双向电泳的技术流程和样品制备
蛋白质组双向电泳原理及实验步骤.
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选择所放置的胶条数。 设置每根胶条的极限电流。(30-50A/根) 设置等电聚焦时的温度。(17℃)
配制SDS-PAGE凝胶
配制 12% 的丙烯酰胺凝胶,直接用双向电 泳专用梳子;或在上部留 0.5cm 的空间, 用MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇封胶。 聚合30分钟。 待凝胶凝固后,拔去梳子,用MilliQ水冲 洗;或倒去分离胶表面的乙醇或水饱和正 丁醇,用MilliQ水冲洗,备用。
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Fig1 上下图分别为正常大鼠和失神经大鼠腓肠肌蛋白双向电泳 图谱,右图为左图方框内的局部放大图。
应用 Application
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双向电泳技术在病原微生物蛋白质组学研究中挥着重要作用,可 用于研究样品总蛋白、不同样品蛋白质表达差异、蛋白质间相互作用、 蛋白质修饰等。病原微生物的蛋白质组学研究,可以了解其毒性因子、 致病机理以及药物抗性等方面,对疾病的诊断、治疗和预防非常重要。 目前病原微生物蛋白质组学和肿瘤蛋白质组学的研究正在兴起,而 双向电泳技术是研究蛋白质组学最关键的技术之一,广泛应用于生物 医学领域的研究工作,如通过寻找差异蛋白质,发现疾病相关的蛋白 质,寻找用于诊断的疾病相关标记分子,寻找疾病相关的蛋白质药靶, 以用于药物设计,研究疾病的致病机理等。随着蛋白质组学相关技术 的发展,如液相2-DE,蛋白质芯片结合SELDI-MS技术的 应用,蛋白质组学必将得到进一步的发展,并在疾病的发病机制、诊 断和治疗方面发挥重要的作用。蛋白质组双向电泳技术为人类疾病, 特别是恶性肿瘤的早期诊断和治疗方面已显示出了广阔的前景,必将 造福于人类。
两维间的平衡
• 等电聚焦电泳结束后可马上进行第二向电 泳,也可于-80°保存数月。
二维电泳原理和方法
如果样本较多地集中在高端和低端pH梯度,或者在较窄的pH梯度内分离大量蛋白质, 应使用Ettan IPGphor Manifold胶条槽和7、11、13、18或24 cm的Байду номын сангаасmmobiline DryStrip干胶条,上 样可采用样品杯、溶胀盘、或纸桥,详见2.3~2.5节。
MultiphorⅡ电泳系统(图7)具有多种功能,可进行几种不同的电泳。对于双向电泳,它既 可用于第一向IEF电泳,也可用于第二向SDS-PAGE电泳。干胶条进行溶胀时既可以含有样本, 也可以不含样本,溶胀在溶胀盘内进行。溶胀后,胶条被转移到电泳仪上进行第一向等电聚焦 (IEF)。
MultiphorⅡ电泳系统。这两种系统均可以通过升级配件而进一步改善 IEF 电泳性能。 Ettan IPGphor3 等电聚焦系统(图 1)是一种 IEF 电泳专用系统,电泳在 Immobiline DryStrip
干胶条上进行,该系统已经过升级,操作简单,可轻松完成第一向电泳分离。Ettan IPGphor3 等电聚焦系统的一贯特点是高速,可重复性好,高通量。该系统配备了高安全性的高压电源(根
概述
关于本手册
本手册旨在介绍高分辨率双向(2-D)电泳的操作方法。 本手册共分七章: 第一章介绍样品制备和蛋白定量的方法。 第二章具体介绍双向电泳中第一向的操作过程,重点介绍EttanTM IPGphorTM 3等电聚焦系 统。 第三章包括采用各种垂直凝胶电泳系统进行固相pH梯度(IPG)胶条的第二向电泳的一般方 法。 第四章介绍使用平板Multiphor TM Ⅱ电泳系统进行第一向和第二向电泳的方法。 第五章讨论双向电泳结果的图像与分析。 第六章介绍双向荧光差异凝胶电泳(2-D DIGE)的优势与使用技术。 第七章描述双向凝胶电泳的常见问题与解决方法。涉及具体技术的故障排除方法请见相关 章节。 本手册介绍的操作程序使用Amersham Biosciences公司的产品,该公司现为GE Healthcare公 司的一部分(下文均称GE Healthcare)。备选设备及照片见表1。产品订购信息见第155页。 根据样本类型和研究性质的不同,本手册所介绍的操作步骤可能须调整或优化。
双向凝胶电泳技术.
