分子生物学实验指导_LSW
最新分子生物学实验指导
分子生物学实验指导分子生物学实验指导（补充讲义）南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心二OO九年十二月目录实验总RNA的提取、定量与RT-PCR………………………………………………1实验质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定 (7)实验蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳 (13)附录Ⅰ相关试剂盒说明书 (19)附录Ⅱ相关仪器使用说明书 (19)实验九总RNA的提取、定量与RT-PCR一、总RNA的提取与定量目的：从细胞中分离RNA是分子生物学实验经常进行的操作之一，所提取RNA的质量是进行其它实验的基础，如Northern杂交，目的基因cDNA的克隆，荧光定量，文库构建等。
原理：在哺乳动物中，平均每个细胞内大约含有10-5μg RNA，其中rRNA占总量的80%-85%，tRNA和核内小分子RNA占10-15%，而mRNA只占1-5%。
rRNA由28S、18S、5S等几类组成，这些RNA分子根据密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行分离。
mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数mRNA分子（除血红蛋白、有些组蛋白mRNA以外），在3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)。
利用此特点，用oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。
RNA分离的方法有：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。
目前常用的是Trizol法。
Trizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。
TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。
异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。
酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8－羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。
在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相中。
分子生物学实验指导(精品文档)_共44页
分子生物学实验指导分子生物学实验课程的内容是从亚克隆一个基因直到最终表达出该基因产物的一个完整的科研项目。
以表达纳豆激酶为例，从已经克隆在pMD-18-T载体上的纳豆激酶酶原基因上用PCR扩增出837bp的纳豆激酶成熟肽基因片段，与T载体连接后转入DH5 菌中筛选鉴定，然后用双酶切下纳豆激酶成熟肽基因片段，插入带有6个组氨酸标签的原核表达载体pET-Trx，在表达菌BL(21)DE3中诱导表达出纳豆激酶蛋白质并用SDS-PAGE鉴定。
整套实验围绕纳豆激酶基因的亚克隆、重组、转化、筛选直到表达这一研究顺序进行操作。
其间共涉及学习约11种基因操作的基本技术，我们按这些操作技术出现的先后顺序分别编为实验一至实验十一。
各个实验之间具有很强的逻辑性和连贯性，前一个实验的结果就是下一个实验的原料。
整套实验设计实际上是一个基因操作实验平台，随时能根据需要更改外源基因和表达载体或进一步扩充实验内容。
我们在每年的教学实践中会不断增加目的基因和表达载体的种类，以便于学生实验小组能够从事不同的项目，减少雷同，增加兴趣。
分子生物学实验的宗旨是让学生在独立实践操作中学习分子生物学的基本研究方法和体会分子生物学研究的严密逻辑和科研理念。
实验教学的组织方式是科研项目式管理，即在教师的总体指导下，在给定的实验材料和实验条件的基础上，让学生独立思考、自行规划实验流程、制定实验计划、准备实验材料、动手操作、整理和分析实验结果，最后完成实验项目，写出实验论文。
因此学生在实验前要认真预习实验内容，结合学过的分子生物学原理，弄懂每一步实验的目的和原理，了解实验的内容和总体实验方案，写出分子生物学大实验《开题报告》，交教师审阅和讨论修改后才能进入实验室操作。
在实验过程中，教师不干涉学生的实验安排和操作程序，仅以导师的身份对学生的实验操作进行现场巡回指导、回答学生的疑问、为学生示范一些高档实验仪器和软件的使用，提供公用的试剂（如酶）等，并对学生的每一步实验结果进行评价和把关。
分子生物学实验指导书
分子生物学实验指导书本实验指导书包括三个紧密相关、前后衔接的实验，可供16-20学时的实验课教学使用。
实验内容均为分子生物学最常用的实验技术，希望同学们能熟练掌握。
实验体系已经多次尝试和优化，虽趋成熟但非尽善尽美，更非逢做必成。
随实验条件的变化，每次实验前的预实验是有必要的。
指导书如有不妥之处敬请指出，以便再次修订。
西北农林科技大学农学院柴守诚实验一植物总DNA的提取1.实验目的通过实验学习和掌握植物总DNA提取和纯化的原理和方法，并为后续的实验准备DNA样品。
2.实验原理2.1 DNA提取的原理植物组织中总DNA的提取首先要破碎细胞。
植物细胞具有坚硬的细胞壁，液氮冷冻和研磨是破碎植物细胞壁的有效方法。
而细胞膜、核膜等膜体系的破坏则通过加入提取缓冲液中的去污剂的处理来实现。
常用的去污剂有SDS(sodium dodecyl sulfate，十二烷基硫酸钠)，CTAB(cetyltrimlthylammonium bromide，十六烷基三乙基溴化铵)等。
