ｕ ｎ ５ ０ ６） Ｌｔ． Ｓ ｉａ ｈ ａ ｇ０ ０ ４ ｉ
ＡＢ ＴＲ Ｓ ＡＣＴ： Ｊ ＣＴ Ｖ ０Ｂ Ｅ Ｉ Ｅ Ｃｌ ｎ ｎ ｉ ｓ ｉ ｔ ｒｅ ｏ ｏ ｉｇ ｐ ｇ ｎ ｅ ｆ ｒ ｎ一 ７ ｃ ＤＮＡ ， ｎ ｒ ｋ ｒ ｏ ｉ ｘ ｒ ｓ ｉ ｎ ａ ｄ ｒ ａｉｅ ｔ ｅ ｐ ｇ ｉ ｔｒ ｅ ｏ — ａ ｄ ｐ ｏ ａ ｙ ｔｃ ｅ ｐ ｅ ｓｏ ， ｎ ｅ ｌ ｈ ｉ ｎ ｅ ｆ ｒ ｎ ｚ
γ-干扰素释放试验在结核病诊断中的临床价值
γ-干扰素释放试验在结核病诊断中的临床价值周政;李建英;韩飞;王文昕;易兴鑫【摘要】目的：比较分析γ-干扰素释放试验（IGRAs）、结核菌素皮肤试验（TST）、抗酸染色和培养在结核病患者中的诊断性能，评价IGRAs用于结核感染诊断的临床价值。
方法用四种方法分别对60例肺结核患者、54例非结核肺疾病患者和35例健康体检者进行检测，以两两比较其诊断性能的差异。
结果IGRAs 对肺结核病的诊断特异性为89．9％，灵敏度为88．3％（53/60），灵敏度显著高于TST（66．7％）、抗酸染色（31．7％）和分枝杆菌培养（46．7％），而且对活动性肺结核的诊断灵敏度更是高达93．8％。
结论IGRAs具有灵敏度高、特异性高、检测快速等特点，是一种逐渐替代传统TST方法的结核诊断的新的辅助试验。
%Objective To evaluate the clinical value of interferon gamma release arrays (IGRAs) for diagnosis of tuberculosis infection by comparatively analyzing the diagnostic performances of IGRAs ,tuberculin skin test (TST ) ,acid fast stain and culture .Methods Respectively test 60 pulmonary tuberculosis patients ,54 non-tuberculo-sis pulmonary disease patients and 35 healthy subjects by four methods ,and analyze the differences of diagnostic per-formances using a chi-square test .Results The diagnostic specificity of IGRAs was 89 .9% ,while sensitivity was88 .3% ,which was significantly higher than those of other three methods .It was up to 93 .8% for active pulmonary tuberculosis patientsConclusion IGRAs is a new method for replacing TST in diagnosis of tuberculosis ,as its high sensitivity ,high specificity and short turn around time .【期刊名称】《检验医学与临床》【年(卷),期】2014(000)016【总页数】3页(P2213-2215)【关键词】γ-干扰素释放试验;结核菌素皮肤试验;结核分枝杆菌;结核感染;肺结核【作者】周政;李建英;韩飞;王文昕;易兴鑫【作者单位】重庆三峡中心医院，重庆万州 404000;重庆三峡中心医院，重庆万州 404000;重庆三峡中心医院，重庆万州 404000;重庆三峡中心医院，重庆万州404000;重庆三峡中心医院，重庆万州 404000【正文语种】中文越来越多的学者开始关注结核病的诊断和治疗，而结核分枝杆菌的实验室检测和药敏测定一直是研究的热点和难点。