制备原则:
由于双向电泳所分析样品的多样性,没有一种通用的制备方法 适用于各种样品。但有几条共同的原则需要遵循
(1)尽可能溶解全部蛋白质,打断蛋白质之间的非共价键结合, 使样品中的蛋白质以分离的多肽链形式存在
(2)避免蛋白质的修饰作用和蛋白质的降解作用 (3)避免脂类、核酸、盐等物质的干扰作用 (4)蛋白质样品与第一向电泳的相容性。
双向凝胶电泳技术当前面临的挑战是:
(1)低拷贝蛋白的鉴定。人体的微量蛋白往往还是重要的调 节蛋白。除增加双向凝胶电泳灵敏度的方法外,最有希望 的还是把介质辅助的激光解吸/离子化质谱用到PVDF膜上, 但当前的技术还不足以检出拷贝数低于1000的蛋白质。
(2)极酸或极碱蛋白的分离。 (3)极大(>200kD)或极小(<10kD=蛋白的分离。 (4)难溶蛋白的检测,这类蛋白中包括一些重要的膜蛋白 (5)得到高质量的双向凝胶电泳需要精湛的技术,因此迫切
双向电泳的应用 双向电泳的分辨率较高,自第一次应用该技术以来,其
分辨率已从15个蛋白质点发展到10000多个蛋白质点。一 般的双向电泳也能分辨1000-3000个蛋白质点。因此,双 向电泳被广泛应用与农业,医学等研究领域。
由于蛋白质的等电点和分子量是两个彼此不相关的重 要性质,而2DE 同时利用了蛋白质间的这两个性质上的差 异分离蛋白质,因此2DE的分离能力非常强大,它甚至能 将细胞中5000种蛋白分离开,2DE 在分离蛋白混合样品, 比较差异方面有不可替代的作用,结合质谱鉴定技术可查 明大型蛋白复合物各组组分,与其他生物技术如分子生物 学,分子遗传工程,免疫学,微量蛋白质的自动氨基酸序 列分析相结合,可以快速准确的 发现和鉴定新的蛋白质。
聚焦完成后,胶条既可以在中间电压500-1000V下短时 间保持,便于随时进行第二向的平衡,也可以置于-80℃ 冰箱中进行长期保存。
荧光差异显示双向电泳技术原理
荧光差异显示双向电泳技术原理双向电泳是一种常用的蛋白质分离技术,通过电场的作用将蛋白质样品分离成不同的带状区域。
而荧光差异显示双向电泳技术则是在双向电泳的基础上,利用荧光染料对蛋白质进行标记,使得分离出的蛋白质带状区域能够以荧光的形式显示出来。
本文将详细介绍荧光差异显示双向电泳技术的原理及其在蛋白质研究中的应用。
荧光差异显示双向电泳技术的原理主要包括样品制备、电泳分离、荧光染色和荧光成像等步骤。
样品制备是荧光差异显示双向电泳的关键步骤之一。
样品制备的目的是将蛋白质从复杂的生物体中提取出来,并使其具备较好的电泳性质。
常见的样品制备方法包括胶束电泳法和硅胶柱层析法等。
胶束电泳法是通过洗涤剂将蛋白质从细胞中溶解出来,形成胶束溶液,再经过离心等步骤得到纯化的蛋白质样品。
硅胶柱层析法则是利用硅胶柱将蛋白质样品分离纯化,去除杂质。
样品制备的关键在于保证蛋白质样品的纯度和完整性,以便后续的电泳分离。
电泳分离是荧光差异显示双向电泳的核心步骤。
电泳分离是通过电场的作用将蛋白质样品分离成不同的带状区域。
由于蛋白质的分子量和电荷差异,蛋白质在电场中会产生不同的迁移速度,从而实现分离。
双向电泳是指在水平方向和垂直方向施加交叉电场,使得蛋白质样品能够同时在两个方向上进行迁移,从而增加了分离效果。
电泳分离的关键在于电场的施加和控制,以及电泳胶的选择和制备。
然后,荧光染色是荧光差异显示双向电泳的重要步骤之一。
荧光染色是通过将蛋白质样品与荧光染料结合,使得分离出的蛋白质能够以荧光的形式显示出来。
常用的荧光染料包括SYPRO Ruby、CyDye和FluorProtein等。
荧光染色的关键在于染料的选择和染色条件的优化,以确保荧光信号的强度和稳定性。
荧光成像是荧光差异显示双向电泳的最后一步。
荧光成像是通过荧光成像仪将荧光信号转化为图像,以便后续的分析和解读。
荧光成像的关键在于成像仪的选择和参数设置,以及荧光信号的采集和处理。
荧光差异显示双向电泳技术在蛋白质研究中具有广泛的应用。
蛋白样品制备
双向电泳之样品的制备2008-04-02 21:58:37| 分类:默认分类|举报|字号订阅一般性原则:样品制备是双向电泳中最为关键的一步,这一步处理的好坏将直接影响2-DE 结果。
目前并没有一个通用的制备方法,尽管处理方法是多种多样,但都遵循几个基本的原则:1)尽可能的提高样品蛋白的溶解度,抽提最大量的总蛋白,减少蛋白质的损失;2)减少对蛋白质的人为修饰;3)破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用,并使蛋白质处于完全变性状态。
根据这一原则,样品制备需要四种主要的试剂:离液剂(chaotropes),主要包括尿素(Urea)和硫脲(thiourea);表面活性剂(sufactants),也称去垢剂,早期常使用NP-40、TritonX -100 等非离子去垢剂,近几年较多的改用如CHAPS 与Zwittergent 系列等双性离子去垢剂;还原剂(reducing agents ),最常用的是二硫苏糖醇(DTT),也有用二硫赤藓糖醇(DTE)以及磷酸三丁酯(TBP)等。
当然,也可以选择性的加入Tris-base,蛋白酶抑制剂(如EDTA 、PMSF or Protease inhibitor c℃ktails )以及核酸酶。
样品的来源不同,其裂解的缓冲液也各不相同。
通过不同试剂的合理组合,以达到对样品蛋白的最大抽提。
在对样品蛋白质提取的过程中,必须考虑到去除影响蛋白质可溶性和2DE 重复性的物质,比如核酸、脂、多糖等大分子以及盐类小分子。
大分子的存在会阻塞凝胶孔径,盐浓度过高会降低等电聚焦的电压,甚至会损坏IPG 胶条;这样都会造成2-DE 的失败。
样品制备的失败很难通过后续工作的完善或改进获得补偿。
核酸的去除可采用超声或核酸酶处理,超声处理应控制好条件,并防止产生泡沫;而加入的外源核酸酶则会出现在最终的2D 胶上。
脂类和多糖都可以通过超速离心除去。
透析可以降低盐浓度,但时间太长;也可以采取凝胶过滤或沉淀/重悬法脱盐,但会造成蛋白质的部分损失。
双向电泳的概念和原理
双向电泳的概念和原理双向电泳是一种采用两个方向的电场同时作用于凝胶电泳系统的技术,用于分离复杂样品中的蛋白质或核酸。
首先,将样品溶解于含有凝胶的电泳缓冲液中。
凝胶是一种聚合物网状结构,可以限制分子的运动,将其分离。
常见的凝胶材料包括聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶。
第一步是水平电泳。
在水平电泳阶段,一个方向的电场施加在凝胶中,使得带电分子向着相应的电极方向移动。
这个方向通常被称为水平方向,因为它从一个电极移动到另一个电极。
在水平电泳过程中,由于分子的大小和电荷不同,它们将以不同的速度在凝胶中运动。
大分子移动缓慢,小分子移动快速。
这样,分子根据大小按照一定的顺序移动,导致它们在凝胶中排列成一条通常是呈斜角的直线。
这个方向通常被称为水平电泳通道。
第二步是垂直电泳。
在水平电泳结束后,垂直电场被施加在凝胶中,使分子以另一个方向移动。
这个方向通常被称为垂直电泳通道。