细胞壁、细胞膜及核膜破坏后，释放出细胞内含物至提取缓冲液，内含物中包括DNA、RNA和蛋白质等。
将其他组分除去或降解，然后回收DNA是常采用的一种提取和纯化DNA的技术路线。
磨碎的植物组织经提取缓冲液处理后通过离心可沉淀植物组织残渣至试管底部，取上清液、弃残渣，上清中加入苯酚和氯仿（三氯甲烷）处理后经离心蛋白质沉淀于有机相（下相）和水相（上相）的界面处。
水相中含有溶解的DNA和RNA,收集水相加入核糖核酸酶A(ribonuclease A ，RNaseA)则使RNA降解，而DNA仍完整。
加入乙醇或异丙醇可使DNA呈絮状沉淀析出，絮状沉淀可用玻棒或牙签缠绕挑出或通过离心收获，并重新溶解于适量的TE缓冲液中备用。
2.2 DNA提取的质量要求对DNA提取样品的基本质量要求是尽量保持DNA分子的完整性（即没有或很少降解）和样品的高纯度（即蛋白质和RNA等的污染程度低）。
高中生物实验指南：分子生物学实验操作手册
高中生物实验指南：分子生物学实验操作手册1. 简介分子生物学是研究生物体内分子结构、组成、功能以及相互作用的科学。
在高中生物学课程中，通过进行一系列分子生物学实验，可以加深对基因、DNA、RNA等内容的理解，并培养学生动手实践和科学探究的能力。
本操作手册将介绍一些适合高中副标准课程的基本分子生物学实验，帮助教师和学生更好地开展这方面的实验教学。
2. 实验一：提取DNA2.1 实验目的了解DNA的结构和提取过程，并掌握提取DNA的基本方法。
2.2 材料与仪器•成熟香蕉或其他植物材料•盐水溶液（含氯化钠）•蛋白酶（如葡萄胺酸酶）•洗涤剂（如洗衣粉）•咖啡滤纸或滤纸漏斗•烧杯•酒精1.将香蕉剥皮后放入砧板上，用刀将香蕉捣碎成泥状。
2.在烧杯中加入适量的盐水溶液，并将捣碎的香蕉放入其中搅拌均匀。
3.加入少量蛋白酶和洗涤剂，再次搅拌均匀，让细胞破裂释放DNA。
4.将混合物过滤到另一个烧杯中，通过滤纸除去大颗粒的残渣。
5.将过滤后的溶液倒入试管中，并缓慢地倾斜试管，在溶液与酒精接触的界面处，会出现白色粘稠物质，即提取到的DNA。
2.4 实验结果及分析实验中提取到的DNA呈现为白色细丝状物质。
通过这个实验可以观察到DNA 在水相和酒精相之间的界面上凝聚堆积。
说明了DNA在酒精中不溶性，从而便于提取。
3. 实验二：PCR扩增3.1 实验目的了解聚合酶链式反应（PCR）的原理和基本步骤，并能够进行PCR扩增实验。
3.2 材料与仪器•PCR试剂盒（含模板DNA、引物、聚合酶等）•热循环仪•PCR试管或反应管1.准备PCR反应体系，按照试剂盒说明书的要求加入模板DNA、引物和聚合酶等。
2.将装有反应溶液的PCR管放入热循环仪中。
3.设置PCR的温度程序，包括变性、退火和延伸阶段。
4.启动热循环仪开始PCR扩增反应。
5.完成PCR后，可以通过凝胶电泳等方法检测扩增产物。
3.4 实验结果及分析通过PCR扩增，可以在较短的时间内大量复制并放大目标基因片段。
分子生物学实验指导（精）
分⼦⽣物学实验指导（精）分⼦⽣物学实验指导⽣物技术教学室编宁夏⼤学⽣命科学学院2008年8⽉实验⼀分⼦⽣物学实验技术多媒体演⽰[⽬的要求]通过多媒体试验录像进⼀步掌握分⼦⽣物学基本操作技术。
[教学⽅式]多媒体光盘演⽰。
[实验内容]基本的分⼦⽣物学实验操作技术包括核酸凝胶电泳技术；质粒提取；转化；重组体的筛选；PCR技术等。
实验⼆琼脂糖凝胶电泳检测DNA[⽬的要求]通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的⽅法和技术[实验原理]琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA⽚段的常⽤⽅法。
DNA分⼦在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分⼦筛效应，DNA分⼦在⾼于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。
由于糖磷酸⾻架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA⼏乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极⽅向移动。
不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp⾄50 kb的DNA⽚段。
在琼脂糖溶液中加⼊低浓度的溴化⼄锭（Ethidum bromide ,EB），在紫外光下可以检出 10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。
琼脂糖凝胶有如下特点：(1) DNA的分⼦⼤⼩在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数⽬的常⽤对数值成反⽐，分⼦越⼤迁移得越慢。
(2) 琼脂糖浓度⼀个特定⼤⼩的线形DNA分⼦,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。
DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。
(3) 电压低电压时，线状DNA⽚段迁移速率与所加电压成正⽐。
但是随着电场强度的增加，不同分⼦量DNA⽚段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩⼩。
要使⼤于2kb的DNA⽚段的分辨率达到最⼤，所加电压不得超过5v/cm。