γ干扰素释放试验指南
γ干扰素释放试验在中国应用的建议γ- 干扰素释放试验（interferon-γ release assays，IGRAs）是检测结核分枝杆菌(MTB) 特异性抗原刺激T 细胞产生的γ- 干扰素，以判断是否存在MTB 的感染。
IGRAs 可弥补PPD 试验的不足，目前多个国家已将其用于诊断MTB 潜伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)，我国部分医院也已常规开展此项检测，且多家IGRAs 试剂已经或即将进入临床应用。
LTBI 是宿主感染MTB 后的一种特殊状态，感染者体内的MTB 处于持留状态，不能诊断为活动性结核病，但具有发展为活动性结核病的风险。
对LTBI 的高危人群进行早期诊断和适当干预，在结核病控制中具有积极意义。
PPD 试验作为诊断MTB 感染的传统方法，具有操作简便、成本低廉的特点，至今仍广泛使用，但该方法使用的PPD 抗原成分复杂，易受卡介苗接种和非结核分枝杆菌(nontuberculosismycobacterium，NTM) 的影响，特异度较低，且对人免疫缺陷病毒(HIV) 感染及重症疾病患者等免疫功能受损人群的敏感度不足。
研究结果提示，IGRAs 诊断MTB 感染的特异度高于PPD 试验，但也有文献报道，特别是在中、低收入国家，IGRAs 与PPD 试验相比并没有足够的优势。
IGRAs 技术要求高，操作程序复杂，样本检测时限短，难以实现高通量，价格昂贵。
由于缺乏严谨、大规模和前瞻性的人群研究数据，故IGRAs 的应用范围及结果解读存在较大争议。
为了指导IGRAs 在我国的合理应用，中华医学会结核病学分会与《中华结核和呼吸杂志》编辑委员会组织有关专家经过长时间的反复研讨，在借鉴世界卫生组织(WHO) 关于中低收入国家IGRAs 应用说明的基础上，结合我国IGRAs 应用现状，提出以下建议。
一、IGRAs 简介1．IGRAs 的原理和主要方法：受到MTB 抗原刺激致敏的T 细胞再次遇到同类抗原时可产生γ- 干扰素，IGRAs 通过检测全血或分离自全血的单核细胞在MTB 特异性抗原刺激下产生的γ- 干扰素，判断受试者是否感染MTB。
干扰素-γ的生物学特性与相关应用
干扰素 -γ的生物学特性与相关应用摘要作为一种具有免疫调节作用的干扰素，干扰素-γ最初被发现具有抗病毒效果，但在随后几年的研究中，研究者陆续发现干扰素-γ的功能不仅仅局限于抗病毒，干扰素-γ在肿瘤免疫调节、抑制细菌等方面具有卓越功效，干扰素-γ可通过干扰素-γ信号通路及其下游靶基因抑制癌细胞，不同种类的干扰素可以激活不同的信号级联，并且它们可以相互作用以增强或降低反应，通过这种机制，干扰素-γ可以促进数百个不同的基因的转录，从而抑制SARS-CoV的复制。
关键词:干扰素-γ，免疫调节反应，癌症，新型冠状病毒肺炎介绍干扰素-γ是唯一的Ⅱ型干扰素，并且已被证明在各类免疫调节反应中发挥至关重要的作用，其作用包括抗肿瘤、抗菌、抗病毒等，是一种多效性的细胞因子[1, 2]。
干扰素-γ的主要是由主要由自然杀伤(NK)细胞产生，在特异性抗原的情况下，细胞毒性T细胞也能产生干扰素-γ[3]。
干扰素-γ在抑制肿瘤、炎症方面均有不同的作用。