在垂直电泳过程中,分子将根据它们的电荷大小被拖曳向上(正电流)或向下(负电流)。
正电流将使分子向上移动,而负电流将使分子向下移动。
这样,分子将根据其电荷被分离并在凝胶中形成一条平行于水平电泳通道的直线。
最终,两个方向的电泳都完成后,在凝胶上会形成一个类似网格的结构,其中分子被分离成不同的带状。
这些带状物可以被染料或放射性示踪剂探测出来,从而确定分离出的分子的位置。
总结起来,双向电泳是一种利用两个方向的电场移动分子的方法。
通过水平电泳和垂直电泳,分子根据其大小和电荷被分离成不同的带状,从而实现复杂样品中蛋白质或核酸的分离和分析。
双向电泳步骤
以下是双向电泳的步骤:
1.从小管中取出400ml水化上样缓冲液,加入100ml样品充分混匀。
2.从冰箱中取-20°c冷冻保存的ipg预制胶条(17cm ph4-7),室温
中放置10分钟。
3.沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品,在槽两
端各1cm左右不要加样,中间的样品液一定要连贯。
注意:不要产生气泡,否则影响到胶条中蛋白质的分布。
4.当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后,用镊子
轻轻的去除预制ipg胶条上的保护层。
5.分清胶条的正负极,轻轻地将ipg胶条胶面朝下置于聚焦盘或水
化盘中样品溶液上,使得胶条的正极(标有+)对应于聚焦盘的正极,确保胶条与电极紧密接触。
6.在每根胶条上覆盖2-3ml矿物油,防止胶条水化过程中液体的蒸
发。
7.对好正、负极,盖上盖子。
设置等电聚焦程序,聚焦结束的胶条
应立即进行平衡、第二向sds-page电泳,否则将胶条置于样品水化盘中,-20°c冰箱保存。
双向电泳技术研究进展
双向电泳技术研究进展摘要:双向电泳(two dimensional electrophoresis , 2-DE)技术是获得细胞、组织或器官等蛋白表达图谱的主要手段,是蛋白质组学研究的三大核心技术之一。
本文主要从双向电泳技术的发展,主要操作步骤及其面临的主要挑战等方面对改技术的研究进展进行综述。
关键词:双向电泳;研究1.双向电泳技术的发展蛋白质双向电泳源于1975年O,Farrell. Klose.Scheele 对大肠杆菌、老鼠及几尼猪蛋白质的研究。
它首先根据样品中蛋白质等电点不同进行等电聚焦(IEF)作为第l向,然后再按照蛋白质分子量大小不同进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS -PAGE)作为第2向,经染色后可以在凝胶上得到大量的蛋白质点,从而得到样品的蛋白质表达图谱。
根据双向电泳中第l向等电聚焦方法的不同,双向电泳主要分为2个主要类型,ISO-DALT(等电点一道尔顿)IPG.DALT ( 固相pH梯度一道尔顿)双向电泳。
1.1 ISO-DALT双向电泳技术传统的ISO-DALT双向电泳中,首先将载体两性电解质添加在丙烯酰胺凝胶中,凝胶聚合后在电场作用下形成连续的DH值梯度,两性电解质以游离的形式分布于聚丙烯酰胺凝胶的网孔中。
通常采用圆柱状电泳,IEF凝胶制备在圆柱型玻璃管中,可以将样品加在未凝固的凝胶溶液中,也可在凝胶凝固后在玻璃管顶端加样,然后进行等电聚焦,通常在50~100V电压下聚焦1~2 h,让样品进入IEF胶条,然后在200 ~400V或更高电压下进行聚焦,直到电流接近零时为止。
等电聚焦结束后取下凝胶柱,向玻璃管中凝胶与管壁间注水,将凝胶条吹出,用缓冲液平衡凝胶条,主要目的是充分打断多肽链间及多肽链内部的二硫键并使其与SDS充分结合,然后将胶条用琼脂包埋于第2向电泳的凝胶板中,进行第2向SDS-PAGE,SDS-PAGE 可以使用均一的分离胶浓度,也可采用不连续梯度胶或者连续梯度胶。
双向电泳法
双向电泳法双向电泳法(Bidimensional Electrophoresis,2-DE)是一种常用的蛋白质分离技术,可以同时分析样品中上千种蛋白质。
本文将详细介绍双向电泳法的原理、步骤和应用。
原理双向电泳法结合了等电聚焦(IEF)和SDS-PAGE两种技术,通过两个维度的分离将复杂的蛋白质混合物分解为一系列单独的斑点。
在第一维度中,根据蛋白质的等电点(pI)进行分离;在第二维度中,根据蛋白质的分子量进行分离。
通过将这两个维度的分离结果叠加,可以获得高分辨率的蛋白质图谱。
双向电泳法的关键步骤如下:1.等电聚焦(IEF):在第一维度中,使用等电聚焦技术将样品中的蛋白质按照其等电点进行分离。
等电聚焦是一种基于蛋白质在电场中向氧化物离子(OH-)或氢离子(H+)方向移动的分离方法。
在等电聚焦过程中,蛋白质会在pH梯度中向其等电点迁移,直到净电荷为零。
通过控制pH梯度和应用的电压,可以将蛋白质在等电聚焦过程中分离开。
2.SDS-PAGE分离:在第二维度中,将第一维度的等电聚焦凝胶与SDS-PAGE凝胶垂直叠加。
在SDS-PAGE凝胶中,蛋白质通过聚丙烯酰胺凝胶的孔隙随着电场的作用向阳极迁移。
由于SDS(十二烷基硫酸钠)的存在,蛋白质在SDS-PAGE凝胶中的迁移速度与其分子量成反比。
因此,蛋白质在SDS-PAGE 凝胶中会根据其分子量进行分离。
3.染色和分析:经过双向电泳分离后,凝胶可以通过染色方法显示出一系列斑点,每个斑点代表一个蛋白质。
常用的染色方法包括银染法、荧光染色、贵金属染色等。
对于银染法,它在灵敏度和线性范围上具有优势。
染色后可以使用成像设备捕捉图像并进行定量分析。
通过对斑点的比较和定量,可以识别不同样品之间的差异和变化。
步骤双向电泳法的步骤如下:1.样品制备:将待分析的生物样品(如细胞提取物)进行蛋白质提取,并使得蛋白质在石蜡中可溶解。
常用的方法包括总蛋白提取、亲和层析、激光捕获等。
2.等电聚焦(IEF):将蛋白质样品与具有连续pH梯度的凝胶进行接触。
双向电泳资料
双向电泳资料蛋⽩质双相电泳系统⼀. 样品制备1、型号:MicroRotorfor Cell⽣产⼚家:Bio-Rad (美国伯乐公司)除传统的层析⽅法,等电点分离⽅法等样品提取⽅法外,Bio-Rad提供了独特的样品序列抽提⽅案,提⾼了样品处理的灵敏度和分辨率。
⽤途:根据等电聚焦原理对蛋⽩质进⾏纯化,达到样品的去污染、粗分和浓缩。
技术指标分离组分10聚焦槽内径r 13mm样品体积 2.3-2.5ml组分体积200-250ul上样量微克⾄毫克冷却内置式半导体冷却系统2. 电源主要技术参数型号:PowerPac Hv1. 电压:20-5,000V2. 电流:0.01-500mA3. 功率:1-400W4. 输出: 4对电源输出,可同时运⾏4个电泳槽5. 输出⽅式:恒压,恒流⽅式或恒功率,可编程6. 定时:1min-99hr,59min7. 暂停功能:有8. 操作条件:0-40度,湿度0-95%,⽆冷凝⽔9. 安全标准:EN61010,EC10. 安全性能:经空载检测,突变负载检测,超载/短路保护,输⼊线保护,断电保护测试.11. 可编程⽅法:储存9个⽅法,每个最多9个步骤.⼆.第⼀向电泳⼀维等电聚焦系统及⼲胶条型号:Protean IEF Cell⽣产⼚家:Bio-Rad (美国伯乐公司)Protean IEF系统是⼀体化的⼀维等电聚焦系统,它提供了10000V的⾼电压,以及10-25度的精确温控。