(4) 电泳温度DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳⾏为受电泳时的温度影响不明显，不同⼤⼩的DNA⽚段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发⽣明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4℃条件下电泳。
分子生物学实验指导
1.5 mL 塑料离心管 10 个，0.5 mL 塑料离心管 7 个，塑料离心管架（30 孔）1 个，20、200、1000 µL 微量加样器各一支，常用玻璃仪器及滴管等， 台式高速离心机,恒温摇床,恒温培养箱,高压灭菌锅。 2、实验材料
大肠杆菌 JM109。 3、实验试剂
[思考题] 1．为什么 DNA 电泳速度共价闭环 DNA＞直线 DNA＞开环的双链环状
DNA，酶切后只剩下单一的直线 DNA 条带？ 2．在琼脂糖凝胶电泳（制备胶板，加样，电泳）过程中的注意事项是
什么？
实验三 质粒 DNA 的限制性内切酶酶切及电泳分离、鉴定
[实验目的] 学习和掌握限制性内切酶的特性、酶解的操作方法，理解限制性内切酶
（4）将有机玻璃内槽置于一水平位置，放好样品槽梳子。 （5）将冷却至 65°C 左右的琼脂糖凝胶液，小心地倒在有机玻璃内槽
上，控制灌胶速度，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面 形成均匀的胶层。室温下静置 lh 左右。 （6）待凝固完全后大约 30 min，将铺胶的有机玻璃内槽放在电泳槽中 备用。将电泳槽内注满 1× TAE 稀释液，注意，使 TAE 稀释液刚没过 胶即可。 （7）轻轻拔出样品槽梳子，在胶板上即形成相互隔开的样品槽。 2．加样 （1）微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品小槽内，加样时，微 量加样器的枪头垂直于样品槽上方，插入 TAE 稀释液，但不能碰到 样 品槽的凝胶面，将样品加入样品槽内。
[器材和试剂] 1．实验仪器 1.5mL 塑料离心管 10 个，0.5 mL 离心管 7 个，塑料离心管架（30 孔）
1 个，20、200、1000 µL 微量加样器各一支，锥形瓶（100mL 或 50 mL）白 搪瓷盘，玻璃纸，一次性塑料手套，常用玻璃仪器及滴管等，电泳仪，电泳 槽，样品梳子，有机玻璃内槽，台式高速离心机一台，台式高速冷冻离心机 一台，微型瞬间离心机一台，凝胶自动成像仪。
分子生物学实验指导
实验一、动、植物组织总RNA的提取一、材料、试剂和仪器材料：动物组织，一次性塑料手套，200 μl、1000 μl吸头。
试剂：TRIzol总RNA提取试剂，氯仿，异丙醇，0.1％DEPC，75％乙醇（用RNase-free 水配制），RNase-free水。
仪器：烘箱，超低温冰箱，高速冷冻离心机，普通离心机，高压灭菌锅，微量取样器，研钵二、提取操作步骤1、匀浆处理：a、动物组织：以鼠肝脏RNA提取为例。
取新鲜或-70'C冻存组织，大约10-30 mg组织加1m1 TRIquick，用一次性组织研磨杵或匀浆器匀浆处理。
b、单层培养细胞：直接在培养板中加入TRIquick裂解细胞，每10cm2面积加1ml TRIquick。
用取样器吹打混匀。
c、细胞悬液：离心收集细胞。
每5-10×106动物、植物和酵母细胞或每107细菌细胞加1 ml TRIquick。
d、血液处理：直接取新鲜的血液，加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10分钟，8，000-10，000 rpm离心1分钟。
彻底吸弃上清，收集白细胞沉淀。
每100-200 μl 血液收集的白细胞沉淀加入1 ml TRIquick。
2、将匀浆样品在室温放置5分钟，使得核酸蛋白复合物完全分离。
如不连续进行实验，加入TRIquick的匀浆样品可在－70'C下保存1-2个月。
3、可选步骤：4℃12，000 rpm离心5-10分钟，取上清。
如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可离心去除。
离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。
处理脂肪组织样品时，上层是大量油脂，应除去。
取澄清的匀浆溶液进行下一步操作。
4、每使用1ml TRIquick向匀浆样品中加0.2 ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置3-5分钟，使其自然分相。
如不能旋涡混匀，可手动颠倒混匀2分钟代替。
5、4℃12，000 rpm离心10-15分钟。
高中生物教案：分子生物学基础知识与实验实践指导
高中生物教案：分子生物学基础知识与实验实践指导简介
本教案旨在帮助高中生掌握分子生物学的基础知识和实验实践指导，深入理解细胞结构、DNA复制和转录、蛋白质合成等关键概念，并能运用所学知识进行实际的实验操作。
第一章：细胞结构与功能
1.细胞的基本组成
2.细胞膜和细胞壁
3.内质网和高尔基体
4.线粒体和叶绿体
5.溶酶体和核小体
第二章：DNA复制与转录
1.DNA的结构与功能
2.DNA复制的原理与过程
3.DNA修复机制
4.RNA的结构与功能
5.转录的过程和调控机制
第三章：蛋白质合成与调控
1.RNA翻译的基本原理与步骤
2.编码RNA和非编码RNA的作用差异
3.翻译后修饰过程及其功能
4.蛋白质合成调控的机制
实验实践指导：
实验一：观察细胞结构
1.实验目的
2.实验材料与器具
3.实验步骤
4.实验结果分析及讨论
实验二：观察DNA复制过程
1.实验目的
2.实验材料与器具
3.实验步骤
4.实验结果分析及讨论
实验三：转录和翻译实验操作指导
1.实验目的
2.实验材料与器具
3.转录实验步骤及结果分析
4.翻译实验步骤及结果分析
