Western Blot(免疫印迹法)
westernblot详细图解
westernblot详细图解Western免疫印迹（WesternBlot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
实验材料蛋白质样品试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒实验步骤一、试剂准备1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。
2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。
3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。
4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O至1000 ml。
5. 膜染色液：考马斯亮兰0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。
蛋白免疫印迹法Westernblot原理及步骤
SDS-PAGE原理
SDS-PAGE ：是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理 液,SDS是1种很强的阴离子表面活性剂,它可以断开分子内和分子间的氢 键,破坏蛋白质分子的二级和三级结构. 强还原剂巯基乙醇等可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构.使蛋白质分 子被解聚成肽链形成单链分子.解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电 荷的蛋白质-SDS复合物 蛋白质分子结合SDS阴离子后,所带负电荷的量远远超过了它原有的净电 荷,从而消除了不同种蛋白质之间所带净电荷的差异.蛋白质的电泳迁移 率主要决定于亚基的相对分子质量,而与其所带电荷的性质无关.
❖ 2,电泳
向电解槽中加入适量的Running Buffer,将蛋白样品以50ug的标准 换算出的体积进行上样.以电压120V或160V进行电泳,电泳至前沿跑至 最底端即可进行转膜.
转膜
用硝酸纤维素膜NC膜,进行转膜.组装转膜三明治的过程在 Transfer buffer中进行：黑的1面在下,依次放上滤纸、凝胶、NC膜、滤 纸,然后合上三明治.整个过程必须保证无气泡.接着把转膜三明治放入转 膜槽中,注意正负极放置正确.倒入适量的Transfer buffer.在冰浴中进行 转膜.转膜条件：120V,1.5h或者150V,1h
ห้องสมุดไป่ตู้ SDS-PAGE:
❖ 1,灌胶：
❖ 1保证玻璃板干燥洁净,玻璃板对齐后放入夹中卡紧,垂直卡在架子上 准备灌胶.
❖ 2配好分离胶,加入TEMED,混匀后即可灌胶.灌胶过程中胶要沿着玻 璃板流下,防止有气泡产生.将胶灌至接近绿带中线即可.
❖ 3用去离子水进行液封,胶凝速度会更快加水时速度要慢,防止胶被冲 变形
匀.于冰上裂解20min.
❖ 3,14000r,10min离心.上清液即为所需蛋白样品液. ❖ 4,用Bradford蛋白分析法测蛋白浓度. ❖ 5,按100ul裂解液加30ul的6X的loading buffer 的比例,向蛋白样品液中填
免疫印迹法
电泳2小时
转印结果的检查：电泳结束后，用丽春红对NC膜预染下，观察转移 效果。随后用水冲洗掉丽春红的颜色，进行封闭。
3、酶免疫定位
封闭：将上述得到的NC膜，用封闭液在摇床上过夜封闭。为了防止免
疫试剂的非特异性吸附。
清洗：封闭时间达到后用PBST清洗NC膜3次左右，每次约15分钟。 一抗孵育：清洗好后，加入一抗标记2小时左右。一抗一般选择源于兔
色法中最常用的底物，可以和HRP作用形
成褐色不溶性产物。反应速度快，灵敏性 较高，特异性好。但是显色后光照数小时
会褪色不易保存。
DAB显色液的配方： 9ml的0.01mol/L Tris-Cl(pH7.6) 1ml的0.3%的CoCl2 DAB少许 10ul的H2O2
2.化学发光显色法(ECL法)
免疫印迹法
商宇伟
定义
免疫印迹法（immunobiotting test，IBT） 也被称作酶联免疫电转移印斑法（enzyme linked immunoeletrotransfer blot，EITB），是 20世纪70年代末，发展起来的一门蛋白质多参 数检测技术。由于其与早先建立的核酸印迹法 southern blot相类似，所以习惯上又叫westernblot。
特点：HRP能激发化学发光显色底物发光，通过对X线胶片的曝 光，显影定影从而达到显色的目的。灵敏性很高且比较安全。
发光底物的配制： 2ml的A液+2ml的B液+6ml的SW。 摇床上与NC膜避光孵育5分钟。
总结
SDS-PAGE电泳分离蛋白 转膜