同时,IEF可同时容纳12根11,17,18,24cm的胶条,保证了实验的⾼通量。
对于实验室经常进⾏的7cm的预实验(摸索条件等),它可提供每次跑24根胶的⾼通量。
我们提供了不同尺⼨不同的pH值梯度的IPG(immobilized pH gradient)⼲胶条。
从尺⼨分有7,11,17,18cm⼲胶条,并即将推出24cm⼲胶条;从pH值梯度分,有宽梯度:3-10线性,3-10⾮线性;有窄梯度:3-6,4-7,5-8,7-10;有微梯度:3.9-5.1,4.7-5.9,5.5-6.7,6.3-8.3。
双向电泳操作双向电泳的技术流程和样品制备ppt课件
第三步:用含复合表面活性剂的蛋白溶解液,最后抽 提前两次抽提后不能溶解的膜蛋白约占整个样品的 11%(W/W)。
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的,应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失,增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的,应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失,增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
增加样品溶解性的手段
变性剂:通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸 展,将其疏水中心完全暴露,降低接近疏水残基的能 量域。其典型代表是尿素和硫尿。
双向电泳分析中的样品制备
制备原则:
应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态(包括 多数疏水性蛋白),且制备方法应具有可重现性。
防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。 防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰
(如酶性或化学性降解等)。 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白,从而保证
Amount 4.1ml of 8.5 stock or 2.1g urea in 3ml H2O 760mg
50ul of 200mM TBP stock
200mg See table 10ul of 0.1% stock To 5ml
Multiple surfactant solution preparation 经营者提供商品或者服务有欺诈行为的,应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失,增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用
IPG pH Range 3-10 4-7
BIO-RAD双向电泳中文手册
ProteomicsBio-Rad蛋白质组双向电泳实验操作手册 ProteomeWorks TM System双向电泳实验流程z样品制备(Sample preparation)z固相预制胶条的水化(IPG strip rehydration)z第一向等电聚焦(IEF)z胶条的平衡(IPG strip equilibration)z第二向SDS-PAGE电泳(SDS-PAGE electrophresis) z凝胶的染色及检测(Detection/Staining)z PDQuest软件分析(Software analysis)z质谱鉴定(Protein identification)目 录第一章 实验材料1.1 IPG预制胶条及载体两性电解质1.2 蛋白质定量试剂盒及其试剂1.3 试剂盒及其试剂1.4 化学试剂1.5 蛋白质Marker1.6 染色试剂1.7 注意事项第二章 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳 2. 1 溶液的配制2. 2 SDS-PAGE凝胶的配制2. 3 操作方法2. 4 注意事项第三章 双向电泳3. 1 溶液配制3. 2 操作步骤3. 3 注意事项附录1 双向电泳完整的操作步骤附录2 聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶的配置 附录3 细胞样品的一般处理步骤附录4 组织样品的一般处理步骤第一章 实验材料1.1 IPG预制胶条及载体两性电解质(一)IPG预制胶条(美国Bio-Rad公司),-20℃冰箱保存cm 163-2000 IPG预制胶条 pH 3-10,7,nonlinear(NL) 163-2002cmIPG预制胶条 pH 3-10, 7cm 163-2001 IPG预制胶条 pH 4-7,7cm 163-2003 IPG预制胶条 pH 3-6,7cm 163-2004 IPG预制胶条 pH 5-8,7cm 163-2005 IPG预制胶条 pH 7-10,7IPG预制胶条 pH 3-10,17cm 163-2007cm,nonlinear(NL) 163-2009 IPG预制胶条 pH 3-10, 17IPG预制胶条 pH 4-7,17cm 163-2008 IPG预制胶条 pH 3-6,17cm 163-2010 IPG预制胶条 pH 5-8,17cm 163-2011 IPG预制胶条 pH 7-10,17cm 163-2012 IPG预制胶条 pH 3-10,18cm 163-2032 IPG预制胶条 pH 3-10, 18cm,nonlinear(NL) 163-2033 IPG预制胶条 pH 4-7,18cm 163-2034 IPG预制胶条 pH 3-6,18cm 163-2035 IPG预制胶条 pH 5-8,18cm 163-2036 IPG预制胶条 pH 7-10,18cm 163-2037 IPG预制胶条 pH 3-10,11cm 163-2014 IPG预制胶条 pH 3-10, 11cm,nonlinear(NL) 163-2016 IPG预制胶条 pH 4-7,11cm 163-2015 IPG预制胶条 pH 3-6,11cm 163-2017 IPG预制胶条 pH 5-8,11cm 163-2018 IPG预制胶条 pH 7-10,11cm 163-2019 IPG预制胶条 pH 3.9-5.1,17cm163-2020163-2021 IPG预制胶条 pH 4.7-5.9,17cmIPG预制胶条 pH 5.5-6.7,17cm163-2022163-2023 IPG预制胶条 