在这篇综述中，我们研究了近几年关于干扰素γ在抑制肿瘤与抑制新型冠状病毒肺炎的功能的报道，有助于我们全面了解干扰素γ在抗肿瘤免疫反应与其他反应中的作用，这有助于更好地研究相对应的治疗药物与免疫治疗方法。
干扰素-γ的常规抗肿瘤效果干扰素-γ的受体分为干扰素-γR1与干扰素-γR2两个亚基部分，干扰素-γR1主要负责配体结合，在干扰素γ的信号转导过程中十分重要，干扰素-γR2长度与干扰素-γR1相比较短，功能方面更加倾向于传导信号，在配体结合中作用较小，干扰素-γR1与干扰素-γR2作为受体广泛分布于各种细胞类型。
当与干扰素γ受体连接时，干扰素-γ信号通路的下游靶基因将会发挥广泛的生物学功能，比如调节炎症、病毒感染、细菌侵袭相关免疫反应、以及细胞周期与细胞凋亡的调节，干扰素-γ下游的靶基因包括JANUS激酶，包括JAK1和JAK2、STAT1以及干扰素调节因子(IRF1)、凋亡蛋白（Caspase）等，干扰素-γ可以通过Jak- Stat1 - Caspase信号诱导肿瘤细胞凋亡，JANUS激酶激活后，进一步激活STAT1，STAT1促进凋亡蛋白caspase 3和caspase 7转录合成，进而启动癌细胞凋亡过程。
反相高效液相色谱法测定重组人干扰素α1b多剂量注射液中间甲酚含量
ＳＵＮＪｉｈｕｉ，ＬＩＮＦｕｙｕ，ＬＩＵＪｉｎｙｉ，ＣＨＥＮＧＹｏｎｇｑｉｎｇ
（ＢｅｉｊｉｎｇＴｒｉＰｒｉｍｅＧｅｎｅＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣｏ，Ｌｔｄ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０２６００，Ｃｈｉｎａ）
重组人干扰素 α１ｂ是我国第一个具有自主知 识产权的基因工程药物，具有广谱抗病毒、抗肿瘤及 免疫 调 节 功 能，临 床 应 用 疗 效 好、不 良 反 应 小［１］。 与传统单剂量重组人干扰素 α１ｂ注射液不同，重组 人干扰素 α１ｂ多剂量注射液可以多次使用，因此制 剂中增加了间甲酚作为抑菌剂。
ｃｒｅｓｏｌｃｏｎｔｅｎｔｉｎｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎα１ｂｍｕｌｔｉｄｏｓｅｉｎｊｅｃｔｉｏｎ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｍｃｒｅｓｏｌ；ｈｕｍａｎｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ；ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎα１ｂｉｎｊｅｃｔｉｏｎ；ｍｅｔｈｏｄｖａｌｉｄａｔｉｏｎ；ｑｕａｌ ｉｔｙｃｏｎｔｒｏｌ；ｃｏｎｔｅｎｔｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ；ＲＰＨＰＬＣ
·４ ０８· 中 国 药 品 标 准 ＤｒｕｇＳｔａｎｄａｒｄｓｏｆＣｈｉｎａ２０１９，２０（５）
反相高效液相色谱法测定重组人干扰素 α１ｂ 多剂量注射液中间甲酚含量
孙纪慧，林福玉，刘金毅，程永庆
（北京三元基因药业股份有限公司，北京 １０２６００）