过夜封闭 PBST洗3次，每次15分钟 一抗孵育2小时 PBST洗3次，每次15分钟 酶标二抗孵育1小时 PBST洗3次，每次15分钟 DAB显色底物显色法显色 ECL显色法
westernblot法
Western blot，也称为蛋白质印迹或免疫印迹，是一种常用的生物化学技术，用于分析样品中特定蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。
下面是Western blot的基本步骤和注意事项：一、实验步骤蛋白样品制备：从细胞或组织中提取蛋白质样品，常用的方法有细胞裂解、组织匀浆等。
蛋白定量：使用BCA蛋白浓度测定法等对蛋白质样品进行定量，以便后续的Western blot分析。
凝胶电泳：将蛋白质样品在聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，根据蛋白质的大小和电荷进行分离。
转膜：将电泳分离后的蛋白质样品转移到硝酸纤维素膜上，以便进行后续的免疫检测。
免疫检测：使用特异性抗体对转移后的蛋白质样品进行免疫检测，抗体与目标蛋白质结合后，通过显色反应呈现阳性结果。
数据分析：对免疫检测结果进行定量和定性分析，如条带大小、灰度值等。
二、注意事项实验前要充分了解实验原理和操作流程，确保实验的正确性和可行性。
蛋白样品制备过程中要保证细胞或组织充分裂解和匀浆，以获得更纯的蛋白质样品。
在进行Western blot分析前，要对蛋白质样品进行定量，以保证实验结果的准确性。
在转膜过程中，要选择合适的转移缓冲液和转移时间，以保证蛋白质样品的完整转移。
在免疫检测过程中，要选择合适的抗体和显色试剂，以保证免疫检测结果的特异性。
在数据分析过程中，要选择合适的分析方法和软件，以保证数据分析的准确性和可靠性。
总之，Western blot是一种常用的生物化学技术，在蛋白质分析领域具有广泛的应用价值。
在进行Western blot实验时，要严格遵守实验步骤和注意事项，以保证实验结果的准确性和可靠性。
WesternBlot蛋白免疫印迹法
3 Western blot3.1试剂配制1）30%聚丙烯酰胺储备液（Acr/Bis）：丙烯酰胺（Acr）, 29g；N,N-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）, 1g,去离子水溶解，37℃ 水浴助溶，定容至100mL。
0.45M m滤器过滤，棕色瓶4℃避光保存。
2）10%十二烷基硫酸钠（5口5）：SDS，10g；H2O，80mL。
68℃加热溶解，浓HCl 调pH 至7.2，定容至100mL，室温保存。
3）10%过硫酸铵（AP）：AP，1g；H2O，10mL。
避光，4℃保存。
（4℃2 周）4）分离胶缓冲液（1.5MTris-HCl pH8.8）：Tris，18.17g；H2O 80mL。
用浓HCl 调pH 至8.8，定容至100mL，4℃保存。
5）浓缩胶缓冲液（1.0MTris-HCl pH6.8）：Tris，12.11g；H2O 80mL。
用浓HCl 调pH 至 6.8，定容至100mL，4℃保存。
6）电泳缓冲液（10X）：甘氨酸（Glycine），188g；Tris 30.2g；SDS，10g；H2O, 800mL。
调节pH 至8.3, 定容至1L，4℃保存（用时稀释为1义）。
7）5X SDS-PAGEloadingBuffer （5mL）：1MTris-HCl（pH6.8），1.25mL；SDS，0.5g；澳酚蓝（BPB），25mg；甘油，2.5mL；加去离子水定容至5mL。
充分混匀，分装成500M L/份，室温保存。
使用前每份加入25M L p -巯基乙醇（2-ME），加入2-ME的loading buffer可在室温下保存一个月左右。
8）考马斯亮蓝染色固定液：40%双蒸水，10%醋酸,50%甲醇，室温保存9）考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝R-250，250mg；甲醇，45ml；冰醋酸，10ml；H2O，定容至100ml。
室温保存。
10）考马斯亮蓝染色脱色液：醋酸，100ml；乙醇，50ml；dH2O 850ml，充分混合，室温保存11）膜转移缓冲液：甘氨酸，2.9g；Tris，5.8g；SDS，0.37g；力口H2O 600mL 充分溶解，加200mL 甲醇，混匀，定容至1匕，室温保存。
Western-blot法
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免疫印迹法免疫印迹法（immunoblotting test，IBT）亦称酶联免疫电转移印斑法（enzyme linked immunoelectrotransfer blot，EITB），因与Southen早先建立的检测核酸的印迹方法Southen blot相类似，亦被称为Western blot。
免疫印迹（western blotting）是在蛋白质电泳分离和抗原抗体检测的基础上发展起来一项检测蛋白质的技术。