总结与思考题：
1.对以上所学知识进行总结归纳，并了解分子生物学在生物科学研究中的意
义。
2.思考如何将所学应用于解决现实问题或开展新的科学研究。
以上是关于高中生物教案：分子生物学基础知识与实验实践指导的简要概述，包括基础知识内容和相关实验操作指导。
通过本教案，希望能够帮助高中生全面掌握和运用分子生物学方面的知识，培养科学思维和实践能力。
分子生物学实验指导_LSW
实验一质粒DNA的小量制备（碱裂解法）一、实验原理所有分离质粒DNA的方法都含有以下3个步骤：①细菌培养物的生长；②细菌的收获和裂解；③质粒DNA的提取与纯化。
本实验以碱性SDS快速法小量制备pUC质粒。
碱裂解法对于以前应用的所有的大肠杆菌均卓有成效。
该方法的特点是，加溶菌酶可破坏菌体细胞（小量制备可省略不用溶菌酶），去污剂SDS可使细胞壁裂解，并使蛋白质变性，在碱性条件下，破坏碱基配对，故可使宿主的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而彼此不分开。
当条件恢复正常时（加入酸性试剂中和），质粒DNA链迅速得到准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。
细菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀下来而质粒DNA则留在上清液中，乙醇沉淀后可得到质粒DNA。
如需进一步纯化，可应用聚乙二醇沉淀法或氯化铯－溴化乙锭梯度平衡法。
环状双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型：当其两条多核苷酸链均保持着完整的环行结构时，称之为共价闭合环状DNA（cccDNA），这样的DNA通常呈现超螺旋SC构型；如果两条多核苷酸中只有一条保持着完整的环形结构，另一条出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA（ocDNA），此即OC构型；若质粒DNA经过适当的核酸内切限制制酶切割之后，发生双链断裂而形成线性分子（L DNA），通称L构型。
质粒DNA Mr一般在106～107之间，常以kb表示（l kb双链DNA=6.6×105）,如质粒pUC19的Mr为1.8×106 (2.69 kb)。
在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒DNA，尽管Mr相同，仍具有不同的电泳迁移率，其中走在最前沿的是scDNA，其后依次为L DNA和ocDNA。
二、实验材料与设备1. 用品与仪器可调微量取样器（20 μl、l 000 μl），Tip头，1.5 ml Eppendorf管，常用玻璃仪器，恒温空气摇床，台式高速微量离心机，旋涡振荡器。
分子生物学实验指导
分子生物学实验指导第一节、实验室规则及安全防护一、实验室规则二、实验室安全防护第二节、分子生物学常用研究技术一、核酸分离纯化二、聚合酶链反应技术三、分子杂交技术四、分子克隆技术五、其它新技术第三节、常用仪器使用一、离心机二、分光光度计三、PCR仪第四节、如何撰写实验报告第五节核酸分离纯化技术实验一、基因组DNA的提取制备与检测实验二、总RNA的提取制备与检测实验三、质粒DNA的提取制备与检测第六节 PCR技术实验四、常规PCR技术实验五、定量PCR技术第七节分子克隆技术实验六、DNA的限制性酶切与电泳实验七、凝胶中DNA片断的纯化回收实验八、DNA连接实验实验九、感受态细胞的制备实验十、重组DNA转化与篮白斑筛选第八节分子杂交技术实验十一、Southern 印迹杂交实验十二、Northern印迹杂交实验十三、Western印迹实验十四、核酸原位杂交第九节综合性实验实验十五、蛋白质双向电泳实验十六、酵母双杂交实验实验十七、RNA干扰实验第一节、实验室规则及安全防护一、实验室规则1．每个同学都应该自觉遵守课堂纪律，维护课堂秩序，不迟到，不早退，不大声谈笑。
2．实验前认真预习实验内容，熟悉本次实验的目的，基本原理，操作步骤，懂得每一步操作的意义和了解所用仪器的使用方法，否则不能开始实验。
3．实验时要听从指导老师的指导，严格认真地按规程进行实验，并注意与同组同学的配合。
未经许可，不得乱动实验装置、仪器以及电器设备等。
4．实验数据和现象应随时记录在专用的实验记录本上。
实验结束时，实验记录必须送指导老师审阅后方可离开实验室；实验报告应该当堂完成或在下次实验开始前交给指导老师。
5．保持台面、地面、水槽内及室内整洁。
精心爱护各种仪器，要随时保持仪器的清洁。
如发生故障，应立即停止使用并报告指导老师。
完成实验后应将器材洗净，把器材、药品归放回原处，试管倒置于试管架中并排列整齐。
按规定处理好废物，废液，做好清洁卫生。
分子生物学实验指导
《分子生物学》实验指导实验1 植物总DNA的提取生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。
由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。
同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。
本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。
[实验目的]学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。
学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。
[实验原理]植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。