摘要 目的：建立测定重组人干扰素 α１ｂ多剂量注射液中间甲酚含量的高效液相色谱方法。方法：采用反 相高 效 液 相 色 谱 （ＲＰＨＰＬＣ）法，选 用 ＶｅｎｕｓｉｌＡＳＢＣ１８（４６ｍｍ ×１５０ｍｍ，５μｍ）色 谱 柱，流 动 相 为 ０２ｍｏｌ·Ｌ－１硫酸盐缓冲液（ｐＨ＝２３）乙腈（７４∶２６），流速 １ｍＬ·ｍｉｎ－１，进样量 ２０μＬ，检测波长 ２７０ｎｍ， 柱温 ４０℃，等度洗脱。对方法进行专属性、线性、准确度、精密度、重复性、检测下限、定量下限等一系列验 证。结果：该方法在间甲酚含量为 ３１～６０１４μｇ·ｍＬ－１范围内线性良好，ｒ２值为 １０００。相关辅料及干扰 素 α１ｂ对间甲酚检测无干扰。该方法检测高、中、低 ３种浓度总平均回收率 （ｎ＝９）为 ９９８％，ＲＳＤ 为 ０４３％；精密度 ＲＳＤ（ｎ＝９）为 ０７８％；检测下限为 ００６３μｇ·ｍＬ－１。６批重组人干扰素 α１ｂ多剂量注射液 中间甲酚经本方法检测，含量均在其标示量的 ９０％ ～１１０％之间，质量合格。结论：建立的 ＲＰＨＰＬＣ方法专 属性良好，精密度、准确性高，可用于检测重组人干扰素 α１ｂ多剂量注射液中的间甲酚含量。 关键词：间甲酚；人血白蛋白；重组人干扰素 α１ｂ注射液；方法验证；质量控制；含量测定；反相高效液相色谱 中图分类号：Ｒ９２１２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００９－３６５６（２０１９）－５－０４０８－５ ｄｏｉ：１０１９７７８／ｊｃｈｐ２０１９０５００６
γ干扰素释放试验指南
γ干扰素释放试验在中国应用的建议γ—干扰素释放试验（interferon—γ release assays，IGRAs)是检测结核分枝杆菌(MTB）特异性抗原刺激T 细胞产生的γ—干扰素，以判断是否存在MTB 的感染。
IGRAs 可弥补PPD 试验的不足，目前多个国家已将其用于诊断MTB 潜伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI），我国部分医院也已常规开展此项检测，且多家IGRAs 试剂已经或即将进入临床应用。
LTBI 是宿主感染MTB 后的一种特殊状态，感染者体内的MTB 处于持留状态，不能诊断为活动性结核病,但具有发展为活动性结核病的风险.对LTBI 的高危人群进行早期诊断和适当干预，在结核病控制中具有积极意义.PPD 试验作为诊断MTB 感染的传统方法，具有操作简便、成本低廉的特点，至今仍广泛使用，但该方法使用的PPD 抗原成分复杂，易受卡介苗接种和非结核分枝杆菌(nontuberculosismycobacterium，NTM）的影响，特异度较低，且对人免疫缺陷病毒（HIV）感染及重症疾病患者等免疫功能受损人群的敏感度不足。
研究结果提示，IGRAs 诊断MTB 感染的特异度高于PPD 试验，但也有文献报道,特别是在中、低收入国家，IGRAs 与PPD 试验相比并没有足够的优势。
IGRAs 技术要求高，操作程序复杂，样本检测时限短,难以实现高通量，价格昂贵。
由于缺乏严谨、大规模和前瞻性的人群研究数据,故IGRAs 的应用范围及结果解读存在较大争议。
为了指导IGRAs 在我国的合理应用,中华医学会结核病学分会与《中华结核和呼吸杂志》编辑委员会组织有关专家经过长时间的反复研讨,在借鉴世界卫生组织（WHO）关于中低收入国家IGRAs 应用说明的基础上,结合我国IGRAs 应用现状，提出以下建议。
一、IGRAs 简介但在实际使用中发现，IGRAs 在不同地区、不同人群中的特异度和敏感度均存在较大差异，在某些人群中并未显示其敏感度和特异度优于PPD 试验。
干扰素
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• 干扰素基因克隆 • 表达载体大肠杆 菌构建 • 工程菌筛选
工程菌构建
包涵体 复性 重组
尿素溶液使包涵体 充分变性溶解，谷 胱甘肽复性使蛋白 折叠成天然构象复 性
蛋白聚集成 不溶性的包 涵体