它将SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨力与抗原抗体反应的特异性相结合。
典型的印迹实验包括三个步骤①蛋白质的电泳分离；②将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上，用非特异性，非反应活性分子封闭固体膜上未吸附蛋白质区域；③免疫学检测。
免疫印迹克服了聚丙烯酰胺凝胶电泳后直接在凝胶上进行免疫学分析的弊端，极大地提高了其利用率、分辨率和灵敏度，使其成为使用最广泛的免疫化学方法之一。
图1 免疫印迹法原理示意图第一阶段为SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。
抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰膪凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。
此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。
第二阶段为电转移。
将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压（100V）和大电流（1～2A），通电45min转移即可完成。
此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。
第三阶段为酶免疫定位。
将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。
常用的HRP底物为3，3，—二氨基联苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈蓝紫色）。
阳性反应的条带清晰可辨，并可根据SDS-PAGE时加人的分子量标准，确定各组分的分子量。
western blot protocol
Western Blot protocolSDS-PAGE：SDS-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis【原理】Western Blot又称免疫印迹，是指将蛋白样品转移到固相载体上，而后利用相应的抗体来检测目的蛋白的一种方法。
是检测混合样品中单一特定蛋白的常用技术。
Western Blot间接法基本原理：首先利用SDS-PAGE对蛋白质样品进行分离，然后转移到固相载体（例如PVDF膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
转移后的PVDF膜就称为一个印迹（blot）,用于对蛋白质的进一步检测。
印迹首先用蛋白溶液（如5%的BSA 或脱脂奶粉溶液）处理以封闭PVDF膜上剩余的疏水结合位点，而后用所要研究的蛋白质的抗体（一抗）处理，印迹中只有待研究的蛋白质与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，而其它的蛋白质不能与一抗结合，这样清洗除去未结合的一抗后，印迹中只有待研究的蛋白质的位置上结合着一抗。
处理过的印迹进一步用适当标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠IgG的抗体。
处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。
目前有结合各种标记物的抗特定IgG 的抗体可以直接购买作为二抗，最常用的一种是酶连的二抗，印迹用酶连二抗处理后，再用适当的底物溶液处理，当酶催化底物生成有颜色的产物时，就会产生可见的区带，指示所要研究的蛋白质位置。
该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。
在Western Blot实验中，还有另一种方法，就是直接标记一抗，再用底物显色，这种方法叫直接法。
与用二抗的间接法相比有诸多不足，标记二抗可用于很多种不同特异性的一抗，避免了标记很多一抗的需要，同时因为一抗结合不止一个二抗分子，所以二抗可以增强信号。
所以一般情况下都釆用间接法进行检测。
【实验耗材】•PVDF膜[MILLIPORE (IPVH00010)]•NC膜•滤纸[BIO-RAD (1703967)]【实验仪器】•PowerPac Basic电泳仪[BIO-RAD (041BR89156)]•Trans-Blot Turbo System 半干转转膜仪[BIO-RAD (690BR006827)]自制胶通常使用Bio-rad半干转转膜仪•iBlot Dry Blotting System 干转转膜仪[Invitrogen (25-0912)]需用Invitrogen 预制转印包•Chemi Doc XRS+显影仪[BIO-RAD (721BR04128)]【试剂】••5×量取100mL of 5×电泳液至500mL量筒中，加超纯水至500mL刻度线，配好后的电泳液在1个月内使用。