本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。
CTAB 是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。
植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。
CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。
经过氯仿/ 异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA 沉淀分离出来。
由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。
核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。
纯的DNA样品A260/280≈，纯的RNA样品A260/280≈，并且1μg/ml DNA溶液A260=。
[实验器材]1、高压灭菌锅2、冰箱3、恒温水浴锅4、高速冷冻离心机5、紫外分光光度计6、剪刀7、陶瓷研钵和杵子8、磨口锥形瓶（50ml）9、滴管10、细玻棒11、小烧杯（50ml）12、离心管（50ml）13、植物材料[实验试剂]1、3×CTAB buffer（）100mM Tris25mM EDTA1.5M NaCl3% CTAB2% β-巯基乙醇2、TE缓冲液（）10mmol/L Tris·HCl1mmol/L EDTA3、氯仿-异戊醇混合液（24：1，V/V）4、95％乙醇5、液氮[实验步骤]1、称取2g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。
分子生物学实验指导-1
第一部分分子生物学实验入门一、实验室规则（一）实验室安全规则1．水电使用安全规则：注意节约用水（不管是自来水还是纯净水），清洗器皿时，先用自来水洗干净后，根据实验需要再用纯净水冲洗l～3遍；随时注意水龙头是否关掉，水池是否堵塞、漏水；注意节约用电，不能随意调节空调，仪器使用前应了解是否漏电、短路，使用完后按操作程序关掉电源；最后离开实验室的同学应检查实验室的照明灯、仪器电源、水龙头是否关掉。
2．药品使用安全规则：易燃易爆药品远离火源；注意有毒或腐蚀性药品—的使用方法；绝对禁止药品、试剂间的相互污染；废弃液体入水池后用水冲掉，固体废弃物严禁入水池；有毒废弃物倒到指定地点。
3．仪器使用安全规则：实验室任何仪器不能随意操作，严格按照操作规程进行；仪器在使用过程中出现故障要报告，不能自行处理；使用完仪器后要清洁仪器和台面并记录仪器使用情况。
（二）实验室卫生规则1．维护实验室的清洁卫生：不能随地吐痰，乱扔废纸屑等物品。
每小组实验完后清洗器皿和清理台面。
2．严格执行卫生值日制：实验完后实验室的清洁卫生由值日小组按照布置严格执行，不能无故不做。
（三）学生守则1．每位同学都应衣冠整齐，自觉遵守课堂纪律，维护课堂秩序，不得无故迟到早退，保持室内安静。
2．注意实验室环境、仪器和实验桌面的整洁，每次实验完成后该清洗的器皿清洗完后按原位放好，经老师检查后方可离开。
3．每次开始做实验前，应预习好实验指导，要充分了解实验原理、方法及仪器设备的使用方法，原则上按照实验指导的方法进行，如经预习，查资料后，有更好的实验方法，可与老师讨论后进行，鼓励创新。
4．使用仪器、药品、试剂和各种物品必须注意节约，应特别注意保持药品和试剂的纯净，严防混杂。
5．注意安全。
易燃易爆物远离火源，注意有毒或腐蚀药品的使用方法，玻璃器皿的使用、洗涤，尽可能减少损坏、割伤手。
行走时不要碰撞他物。
废弃液体倒入水槽并用水冲走，固体废弃物严禁入水槽，应丢入垃圾桶中。
分子生物学实验指导
分子生物学实验指导1. 实验背景分子生物学是研究生物大分子的结构、功能和相互作用的一门科学。
它包括DNA、RNA、蛋白质等生物大分子的研究，以及研究它们在细胞内的功能和相互作用的方式。
分子生物学的发展对于理解生物现象、治疗疾病和推动基因工程等都起到了重要的作用。
在进行分子生物学实验之前，我们需要了解一些基本的实验原理和步骤，以确保实验的准确性和可重复性。
本文将介绍一系列分子生物学实验的指导，包括DNA提取、PCR、凝胶电泳等。
2. 实验材料•细菌培养基•细菌菌株•试剂盒（DNA提取、PCR、凝胶电泳）•离心管、PCR管、琼脂糖凝胶板等实验器材3. 实验步骤3.1 DNA提取1.取一定数量的细菌菌株，并将其转接到细菌培养基中。
2.在转接后的细菌培养基中培养一夜，使细菌得到充分生长。
3.将培养好的细菌菌液转移到离心管中，进行离心。
4.移除上清液，加入细菌细胞裂解液，并进行充分混合。
5.进行高速离心，将裂解后的细菌细胞碎片与上清液分离。
6.取得上清液，为DNA提取做好准备。
3.2 PCR1.准备PCR反应试剂盒，包括模板DNA、引物、dNTPs等。
2.处理PCR管，加载模板DNA、引物、dNTPs和酶。
3.设置PCR反应器的温度程序，包括变性、退火和延伸等步骤。
4.将PCR反应管放入PCR机中，进行PCR反应。
3.3 凝胶电泳1.准备琼脂糖凝胶板，根据需要调整琼脂糖浓度和凝胶浓度。
2.准备样本，将PCR反应产物与DNA标准样品一同加载到凝胶孔中。
3.加载电泳缓冲液，确保凝胶完全被浸泡。
4.打开电泳仪，进行凝胶电泳，设定一定的电流和时间。
4. 结果分析通过实验，我们可以获得一系列结果。
在DNA提取实验中，我们可以通过测量DNA的浓度和质量来评估提取的效果。
在PCR实验中，可以通过检测PCR产物的大小和数量来评估PCR反应的效果。
在凝胶电泳实验中，可以通过观察凝胶图像来判断PCR产物的大小和纯度。
5. 实验注意事项在进行分子生物学实验时，需要注意以下事项：•实验前要充分准备。
分子生物学实验指导..