人干
扰素
2019/3/17
干扰素
7
2.2基因工程毕氏酵母发酵生产工艺
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表达产物：直接分泌到发酵液，临床副反应少，内毒素含 量低，活性纯度高。
3.4．菌体收集 连续流离心机：冷却的发酵液，16000 r/min离心收集。 菌体保存：－20℃冰柜，不超过12个月。 检测：干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、质粒 结构一致性、质粒稳定性。
2019/3/17 干扰素 12
干扰素分离纯化过程
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4.1 4.2
干扰素分离工艺过程 干扰素的纯化工艺过程
2019/3/17
干扰素
23
LOGO
参考文献： [1]郑永霞、凌善峰.我国基因工程干扰素的研究概况[J],聊 城大学学报自然科学版,2003 -3. [2]郭立安. 疏水作用色谱法同时纯化及复性基因重组人干 扰素-a[J]. 色谱，2001, 19(4): 301-303. [3]郭立安、刘树林、朱宝泉.使用高效疏水作用色谱和凝胶 色谱纯化重组人干扰素一r [J].高等学校化学学报， 1997， 18 (6): 920-922. [4]刘运龙、程远国、刘学龙.干扰素研究进展，动物医学进 展[J],2008 ,29 (2) :85289 [5]毛忠贵.《生物工业下游技术》中国轻工业出版社
2019/3/17 干扰素 16
4.2.2色谱分离方法的选择
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Χ 干扰素在反相高效液相色谱柱上色谱行为与分离的研究Ξ
康 建 刘亚革 孟璐露 孙亦红
沈阳军区总医院 沈阳
提 要 用高效液相色谱法对基因工程下游包涵体所含目标蛋白进行分离纯化 较系统地研究了Χ 干扰素在反相柱上的色谱行为及其影响因素∀结果表明 复性后Χ 干扰素伴有错配聚合体产生 其保留行为及洗脱谱图随构象不同而改变∀分离系统的疏水性和粘度是影响Χ 干扰素在固定相与流动相间传质扩散的重要因素∀关键词 反相高效液相色谱法 干扰素 包涵体
分类号 Ù
前言
真核细胞蛋白在原核细胞中表达 其产物常以包涵体形式存在∀由于包涵体所含目标蛋白的种类与其理化性质差异很大 因此对包涵体蛋白的分离纯化类似于膜蛋白 多以经验法进行摸索 ∀本文以包涵体混合蛋白中的Χ 干扰素 Χ 为纯化目标蛋白 对变性或复性状态下的Χ 在反相柱上的色谱行为及分离条件进行了研究 以期用一维色谱数据辅以免疫化学等指标分析Χ 构象信息 探索适宜的色谱条件∀
材料与方法
试剂与仪器 乙腈 色谱纯 中科院上海脑研究所 三氟乙酸 分析纯 公司 去离子水 蒸馏水经 纯水器处理 ∀液相色谱仪 日本岛津公司 配 双泵 紫外检测器 自动进样器 柱温控制器 中心控制系统及 色谱数据处理仪∀
分离条件 流动相 水 含 流动相 乙腈 含 经真空和超声联合脱气∀梯度 泵在 时为 ∗ 时为 时为 ∗ 时为 时为 总时间 ∀反相柱 Λ ≅ 为 柱温 ε∀
包涵体蛋白的回收及提取 将发酵高表达Χ 的大肠杆菌离心收菌 洗涤后用超声法破菌 再经高速离心回收包涵体沉淀 用 Ù 盐酸胍裂解后离心取上清液∀经 色谱分析后的Χ 粗品分别以变性或复性后样品过 Λ 滤膜 Λ 上样∀
实验结果