pH 6.3-8.3,17cm163-2038 IPG预制胶条 pH 3.9-5.1,18cm163-2039 IPG预制胶条 pH 4.7-5.9,18cm163-2040 IPG预制胶条 pH 5.5-6.7,18cm163-2041 IPG预制胶条 pH 6.3-8.3,18cm163-2024 IPG预制胶条 pH 3.9-5.1,11cm163-2025 IPG预制胶条 pH 4.7-5.9,11cm163-2026 IPG预制胶条 pH 5.5-6.7,11cm163-2027 IPG预制胶条 pH 6.3-8.3,11cmIPG预制胶条 pH 3.9-5.1,7cm 163-2028 IPG预制胶条 pH 4.7-5.9,7cm 163-2029 IPG预制胶条 pH 5.5-6.7,7cm 163-2030 IPG预制胶条 pH 6.3-8.3,7cm 163-2031 (二)载体两性电解质(美国Bio-Rad公司),4℃冰箱保存Bio-Lyte 3/10 Ampholyte,40%,10ml 163-1112 Bio-Lyte 3/10 Ampholyte,40%,25ml 163-1113 Bio-Lyte 3/5 Ampholyte,20%,10ml 163-1132 Bio-Lyte 4/6 Ampholyte,40%,10ml 163-1142 Bio-Lyte 4/6 Ampholyte,40%,25ml 163-1143 Bio-Lyte 5/7 Ampholyte,40%,10ml 163-1152 Bio-Lyte 5/7 Ampholyte,40%,25ml 163-1153 Bio-Lyte 6/8 Ampholyte,40%,10ml 163-1162 Bio-Lyte 6/8 Ampholyte,40%,25ml 163-1163 Bio-Lyte 7/9 Ampholyte,40%,10ml 163-1172 Bio-Lyte 8/10 Ampholyte,20%,10ml 163-1182 Bio-Lyte 5/8 Ampholyte,40%,10ml 163-1192 Bio-Lyte 5/8 Ampholyte,40%,25ml 163-1193 (三)等电聚焦上样缓冲液(美国Bio-Rad公司),4℃冰箱保存100×ReadyStrip Buffer,for pH 7-10 IPG Strips,1ml 163-2093 Bio-Lyte 3/10 Ampholyte,100×,1ml 163-2094163-2095 100×ReadyStrip Buffer,for pH 6.8-8.3 IPG Strips,1ml100×ReadyStrip Buffer,for pH 5.5-6.7 IPG Strips,1ml163-2096163-2097 100×ReadyStrip Buffer,for pH 4.7-5.9 IPG Strips,1ml163-2098 100×ReadyStrip Buffer,for pH 3.5-5.1 IPG Strips,1ml1.2 蛋白质定量试剂盒及其试剂Protein Assay Kit I,bovine γ-globulinstandard 500-0001standard 500-0002 Protein Assay Kit II,BSAProtein Standard I,bovine γ-globulin,1bottle 500-0005500-0006 Protein Assay Dye Reagent Concentrate,450mlbottle500-0007 Protein Standard II,bovine serum albumin,1standard500-0121 RC DC Protein Assay Kit I,bovine γ-globulin500-0122 RC DC Protein Assay Kit II,BSAstandard1.3 试剂盒及其试剂ReadyPrepExtractionKit 163-2100 SequentialTributylphosphine(TBP),200mM,0.6ml 163-2101163-2102 ReadyPrep Sequential Extraction Kit Reagent 1,1vial163-2103 ReadyPrep Sequential Extraction Kit Reagent 2,1vial163-2104 ReadyPrep Sequential Extraction Kit Reagent 3,1vialKit 163-2105 StarterReadyPrep2-DReadyPrep 2-D Starter Kit Rehydration/Sample Buffer 163-2106DTT 163-2107 ReadyPrep Starter Kit Equilibration Buffer I,withBufferIIEquilibration163-2108 ReadyPrepStarterKitIodoacetamide,30g 163-2109E.coli Protein Sample,lyophilized,2.7mg163-2110 ReadyPrep Overlay Agarose,50ml 163-2111 1.4 化学试剂尿素Urea,250g 161-0730 尿素Urea,1kg 161-0731Resin 142-6425 AG 501-X8(D)MixedBedCHAPS,1g 161-0460 CHAPSO,1g 161-0465 Triton X-100,500ml 161-0407 DTT(Dithiothreitol),1g 161-0610 DTT(Dithiothreitol),5g 161-0611Tributylphosphine(TBP),200mM,0.6ml 163-2101 溴酚蓝(Bromophenol Blue),10g 161-0404 矿物油(Mineral Oil),500ml 163-2129 SDS,25g 161-0300 SDS,100g 161-0301 SDS,1kg 161-0302 Tris,100g 161-0715 Tris,500g 161-0716 Tris,1kg 161-0719Iodoacetamide,30g 163-2109 低熔点琼脂糖,25g 161-3111161-0717 甘氨酸,250g甘氨酸,1kg 161-0718甘氨酸,2kg 161-0724丙烯酰胺(Acrylamide),99.9%,100g 161-0100 丙烯酰胺(Acrylamide),99.9%,500g 161-0101 丙烯酰胺(Acrylamide),99.9%,2kg 161-0103 丙烯酰胺(Acrylamide),99.9%,1kg 161-0107 丙烯酰胺(Acrylamide),99.9%,5kg 161-0108 