分子生物学实验指导生物实验教学中心主编：刘宝琦2009-06-01目录绪论分子生物学实验安全注意事项及分子生物学实验室所需要的仪器设备 (1)实验一植物基因组DNA 的分离 (6)实验二RNA 的分离 (11)实验三DNA/RNA 的琼脂糖凝胶检测 (15)实验四DNA/RNA 浓度、纯度的测定及浓度的调整 (21)实验五聚合酶链式反应（PCR） (24)实验六随机扩增多态性DNA 反应（RAPD） (28)实验七甜菜M14 品系AFLP 分析 (32)实验八生物信息学 (49)绪论分子生物学实验安全注意事项及分子生物学实验室所需要的仪器设备一、安全事项在实验室中安全是最重要的，分子生物学实验经常与毒性强，甚至致癌的试剂接触，所以进入分子生物学实验室的人员，必须了解所有的安全措施，并将实验室的操作置于最安全的条件下。
下面提到的几点须特别注意：1．有毒的化学试剂许多溶剂，像氯仿、异戊醇、异丁醇、正丁醇、甲醛和乙醚，应在通风橱中使用，并注意保护衣服、皮肤和呼吸道。
另一些试剂有可能是致癌物或诱变剂，像溴乙锭、甲酰胺，焦碳酸二乙酯（DEPC）等，在操作中应注意防护，并注意使用后的处理。
各种试剂在使用前都应认真看一下使用说明，特别是对一些试剂盒，掌握有关知识后，方可使用。
2．放射性有些实验需要使用32P 或其它放射性物质，在实验中要确实保证遵守使用这类物质的所有守则；对放射性废弃物也要同样小心。
3．生物学管制虽然现代生物技术领域的发展已经带来了巨大的社会和经济效益，生物技术所具有的巨大力量也给人类社会带来了许多意想不到的冲击，它既可以造福人类，也可能用来制造致命的生物武器，破坏整个人类社会的和平。
1976 年6 月30 日，美国国家卫生研究院制订并正式公布了“重组DNA 研究准则”，规定禁止若干类型的重组DNA 进行实验外，还制订了许多具体的条文规定。
这些规定主要包括对生物体的物理防护和生物防护。
物理防护主要是：实验室必须有技术熟练的工作人员，具有正确的物理防护设备，如负压装置，高压灭菌及安全操作箱等等。
高中生物分子生物学实验指导
高中生物分子生物学实验指导实验简介在这个实验指导中，我们将学习和探索高中生物学领域中的分子生物学。
通过一系列实验，我们将了解分子组成和功能、基因表达和遗传变异等重要概念。
以下是一些实验项目，旨在帮助您更好地理解和应用这些概念。
实验1：DNA提取实验目的了解DNA的结构、提取方法以及其在生物体内的作用。
材料与设备•细胞样本（如水果、口腔拭子或草叶）•蛋白酶K溶液•盐溶液•乙醇•热水浴或振荡培养箱实验步骤1.收集细胞样本并切碎。
2.加入蛋白酶K溶液和盐溶液，并轻轻混合。
3.将混合物置于热水浴或振荡培养箱中加热一段时间。
4.加入冷乙醇，使DNA沉淀。
5.用小棒或管嘴捕捉DNA。
结果与讨论观察提取到的DNA样本，并讨论其外观、形状和特点。
探讨DNA在生物体内的重要作用，例如遗传信息的传递和基因表达。
实验2：凝胶电泳实验目的学习凝胶电泳技术，并了解它在分子生物学中的应用。
材料与设备•DNA样本（可以是已经提取好的或商购）•凝胶（如琼脂糖凝胶）•缓冲液•电泳槽•电源实验步骤1.准备凝胶并制定好缓冲液。
2.加载DNA样本到凝胶孔中。
3.打开电源，进行电泳过程。
4.观察DNA带移动情况，记录结果。
结果与讨论根据DNA样本在凝胶上移动的速度和距离，可以分析其大小和形态差异。
通过对结果进行分析，可以探讨DNA片段大小、测序技术等与人类遗传疾病相关问题。
实验3：PCR反应实验目的学习聚合酶链式反应（PCR）技术，并了解其在基因检测、遗传工程等领域的应用。
材料与设备•DNA样本•PCR试剂盒（含有聚合酶、引物和核苷酸）•PCR仪实验步骤1.配制PCR反应混合液。
2.加入DNA样本到PCR反应管中。
3.将管放置在PCR仪中，进行温度循环。
结果与讨论观察PCR反应后的结果，检测是否扩增了DNA片段。
讨论PCR技术在基因检测、基因工程等领域的重要性和应用。
总结通过这些实验，我们逐步了解了分子生物学的一些核心概念和实验技术。
我们不仅能够提取DNA并观察其特点，还能使用凝胶电泳和PCR反应来分析DNA片段以及进行基因检测。
分子生物学实验指导
分子生物学实验指导动植物检疫专业2020，2分子生物学实验留意事项1．课前要提早预习实验内容，明白得实验设计的道理，理清实验次序，制订实验筹划（没有筹划或筹划不合理者不克不及进入实验操作）。
2．因为实验内容多，时刻短，多半实验须要同时或穿插进行，必定要做好兼顾安排。
3．实验课中的所有单项实验都属于一个整体流程。
实验时刻安排上没有高低午晚上等严格的作息安排，一切屈从实验进度，必须在理论课上课时代完成。
4．实验的每一步都要具体地记录操作内容、时刻、步调、成果等，以备查询！5．对任何本身不熟悉的实验仪器都不要随便操作（专门是微量移液器！）。
在操作的过程中发明任何不测的现象都要及时向任课教师报告请示。
6．写作实验申报或实验论文必定要文理通顺、逻辑清晰、图表说明具体，评论辩论分析透辟。
7．在实验室内不克不及大年夜声鼓噪。
8．在实验的过程中制造的任何垃圾都要丢到垃圾筐里（或先放在本身的桌面一角），严禁随地丢弃！专门留意对舍弃细菌的杀灭和有毒垃圾的定点投放。
9．实验停止后要把用过的器皿清洗后归放整洁并盘点数量，向教师报告请示征得赞成后方可分开实验实。
10．值日组的同窗最后分开，等待清扫实验室的卫生，封闭门窗水电。
11．实验时破坏的任何物品都要及时申报。
实验一质粒DNA的提取1．目标学会最常用的小量制备质粒DNA的碱裂解方法。
2．道理依照共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差别来分别。
在pH12.0~12.5那个狭小的范畴内，线性DNA双螺旋构造解开而被变性。
尽管在这项的前提下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会慎密结合在一路。
当参加pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH复原中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性迟缓，经由离心与蛋白质和大年夜分子RNA一路沉淀下去。
