广西猪瘟流行毒株全基因组的克隆与序列分析

广西猪瘟流行毒株全基因组的克隆与序列分析吴显实,罗廷荣3,廖素环,刘　芳,陆芹章,黄伟坚,温荣辉,秦爱珍,余克伦　(广西大学动物科学技术学院,　广西南宁530005)摘要:参考已发表的猪瘟病毒(CSFV )Sh i m en 株、HCLV 株、Paderbo rn 株的核苷酸序列,设计并合成11对引物,应用R T 2PCR 技术,成功地分11个片段扩增了CSFV 广西流行毒株GX W Z 02的全基因组。

将这11个基因片段克隆,并测定了其核苷酸序列。

应用计算机生物软件V ecto r N T I 将11个基因片段进行拼接,确认CSFV GX W Z 02株全基因组序列的长度为12296个核苷酸(GenBank 收录号A Y 367767)。

将GX W Z 02株与国内外已发表的Sh i m en 、HCLV 、39、B rescia 、Eystrup 、Glento rf 、A lfo rt 187、Paderbo rn 、CS 、ALD 、GPE -、P 97、L PC 毒株进行全基因组核苷酸序列和推定的氨基酸序列比较,核苷酸同源性分别为8514%、8416%、8817%、8517%、8517%、8513%、8516%、9513%、8517%、8517%8514%、8314%、8413%,推定的氨基酸同源性分别为9216%、9117%、9412%、9311%、9219%、9213%、9310%、9717%、9216%、9310%、9216%、9015%、9016%。

GX W Z 02与Sh i m en 、HCLV 的全基因组序列及推定的氨基酸序列有明显差异,表明GX W Z 02株在遗传性和抗原性上发生了较明显的变化。

系统发育树分析,所比较的14株CSFV 被分为2个群:GX W Z 02、Paderbo rn 和39这3个毒株被归为群 ,其余的11个毒株被归为群 ,GX W Z 02与Paderbo rn 的亲缘关系最接近。

将GX W Z 02与Sh i m en 、HCLV 基因组中单个基因分别进行核苷酸及推定的氨基酸序列同源性比较,结果显示,基因E m s 、E 2、P 7、N S 2、N S 5A 的遗传变异程度大,而N S 3、N S 4A 、N S 4B 的遗传性则相对保守。

关键词:猪瘟病毒;基因组;序列分析;GX W Z 02株中图分类号:S 8521651 文献标识码:A 文章编号:100524545(2005)022******* 收稿日期:2003211226 基金项目:广西科技厅科研基金项目(桂科青9912015) 作者简介:吴显实(19762),男,硕士。

3通讯作者,trluo @tom .com 猪瘟(C lassical s w ine fever ,CSF ;也称Hog cho lera ,HC )是猪的一种接触性和高度致死性疾病。

猪瘟病毒(CSFV )的基因组大小约1213kb ,仅包含有1个大的开放阅读框架(open read fram e ,OR F ),在其5′端有一非编码区(untranslated regi on ,U TR ),由360～373个核苷酸组成;在其3′端也有一非编码区,由229～244个核苷酸组成。

OR F 编码3898个氨基酸残基的多聚蛋白。

该多聚蛋白在翻译过程中或翻译后,在病毒编码的蛋白酶和宿主细胞酶的作用下,分解成为4个结构蛋白和8个非结构蛋白。

众多学者对CSF 流行毒株的E 2基因进行了分析,发现流行毒株与中国标准强毒株Sh i m en 和HCLV 的差异较大[1～5]。

CSF 在广西呈地方性流行,在分子水平上对广西流行的CSFV 的研究数据不多。

为了获得广西CSF 流行毒株的比较全面的数据和信息,我们在对广西各地流行毒株E 2基因进行综合分析的基础上,随机挑选了1株广西CSF 流行野毒株,对其进行了全基因组克隆和核苷酸序列测定,以探讨E 2基因的变异与全基因组变异程度的关系,从而为进一步研究CSFV 的各基因功能、病毒的复制、致病机制及病毒与宿主细胞相互作用提供资料。

1　材料与方法111　试剂　T rizo l 、T aq 酶和dN T P ,购自上海生物工程公司;M 2M uLV R everse T ranscri p tase 、pGE M 2T 载体,购自P rom ega 公司;pM D 182T 载体,为T aKaR a 公司产品;RN asin ,为华美生物工程公司产品。

112　病毒RNA 从广西各地分离的17个猪瘟病毒株中,随机选择其中1个毒株(编号为GX W Z 02)的脾脏病料,T rizo l 方法抽提组织总RNA ,用本实验室合成的诊断猪瘟的特异性引物A 1 A 2[6]对病料进行鉴定,证实其为猪瘟阳性材料,然后用R T 2PCR 分段扩增CSFV 的全基因组。

113　引物　参考已发表的CSFV Sh i m en 株、HCLV 株和Paderbo rn 株的核苷酸序列,应用生物软件O ligo 610辅助设计11对引物。