甲叉双丙烯酰胺(Bis),5g161-0200 甲叉双丙烯酰胺(Bis),50g 161-0201161-0202 PDA(Piperazine Diacrylamide),10g161-0203 PDA(Piperazine Diacrylamide),50g过硫酸氨(Ammonium Persulfate),10g 161-0700161-0754 过硫酸氨(Ammonium Persulfate),100gTEMED,5ml 161-0800TEMED,50ml 161-0801 甘油国产或Sigma 硫尿Sigma1.5 蛋白质Marker2-D SDS-PAGE Standards,500μl161-0320161-0303 SDS-PAGE Standards,high range,200μlSDS-PAGE Standards,low range,200μl 161-0304161-0317 SDS-PAGE Standards,broad range,200μlPolypeptide SDS-PAGE Standards,200μl 161-0326 Precision Protein Standards,unstained,1500μl,150 applications 161-0362Precision Protein Standards,prestained,500μl,50 applications 161-0372161-0325 Kaleidoscope Polypeptide Standards,500μlKaleidoscope Prestained Standards,broad range,500μl 161-0324161-0309 Prestained SDS-PAGE Standards,high range,500μlPrestained SDS-PAGE Standards,low range,500μl161-0305 Prestained SDS-PAGE Standards,broad range,500μl 161-0318 IEF Standards,pI range 4.45-9.6,250μl 161-0310 1.6 染色试剂Coomassie Brilliant Blue R-250,10g161-0400161-0406 Coomassie Brilliant Blue G-250,10gIEF Gel Staining Solution,1L 161-0434 Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solutions Kit 161-0435Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solutions,1L 161-0436161-0437 Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solutions,4×1L161-0438 Coomassie Brilliant Blue R-250 Destaining Solutions,1LCoomassie Brilliant Blue R-250 Destaining Solutions,4×1L 161-0439 Bio-Safe Coomassie Stain,1L 161-0786 Bio-Safe Coomassie Stain,5L 161-0787 SYPRO Ruby Protein Gel Stain,200ml 170-3126 SYPRO Ruby Protein Gel Stain,1L 170-3125 SYPRO Ruby Protein Gel Stain,5L 170-3138 Silver Stain Kit 161-0443Kit 161-0450 PlusSilverStain1.7 注意事项1.双向电泳中所用的化学试剂纯度要高,至少为分析级。
双向电泳实验蛋白质样品制备要点
双向电泳实验蛋白质样品制备要点双向电泳是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段,是蛋白质组学研究中的一种常用技术。
这项技术利用蛋白质的两种特性,即等电点与相对分子量,通过等电聚焦(IEF)与十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)这两项技术,将上千种不同的蛋白质分离,同时得到每种蛋白质的等电点、相对分子量和含量等信息。
这里将蛋白质样本分为两种,一种是血清样本,另一种是组织和细胞样本,分别介绍样本的制备方法。
一、血清样本的制备血清和其他生物液体中的蛋白质存在有大量的白蛋白和IgG而很难用双向电泳分离,因为这些蛋白质会掩盖凝胶上的其他蛋白,从而难以分辨血清蛋白量。
而且这些蛋白质的等电点和分子量分布范围广,会掩盖一些低分度的蛋白质,因此需要使用白蛋白和IgG清除试剂盒(使用IgG结合树脂作为清除试剂),具体步骤如下:①用移液管移取15μL人血清,放入带盖样本管中(为保证良好的树脂与样本的混合,推荐采用一次性15mL离心管)。
②在含有样本的管中加入750μL悬浮匀浆,取液前必须保证树脂匀浆为均匀的悬浮液。
③室温下在振荡混合器上混合匀浆/样本混合液3分钟,混合转速应确保混合液处于悬浮液状态。
④将微离心柱的底端折去,置于试剂盒中所配的离心管中。
⑤孵育完成时,确保树脂处于悬浮状态,然后小心地将树脂/样本混合物移入微离心柱的上层槽中。
⑥以大约6500×g离心5分钟。
⑦将含有树脂凝胶的上层槽弃去,收集滤出液。
⑧样品即可用于下一步的处理和储存备用。
二、组织和细胞样本的制备裂解不同种类的蛋白质样本应采取不同的处理和条件,裂解的效果取决于细胞破碎的方法、蛋白质浓缩和裂解的方法,去污剂的选择以及样本溶液的组成等。
1. 破碎细胞的方法细胞破碎过程中蛋白酶可能被释放出来,并引起蛋白质的分解,使双向电泳的最后结果复杂化。
因此,应直接将样本在强变性液裂解(8mol/L尿素、10%TCA或2%SDS)来抑制蛋白酶,并且在低温下制备样品。
蛋白质双向电泳实验流程
蛋白质双向电泳实验流程一.样品制备1.研磨研磨时间要尽量短,并需及时补充液氮,研磨要充分,同时要保证损失少。
2.加入8mLTris饱和酚(pH8.8)和8mL抽提液,在通风橱内研磨30s。
先加8mLTris饱和酚,Tris饱和酚会变成固体,此时需用研磨碓将固体的Tris饱和酚研磨成小块。
接着加入8mL抽提液,也需将固体的抽提液研磨成小块。
等三者混匀后,将粉末转移至45 mL tube。
3.振荡30min。
室温静置,待tube中固体变成液体后,开始振荡。
振荡需持续30min,每振荡1min,置于冰上冷却1min。
4.10000g,4℃,10min。
将酚相(top phase)转移至45mL tube。
酚相(top phase)可置于冰上。
酚相应该是绿色的,水相应该是淡黄色的。