3．器材超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心计心境，旋涡混淆器，微量移液取样器，1.5ml 微量离心管，恒温摇床，摇菌试管，双面微量离心管架，试管架，标签纸，磁力搅拌机。
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实验一质粒DNA的小量制备（碱裂解法）一、实验原理所有分离质粒DNA的方法都含有以下3个步骤：①细菌培养物的生长；②细菌的收获和裂解；③质粒DNA的提取与纯化。
本实验以碱性SDS快速法小量制备pUC质粒。
碱裂解法对于以前应用的所有的大肠杆菌均卓有成效。
该方法的特点是，加溶菌酶可破坏菌体细胞（小量制备可省略不用溶菌酶），去污剂SDS可使细胞壁裂解，并使蛋白质变性，在碱性条件下，破坏碱基配对，故可使宿主的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而彼此不分开。
当条件恢复正常时（加入酸性试剂中和），质粒DNA链迅速得到准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。
细菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀下来而质粒DNA则留在上清液中，乙醇沉淀后可得到质粒DNA。
如需进一步纯化，可应用聚乙二醇沉淀法或氯化铯－溴化乙锭梯度平衡法。
环状双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型：当其两条多核苷酸链均保持着完整的环行结构时，称之为共价闭合环状DNA（cccDNA），这样的DNA通常呈现超螺旋SC构型；如果两条多核苷酸中只有一条保持着完整的环形结构，另一条出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA（ocDNA），此即OC构型；若质粒DNA经过适当的核酸内切限制制酶切割之后，发生双链断裂而形成线性分子（L DNA），通称L构型。
质粒DNA Mr一般在106～107之间，常以kb表示（l kb双链DNA=6.6×105）,如质粒pUC19的Mr为1.8×106 (2.69 kb)。
在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒DNA，尽管Mr相同，仍具有不同的电泳迁移率，其中走在最前沿的是scDNA，其后依次为L DNA和ocDNA。
二、实验材料与设备1. 用品与仪器可调微量取样器（20 μl、l 000 μl），Tip头，1.5 ml Eppendorf管，常用玻璃仪器，恒温空气摇床，台式高速微量离心机，旋涡振荡器。
含pUC19质粒DNA的大肠杆菌。
2. 试剂LB（Luria-Bertani）培养基：每升含胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，用10mol/L NaOH调pH至7.0，高压灭菌。
溶液I：50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris·HCl（pH8.0），10 mmol/L EDTA(pH8.0)，高压灭菌(6.895×104Pa) 15min，贮存于4℃。
溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH，1％SDS（临用时配制）。
溶液Ⅲ：pH4.8乙酸钾溶液（60ml 5mol/L KAC，11.5ml冰醋酸，28.5ml H2O）。
所配成的溶液钾离子浓度为3 mol/L，醋酸根离子浓度为5 mol/L。
灭菌。
V（酚）：V（氯仿）=1∶1：酚需在180℃重蒸，加入抗氧化剂8–羟基喹啉，终浓度为0.1﹪，并用Tris·HCl缓冲液平衡至pH＞7.6。
氯仿中加入异戊醇［V（氯仿）∶V（异戊醇）=24∶1］。
1×TE/RNaseA：10 mmol/L Tris·HCl，pH8.0；1mmol/L EDTA；20μg/m l RNaseA。
无水乙醇，70％乙醇，氨苄青霉素贮存液50 mg/ml。
三、实验操作程序1．细菌的生长与收获（1）将3~5 ml含氨苄青霉素（50 μg/ml）的LB加入到容量为15 ml、通气良好的长玻璃试管中，接入一单菌落，于37℃振荡（350 r/min）培养过夜。
（2）取1.5 ml细菌培养物加入Eppendorf管中，以5 000 r/min离心2 min去掉上清液，使细菌沉淀尽可能干燥。
2．碱裂解法（1）将细菌沉淀重悬于100 μl预冷的溶液Ⅰ中，充分分散混悬细菌。
（2）加入200 μl新配制的溶液Ⅱ，盖紧管口，快速颠倒数次，充分混合，要确保离心管的整个内表面均与溶液Ⅱ接触，冰浴放置5min。
（3）加入150 μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，颠倒数次使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，冰浴放置5min。
（4）在4℃以10 000 r/min离心5min，转移上清液到另一个Eppendorf管中。
（5）向上溶液加入等体积/酚/氯仿，振荡混匀，以5 000r/min离心2 min，转移上层水相至新的Eppendorf管中。
（6）向水溶液加入2倍体积无水乙醇，混匀，室温放置5 min，以10 000 r/min离心5min，倾去乙醇液，将离心管倒置于吸水纸上，吸干液体。
（7）加入1 ml 70％乙醇洗涤质粒DNA沉淀，按步骤（6）所述方法弃上清，于空气中或用电吹冷风使质粒DNA沉淀干燥。
（8）用20~30 μl含RNaseA酶（20 μg/ml）的TE溶解沉淀，4℃贮存。
3．琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒DNA通过琼脂糖凝胶电泳方法可鉴定。
通常情况下经碱裂解法制备的质粒DNA电泳时可见2~3条带。