Χ-ΙΦΝ的紫外吸收光谱与定性 粗提样品在上述洗脱条件下于波长 ∗ 范围内有较强的紫外吸收∀不同波长下梯度洗脱实验中Χ 的色谱图如图 所示∀鉴于多肽在波长 处灵敏度较高 随后实验均选用该波长∀用盐酸胍和谷胱甘肽作空白对照 二者在 处无紫外吸收 在 处有吸收 盐酸胍在 内即被洗脱 而谷胱甘肽保留值 τ 为 和 变性样品和复性样品中待定性组分分别为 和 的洗脱峰∀以标准样品对照确定未知峰位并于柱后收集 在微氮气下吹干溶剂 分别用电泳法 和紫外吸收光谱鉴定Χ 纯度∀ 显示收集峰为 均一组分 通过双波长吸收比及Χ 活性测定 亦印证该洗脱峰为Χ 纯组分 结果见表 ∀
表 不同检测方法对待测组分定性比较Ταβλε ΙδεντιφιχατιονοφΧ-ΙΦΝβψτηρεε ετηοδσ
检测方法
Χ
牛血清白蛋白
谷胱甘肽
吸收比
Ù
Χ 活性测定
Χ
Ù
ΤΦΑ和无机盐的色谱改性作用 在梯度洗脱中流动相最初不含 对Χ 较难洗脱∀加入
第 卷第 期色 谱 年 月 Ξ本文收稿日期 修回日期
适量 能与蛋白质形成溶于此体系的离子对 使Χ 在该体系中溶解并获得良好的分离∀流动相加入 Ù 对Χ 分离度影响不明显 但可改善某些其它组分的分离情形
∀
图 不同波长下Χ-ΙΦΝ洗脱谱图
Φιγ Χ-ΙΦΝ ροφιλεσφρο Χ χολυ ν
ατδιφφερεντωαϖελενγτη
波长 处的变性样品 波长 处的复性样
品 实线代表复性样品 虚线代表谷胱甘肽对照 波长
处的上述两种样品 实线代表复性样品 虚线代表变
性样品∀ 谷胱甘肽 聚合体∀
Χ Χ Χ Χ Χ Χ
复性对Χ-ΙΦΝ色谱行为的影响 将凝胶色谱
分析后的Χ 经透析除去盐酸胍后再实施复性 其色谱行为发生了明显的变化∀除τ 由变性状态时的 缩短为 外 还表现为Χ 聚合体的形成 τ 为 和二硫键的错配 即由变性状态时的单峰随复性后转变成肩峰重叠 同一批号样品重叠峰比例相同 但批与批之间差异较大 见表 ∀Χ 系疏水性较强的蛋白质 洗脱组分经
除盐后 Χ
以不溶形式存在 其保留值与变性Χ 相似 但稀释后实施生物活性分析时 前者显示出更高的比活性∀此外 除盐样品在色谱图中无缓冲液组分 见图 ∀经复性缓冲液稀释溶解后 生物活性和色谱行为方能恢复到天然状态∀收集不同样品的相关组分 经单抗酶联免疫夹心分析 验证含Χ 组分 用 检测聚合体和错配体 分子量无明显改变 电泳区带均一∀但生物的比活性差异较大 见表 ∀
表 Χ-ΙΦΝ及错配聚合体批间分析比较
Ταβλε Χο αρισονοφχο οσιτιονοφΧ-ΙΦΝ
χο λεξβετωεενβατχηεσ
批次
ν
百分峰面积
Χ 错配体和聚合体
表 不同Χ-ΙΦΝ组分与活性比较
Ταβλε Βιολογιχαλαχτιϖιτψανδχηαραχτεριζατιονοφ
Χ-ΙΦΝωιτηδιφφερεντχο φορ ατιον
组 分
ν
τ
比活性 Ù
复性Χ
Χ
≅ 凝胶除盐Χ Χ
≅ 聚合体
Χ ≅ 错配体 Χ ≅
变性Χ Χ
谷胱甘肽
温度与 Η值对Χ-ΙΦΝ色谱行为的影响 用
反相色谱分离Χ 的首要前提是在该系统中有适当的保留值范围 Κχ ∀Χ 在温度
ε时τ 为 但温度升至 ε时τ 为 ε时τ 为 ∀Χ 于反相柱上
期 康 建等 Χ 干扰素在反相液相色谱柱上的色谱行为与分离的研究
的保留时间随温度的升高而减小∀将流动相 值由 调至 时 可明显改变某些溶质的保留∀尽管Χ 保留值变化不大 但与相邻峰的界限不清 峰形变差 见图
∀
图 凝胶色谱复性法Χ-ΙΦΝ组成比较
Φιγ Ελυτιον ροφιλεσοφΧ-ΙΦΝωιτηρενατυρατιονβψγελ
χηρο ατογρα ηψοφΣε ηαδεξΓ-
柱收集样品 稀释样品
复性缓冲液∀峰 为谷胱甘肽∀实验条件见正文∀
Χ Χ
讨论