5.取6mL的抽提液和6mL饱和酚加入水相,蜗旋振荡30min。
振荡需持续30min,每振荡1min,置于冰上冷却1min。
6.10000g,4℃,10min。
将酚相(top phase)转移至45mL tube。
7.沉淀酚相。
取一定体积(是酚相的5倍)的0.1M乙酸铵/甲醇溶液(–20℃保存)于酚相(45mL tube)。
振荡30s,–20℃培育1h或过夜。
8.清洗沉淀①15 min,20,000 g,4℃。
弃上清。
②加10mL 0.1 M乙酸铵/甲醇溶液,用移液器吸打。
–20℃沉淀30min。
③15 min,20,000 g,4℃。
弃上清。
④加入10 mL乙酸铵/甲醇溶液,用移液器吸打。
–20℃沉淀30min。
⑤15 min,20,000 g,4℃。
弃上清。
⑥加10mL 80%丙酮(ice-cold),用移液器吸打。
–20℃沉淀30 min。
⑦15 min,20,000 g,4℃。
弃上清。
⑧加入10 mL 80%丙酮(ice-cold),用移液器吸打。
–20℃沉淀30 min。
⑨15 min,20,000 g,4℃。
弃上清。
双向电泳步骤--标准操作完整版
细胞裂解(蛋白质提取)一、试剂配置:PBS配方PBS缓冲液一般作为溶剂氯化钠(MW 58.44) 130mM 8g氯化钾(MW 74.5) 2.7mM 0.2g十二水和磷酸氢二钠(MW 358) 10 mM 3.63g磷酸二氢钾(MW 136) 2 mM 0.24g加水至1L配好后进行高压灭菌。
Washing buffer(500mL)配方Tris(MW 121.1) 10mM 0.605g蔗糖(MW 342) 250mM 42.75g加水溶解,用HCl调pH至7.0后用孔径为0.22µm滤膜过滤(使用1M盐酸略高于2750uL调pH)裂解储液配方(细胞):尿素(MW 60.06) 7M 4.2g硫脲(MW 76.12) 2M 1.52gCHAPS(MW614.89) 4%(W/V)0.4g 加超纯水定容至10mL后经0.22µm一次性滤膜过滤,过滤后分装成20小管,每小管500uL,-20℃冰箱保存。
裂解储液配方(组织):尿素(MW 60.06) 5M 3g硫脲(MW 76.12) 2M 1.52gCHAPS(MW614.89) 2% 0.2gTris(MW 121.1) 40mM 0.048g加超纯水定容至10mL后经0.22µm一次性滤膜过滤,过滤后分装成20小管,每小管500uL,-20℃冰箱保存。
裂解液:裂解液储液 100uLIPG buffer(pH可选) 2% 2uLPi 2uLNucLease mix(100×) 1uLPMSF(100mM:20mg/mL) 1mM 1uLDTT(0.411g/mL) 40mM 1.5uLPi:每片使用200uL超纯水溶解后按10 uL分装考马斯亮蓝G-250:考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色,最大光吸收在465nm;当它与蛋白质结合后变为青色,蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。
其光吸收值与蛋白质含量成正比。
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Multiple surfactant solution preparation
Reagent 5M urea 2M Thiourea 2mM TBP 2% CHAPS 2%SB3-10 0.2%carrier ampholytes 40mM Tris 0.0002%bromophenol blue ddH2O Amount 2.9ml of 8.5 stock or 1.5g urea in 3ml H2O 760mg 50ul of 200mM TBP stock 100mg 100mg See table 24.2mg 10ul of 0.1% stock To 5ml
强碱性蛋白质(如核糖体 )的处理:先将蛋白预处 理以富集,再用特殊pH梯度的IPG胶条(如pH3-12、 4-12或10-12)进行等电聚焦。其中窄范围碱性IPG胶 (如pH10-12)的挑战是克服反向、阴极向阳极、电 渗流和水平条纹模式,而宽范围的碱性IPG胶(如 pH3-12、4-12)等消除了窄范围胶所需要的专门水化 液。 极端分子量的蛋白质: 极端分子量的蛋白质:小于8kD和大于200kD的蛋白 在常规IPG-2D上不易看到,这可能是在Tris/glycine缓 冲液中,样品和游离的dodelcyl sulfate ions持续积累浓 缩,与小分子量的蛋白质发生对流混合,产生茸毛状 的或模糊的带,从而降低小蛋白的分辨率;在胶底端, 高浓度的十二磺酸使蛋白固定致染色困难。至于高分 子量蛋白少的原因可能是在变性条件下,蛋白质复合 物变成了多肽,或者可能是大分子。
Multiple chaotropic agent solution preparation
Reagent 7M urea 2M Thiourea 2mM TBP 4% CHAPS 0.2%carrier ampholytes 0.0002%bromophenol blue ddH2O Amount 4.1ml of 8.5 stock or 2.1g urea in 3ml H2O 760mg 50ul of 200mM TBP stock 200mg See table 10ul of 0.1% stock To 5ml
增加样品溶解性的手段
变性剂: 变性剂:通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸 展,将其疏水中心完全暴露,降低接近疏水残基的能 量域。其典型代表是尿素和硫尿。 表面活性剂: 表面活性剂:经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基 团后,还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。 常用的表面活性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂 Triton X-100和NP-40、两性离子去污剂CHAPS、OBG 等。其中CHAPS和SB3-10最好。 还原剂: 还原剂:在变性剂和表面活性剂联用条件下,加用还 原剂可使已变性的蛋白质展开更完全,溶解更彻底。 常用含自由巯基的DTT或β-巯基乙醇,以及不带电荷 的三丁基膦(TBP)进行还原。
Applications of proteomics
• Protein identification/characterization • Protein-protein interaction • Post-translational modifications • Subcellular location • Elucidation of pathway • Target validation and toxicology • Drug discovery