四、讨论1．细胞的裂解作用是分离质粒DNA实验操作的关键步骤。
通常是加入溶菌酶或SDS来促使大肠杆菌细胞裂解的。
如果寄主细胞没有完全裂解，就会显著降低质粒DNA的回收率。
理想的状况是使每一个细胞都充分破裂到能使质粒DNA顺利溢出，而又没有污染过多的染色体DNA分子。
2．提取过程中，除规定的实验条件外，应尽量保持低温，避免过酸过碱，操作中手法要温和，防止机械剪切，尽可能避免脱氧核糖核酸酶对质粒DNA的降解和破坏。
3．采用酚/氯仿去除蛋白的效果较单独使用酚或氯仿好。
一般来讲，要将蛋白质尽量除干净，需多次抽提一次，已能达到实验要求。
注意在吸取上层水相时勿吸入下层有机相混于其中。
4．乙醇沉淀质粒DNA是最常用的沉淀方法，通常采用冷乙醇（无水乙醇贮存于-20℃），沉淀条件为-20℃，1 h。
因本实验为微量快速，室温下数分钟DNA即可沉淀，虽然DNA量少，但纯度相对高（因为低温长时间杂质也一并沉淀下来），有利于以后的酶切及电泳结果。
沉淀方法也可用乙丙醇，只需0.54倍体积常温下即可将DNA完全沉淀出来，这对于大体积的质粒DNA沉淀十分有效。
但缺点是常将盐等亦同时沉淀出来，因此需要用70％乙醇很好地洗涤。
一般来讲广泛应用的沉淀试剂还是乙醇。
实验二DNA的酶切一、实验原理限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。
它可分为三类：Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。
Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。
Ⅱ类由两种酶组成：一种为限制性内切核酸酶(限制酶)，它切割某一特异的核苷酸序列；另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序列。
Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。
绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如Eco RⅠ识别六个核苷酸序列：5'-G↓AATTC-3')，有少数酶识别更长的序列或简并序列。
Ⅱ类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ: 5'-CCC↓GGG-3')；有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端，如Eco RⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端：5'…G↓AATTC…3' 5'… G AATTC…3'3'…CTTAA↑G …5' 3'… CTTAA G…5'DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。
采用粘末端连接必须对目的DNA分子和载体分子进行酶切以获得相应的粘末端进行连接。
酶切可以是单酶切也可以是双酶切。
单酶切操作比较简单，但双酶切如果两种酶所用缓冲液成分不同（主要是盐离子浓度不同）或反应温度不同，这时可以采用如下措施解决：1）先用一种酶切，然后乙醇沉淀回收DNA分子后再用另外一种酶切；2）先进行低盐要求的酶酶切，然后添加盐离子浓度到高盐的酶反应要求，加入第二种酶进行酶切；3）使用通用缓冲液进行双酶切。
具体要根据酶的反应要求进行，尽量避免星号活力。
二、材料、试剂和仪器1 材料：质粒DNA2 试剂：限制性内切酶、ddH2O3 仪器：微量移液枪，离心机，水浴锅，电泳仪，紫外透射观测仪实验程序：取2只清洁、干燥、无菌的Eppendorf管，编号，按照限制性内切酶Hin dⅢ、Eco RⅠ试剂盒说明书用量，用微量注射器加入各种试剂\质粒λDNA和pBR322，最后用双蒸水补足至10 μl，小心混匀。
37℃水浴保温1-2 h，然后各小管内加入1μl的酶反应终止液，混匀，终止酶促反应，冰箱内保存备用。
操作前各试剂用量要反复核对，保证准确无误，所加试剂用量很少，必须认真操作。
I. 单酶切：（1）在一灭菌的1.5 ml 离心管中依次加入：质粒DNA 5 μlddH2O 3 μl10×buffer 1 μl限制性内切酶 1 μl总体积10 μl（2）混匀，稍离心（3）37℃水浴1~3 hr（4）70℃水浴10 min，中止酶切反应（5）电泳检测酶切效果II. 双酶切：（1）在一灭菌的1.5 ml 离心管中依次加入：质粒DNA 5 μl（约1μg）ddH2O 3 μl10×buffer 1 μl限制性内切酶1 0.5 μl限制性内切酶2 0.5 μl总体积10 μl（2）混匀，稍离心（3）37℃水浴1~3hr（4）70℃水浴10min，中止酶切反应（5）电泳检测酶切效果注：酶切的选择原则一般是尽量扩大酶切体系，这样抑制因素得以稀释；基因组DNA或质粒DNA酶的用量较一般DNA大，一般为1μg/10Μ;所加酶的体积不能超过酶切总体积的1/10，否则甘油浓度会超过5%，会产生星号活力；对难切的质粒或基因组DNA应延长反应时间4-5 hr，甚至过夜。
灭火限制性内切酶活性可以采用加热灭活，乙醇沉淀，酚/氯仿抽提，添加EDTA 或SDS等方法，具体每一种酶可能有些方法不能完全灭活，这一点需要注意。
三、结果与分析假若一种酶在环状质粒DNA中只有一个酶切位点, 且酶切彻底，紫外灯下检测电泳结果, 则单酶切应为一条带, 而双酶切则为两条带。
如果条带数目多于理论值,那么有可能是酶切不完全。
如果酶切结果与酶切前的质粒条带一样（超螺旋、线性和开环三条带），则说明质粒完全没有被切开。
M1 1 2 3 4 5 6 M2图2-1 重组质粒Hin dIII+Xba I双酶切琼脂糖凝胶电泳分析：M1: λ DNA/ Hin dIII, M2: DL2000, 1-6: 重组质粒Hin dIII+Xba I. 重组质粒用Hin dIII+Xba I双酶切后释放出插入片断，因此空载体处于同一水平位置，而插入片断长度分别为0.8, 2.1, 1.6, 1.2, 0.7和0.3 kb。