紫外吸收光谱信息不但可解决样品中不同组分的定性问题 而且由它还可知道各溶质在不同条件下各自的保留值∀实际应用时 对洗脱的各溶质并非都需定性 只要确定目标蛋白在色谱图中的峰序和
保留值即可∀谷胱甘肽在波长
处无紫外吸
图 流动相 Η对样品分辨率的影响
Φιγ Εφφεχτοφ Ηοφ οβιλε ηασεον
Χ-ΙΦΝ εακσψ ετρψ
收 可能与该多肽不含芳香族氨基酸有关 在波长
处测得的为肽键吸收值 ∀波长的选择应基
于剔除干扰和满足检测极限∀
蛋白质在反相柱上的保留行为主要依赖于组成氨基酸的疏水性质∀ 能明显地改善多肽的分离 这可能是由于形成的离子对抑制了硅羟氧基对蛋白质的二次吸附 ∀实验中观察到 Χ 在反相
高效液相色谱中的保留值随无机盐浓度和温度的不同而变化∀在流动相中加入低浓度无机盐时可改变流动相的表面张力 使容量因子增大 通常也使溶质保留值增加 但Χ 保留值减小的原因尚不清楚 可能与离子强度的增加导致Χ 离子性质发生了变化有关∀温度的变化主要会造成蛋白质构象和粘度等因素的改变∀ 值对溶质色谱行为的影响提示氢离子浓度升高增强了柱填料中残留硅醇基的酸性活性点功能 使二次吸附作用增强∀上述因素对
Χ 在固定相和流动相间传质过程的影响的最终
效应取决于疏水性与粘度二者总和∀
已知复性是蛋白质工程中最关键最复杂的问题∀Χ 不同构象对色谱行为的影响是由于盐酸胍存在时的肽链展开 疏水基团充分暴露 与固定相间的传质过程增加和保留值增加等∀经除去盐酸胍复性即Χ 正确折叠后 展开的多肽重新卷曲恢
色 谱 卷
复到天然状态 某些先前暴露的疏水基团被掩蔽 保留值随之减小∀由于多肽复性卷曲过程中巯基乙酰化 分子间或分子内二硫键配对错误均可导致Χ
的构型或构象改变
以致在色谱中产生聚合
体和重叠峰∀经电泳证实聚合体和重叠组分的分子量相同 区带均一 故 解离系统和
均不能独自鉴定分子间错配和聚合体 需由
色谱数据辅佐∀改变复性方法仍不能完全复性 部分复性产物被中止于亚稳态构象 且错配比例随不同批次而变化 这进一步说明错配几率的高低与复性有关∀严格控制复性条件是维持Χ 生物活性的重要环节 同时对包涵体中重组蛋白质的复性和错配机理实施进一步研究仍是该领域的前沿课题
∀
探讨Χ 干扰素在反相柱上的色谱行为 不只是为目标蛋白摸索适宜的分离纯化条件 更重要的是从目标蛋白的一维数据中了解与结构和功能相关的信息∀这在鉴别错配聚合体 改善复性工艺乃至研究多肽结构与功能等方面具有重要意义∀
致谢 本文部分工作承蒙中国科学院大连化学物理研究所商振华研究员热情指导 特此致谢∀
参
考文献
徐明波 姚志建 生物化学与生物物理进展
黄祯祥主编 医学病毒学基础及实验技术 北京 科学
出版社
陶慰孙 李 惟 姜涌明等编著 蛋白质分子基础 北
京 人民教育出版社
郭立安 高效液相色谱法纯化蛋白质理论与技术 西
安 陕西科学技术出版社
汪小江 王连生 田笠卿 色谱
εταλ
孙志贤主编 现代生物化学理论与研究技术 北京 军
事医学科学出版社
ΠυριφιχατιονανδΒεηαϖιοροφΡεχο βιναντΗυ ανΓα α-ΙντερφερονονΡεϖερσεδ-ΠηασεΗιγηΠερφορ ανχεΛιθυιδΧηρο ατογρα ηψ
ΓενεραλΗοσ ιταλοφΣηενψανγΧο ανδοφΠΛΑ Σηενψανγ
Αβστραχτ Χ Χ Χ Χ Χ Χ Χ Χ Χ
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Ù Χ τ τ Χ Χ
Κεψωορδσ
期 康 建等 Χ 干扰素在反相液相色谱柱上的色谱行为与分离的研究。