IPG胶条的重泡胀 IPG胶条的重泡胀
泡胀的实质:是让样品能完全以可溶性的形 式进入IPG内,从而能进行接下来的IEF。 不同的加样方法和加样量会导致最终结果的 差异: Protean IEF cell、IPGphor等集成设备的使用: 20mmol/L DTT 垫片的使用: 温度的选择:
蛋白载样量
Suggested Bio-lyte ampholyte composition for IPG use IPG pH Range 3-10 4-7 3-6 5-8 7-10
Bio-Lyte Ampholyte (stock) range Bio-Lyte Ampholyte (stock) Conc.(w/v) Sample Solution Volume Per 5ml Sample Solution Volume Per 50ml
起载体作用的两性电解质: 起载体作用的两性电解质:即便在变性剂和表 面活性剂存在的情况下,某些蛋白质也需要在 盐离子的作用下才能保持其处于溶解状态,否 则这些蛋白质在其处于PI点时会发生沉淀。 Carrier ampholytes的作用在于捕获样品中的少 量盐分,从而保证蛋白质的溶解性。应用时, 两性电解质的浓度应小于0.2%(w/v)。浓度过 高会使IEF的速度降低。另外,为了保证实验 的精确性,在选择不同pH范围的IPG胶条时, 也应使两性电解质的pH值与之相符合。
不同样品的基本处理方法
可溶性样品 固体组织样品 细胞 样品的分级处理 通过采用亚细胞分级、液相电泳和选择性沉淀等方法 对蛋白质样品进行分级处理,可降低样品的复杂性并 富集低丰度蛋白质。当前最简单有效的处理是采用分 级抽提,按样品溶解度不同进行分离。
样品的溶解
是2-DE成功分离蛋白质的最关键因素之一。 溶解的目标:1、样品中非共价结合的蛋白质 、 复合物和聚积体完全破坏,从而形成各个多肽 的溶解液(否则样品中结合牢固的蛋白复合物 可能使2-DE中出现新的蛋白点,相应的表示单 个多肽的点的强度会下降);2、溶解方法必 、 须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和 核酸等物质的去除;3、溶解方法要保证样品 、 在电泳过程中保持溶解状态。
特殊样品的制备
低丰度蛋白的分离: 低丰度蛋白的分离 : 尽管增加上样 量和提高总蛋白的溶解度能增加分离时的 低丰度蛋白的量,但同时增加了高丰度蛋 白的负荷,且造成蛋白的叠加效应而影响 分离。现常用预分级+窄pH胶的微制备 技术进行分离:即将总蛋白组分成蛋白质 组亚群,再用pH梯度小于2个pH单位的 IPG胶进行窄pH范围的分离。
样品中核酸的去除
对电泳的影响: 对电泳的影响:增加样品粘度、与蛋白 质形成复合物后会出现假象迁移和条纹。 解决方法:用适量纯的不含蛋白酶的核 酸内切酶进行降解,或是利用合成载体 两性电解质(SCA)同核酸结合形成复 合物的能力,再通过超速离心来去除复 合物。
亚蛋白质组样品的制备
用超离心技术分离出细胞器、质膜和细胞核等成分, 再用适当的蛋白质溶解液进行溶解。其优点是不仅大 大减少样品的复杂性,而且可对分离的蛋白质进行亚 细胞定位。但该法需要专业仪器,有时会出现假阳性。 顺序抽提法: 顺序抽提法:根据细胞蛋白溶解性的差异,用具有 不同溶解能力的蛋白溶解液进行抽提的方法。 第一步:用Tris碱溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白; 第二步:把未溶解的pellet用标准IEF样品液溶解提取 高疏水性蛋白; 第三步:用含复合表面活性剂的蛋白溶解液,最后抽 提前两次抽提后不能溶解的膜蛋白约占整个样品的 11%(W/W)。
蛋白质组分析的首要要求
将来自于全细胞、组织或生物体中所包 含的多达几千种混合蛋白质进行分离、 检测和分析 。 2-DE技术依然是大多数蛋白质组研究中 分离复杂蛋白质混合物的首选技术 。
生物学问题 的提出
实验模型 的设计 感兴趣 蛋白点 的切取
实验组和对照组 样品的制备
蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离 和 蛋白样品的 电泳分离 图像扫描和初步分析
转印至膜上的蛋白
双向电泳分析中的样品制备
制备原则: 制备原则:
应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态( 应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态(包括 多数疏水性蛋白),且制备方法应具有可重现性。 ),且制备方法应具有可重现性 多数疏水性蛋白),且制备方法应具有可重现性。 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。 防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰 如酶性或化学性降解等)。 (如酶性或化学性降解等)。 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白, 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白,从而保证 待研究蛋白的可检测性。 待研究蛋白的可检测性。
样品液的准备
标准液:
Reagent 8M urea 50mM DTT or 2mM TBP 4% CHAPS 0.2%carrier ampholytes 0.0002%bromophenol blue ddH2O Amount 47ml of 8.5 stock or 24g urea in 25ml H2O 385mg or 500ul of 200mM TBP stock 2g See next table 100ul of 0.1% stock To 50ml
3/10 4/6 5/7 3/5 4/6 5/8 7/9 8/10
40% 40% 40% 40% 40% 40% 40% 20%
25µl 12.5 µ l 12.5 µ l 25 µ l 12. µ l 25 µ l 12.5 µ l 25 µ l
250 µ l 125 µ l 125 µ l 250 µ l 125 µ l 250 µ l 125 µ l 250 µ l
IPG IEF 中pH梯度的选择 pH梯度的选择
双向电泳的 技术流程和样品制备
史须 北京大学人类疾病基因研究中心
基因组学与蛋白质组学
基因组学: 蛋白质组学:可视为分子生物学的大规模筛选 技术,目的在于归类细胞中的蛋白质的整体分 布,鉴定并分析感兴趣的个别蛋白,最终阐明 它们的关系与功能。 上述两种学科的研究内容在互补的水平上研究 了细胞的分子架构,又都在各自的水平上提供 了增强对方效应的信息,因此二者存在有很强 的且带有系统性相互关系。