引物由上海生物工程公司合成。

W p 1,5′GTATA CGA GGT TA GT TCA T TCTC 3′(1～23);W p 2,5′T TCT TCCTA GA T TCT GGT GGT 3′(1110～1090);W p 3,5′A TA GCCCCAAAA GA GCA T GA 3′(944～963);W p 4,5′GCCCT A TCGCA T T GGT T GA T GA 3′(2498～2477);L 1,5′A CCAGA T T GGT GGCCGTA T GAAA C 3′(2229～2253);L 2,5′CA GCGGCGA GT T GT TCT GT TA GAA C 3′(3557～3533);Cp 5,5′CA C GA G T GC T T GA T T G GCA A C 3′(3200～3220);Cp 6,5′CA GCGGA CCA T TA CT TCA T T 3′(4743～4724);W p 7,5′CA CCA T GT T GCCA T T GA TC 3′(4450～4468);W p 8,5′T GA T GCT GTCA CA CA GGT GAA 3′(5584～5564);W p 9,5′CA T CA GT T CA G T G GA CCA T G T 3′(5584～5564);W p 10,5′CGTCA CTA T GAA GGGCA TCT T 3′(6604～6584);W p 11,5′T TA CA TCGCA GTCCCCT TA CGT GGT 3′(6459～6483);W p 12,5′CTAAA GCCGGT TCAA CTA TCT T GGA C 3′(7883～7858);W p 13,5′GCGA CT TA CA CA TA CAAAA GCT GGA 3′(7820～7844);W p 14,5′TG T GTA T GCCA GCCA GGT T GTA A C 3′(9136～9113);W p 15,5′CT TA T GA CT T GTCCCTCCA CAA CC 3′(9024～9047);W p 16,5′CCCT TA T T GCT T GA T GGAA GT T GG 3′(10424～10401);W p 17,5′CCT GA GGA CCAAA CA CA T GT T GAA CC 3′(10240～10265);W p 18,5′TCA GT GGGT TCCA GGA GTA CA TCA G 3′(11588～11564);W p 19,5′A CGGA A GGGGA CA A GA T GAA A GT G 3′(11351～11374);W p 20,5′G G GC C G T T A G GA A A T TA C C T T A G T C 3′(12298～12274)。

114　反转录　取16ΛL RNA 与1ΛL (25pmo l ΛL )的反向引物混匀,于PCR 仪中70℃5m in 、90℃5m in 后,立即放入冰浴中5m in,加入5×buffer5ΛL、dN T P2ΛL、R nasin015ΛL、M2M uLV reverse transcri p tase015ΛL,总量25ΛL,置42℃反转录1h。

115　PCR　PCR反应在50ΛL体系中进行。

各对引物扩增条件均为:95℃3m in;94℃1m in,59℃1m in,72℃1m in30s,共35个循环;72℃10m in。

116　PCR产物的克隆、测序与分析　各个扩增片段分别进行胶回收,与载体pGE M2T或pM D182T连接,转化DH5Α感受态细胞,经Amp、IPT G、X2gal筛选,酶切鉴定阳性重组质粒,由上海生物工程公司测序。

应用生物软件V ecto r N T I对11个片段的测序结果进行拼接,以确定CSFV基因组全长序列。

应用生物软件DNA star,将获得的CSFV全基因组同国内外已发表的毒株进行核苷酸和推定氨基酸的同源性比较,建立系统发育树,同时还分单个基因进行比较,分析各基因进化情况。

2　结果211　猪瘟病毒核酸各片段的合成　用所设计的11对引物对猪瘟病料GX W Z02进行R T2PCR,均扩增出与预期结果一致的片段。

扩增片段最长1555bp,最短948bp。

212　克隆及测序　将获得的11个目的基因片段分别克隆到载体pGE M2T或pM D182T,由上海生物工程公司测序。

应用生物软件V ecto r N T I对11个片段的测序结果进行拼接,扣除各片段间的重叠区序列,最后获得序列长度为12296nt,该序列即为CSFV GX W Z02毒株的全基因组序列(GenBank收录号A Y367767),推定其OR F编码的多聚蛋白为3898个氨基酸残基。

213　序列分析　将CSFV GX W Z02毒株的全基因组序列及推定的氨基酸序列与国内外已发表的猪瘟病毒Sh i m en、HCLV、39、B rescia、Eystrup、Glento rf、A lfo rt187、Paderbo rn、CS、ALD、GPE-、P97、L PC株进行同源性比较。

核苷酸序列同源性比较,GX W Z02与Paderbo rn的同源性最高,为9513%,其次是GX W Z02与39,同源性为8815%;GX W Z02与P97的同源性最低,为8314%;GX W Z02与L PC、HCLV、Sh i m en、B rescia、Eystrup、Glento rf、A lfo rt187、CS、ALD、GPE-的同源性差异较大,分别为8413%、8416%、8514%、8517%、8517%、8513%8516%、8517%、8517%、8514%。