western blot 免疫印迹方法
Western blot一、S DS-聚丙烯凝胶电泳二、转膜1.准备好转膜用的物品：转膜夹、剪刀、镊子、纤维素膜、滤纸，盘子，盒子，玻璃棒，甲醇，转膜液（不加SDS，有气泡）2.将滤纸侵泡于盘中的转膜液，赶走气泡，将膜剪去一角做标记，侵泡于甲醇中，根据黑胶白膜原则叠好，保证无气泡后夹紧放入电泳槽中，黑对黑原则放入电泳槽，槽内放入冰袋，盖好电泳槽盖。
3.于冰上或者冰箱中低温转膜，恒流300mA，50min三、封闭（正面朝上）TBS洗5min配5%脱脂奶粉-TBS摇几分钟4℃过夜。
四、加一抗，倒去封闭液，用TBS冲洗一次，TBST 5min×3次（大概10ml），加入用2.5%脱脂奶粉-TBST稀释的一抗（1：10），室温摇2h五、加二抗：倒去一抗或回收（TBST,5mi n×3次）用2.5%脱脂奶粉-TBST按2000:1稀释二抗（鼠抗人IgE抗体），室温摇2h（有的已经与HRP结合的，如若没有，后面加HRP），TBST洗5mi n×3次，然后TBS洗5mi n×3。
六、化学发光，显影，定影（1）将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合；1min后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触；1min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X-光片夹中。
（2）在暗室中，将1×显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出X－光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1cm）；打开X-光片夹，把X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min或5min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。
显影时间一般为1～2min（20～25℃），温度过低时（低于16℃）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把X-光片浸入定影液中，定影时间一般为5～10min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。
Western印迹法
Western印迹法Western 印迹法Western印迹法又称为免疫印迹（immunoblot）。
是用特异性抗体鉴定已被分离并转移到一种膜上的蛋白质混合物中的特殊抗原的方法。
即针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测的方法。
Western Blot 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE电泳分离的蛋白质样品，转移到固相载体上（固相载体以非共价键吸附蛋白质，并能保持其类型和生物学活性的不变）。
二、基本原理当蛋白质经高分辨率的SDS-PAGE电泳后，可被分离成许多不同的蛋白质区带，由于蛋白质的各个组分被固定于凝胶的网状结构中，可以将电泳后的蛋白带经电转移技术，转移到固相的硝酸纤维素膜上，再和特异性的抗体结合，经直接或间接抗原-抗体反应显示特异性的阳性条带。
Western印迹法分三个阶段进行第一阶段为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。
蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度越快。
此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。
第二阶段为电转移。
将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压转移即可完成。
此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。
第三阶段为酶免疫定位。
将印有蛋白条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体（一抗）和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色，阳性反应的条带清晰可辨。
三、操作步骤一）配制SDS-PAG 灌胶:分离胶浓缩胶二）上样蛋白质样品的制备直接用电泳加样缓冲液裂解细胞制备细胞蛋白质提取液三）SDS-PAGESDS-蛋白质复合物的电泳迁移率只与其分子量有关。
在一定条件下，迁移率与分子量呈对数线性关系。
丙烯酰胺凝胶对蛋白质的分辨范围丙烯酰胺（%[w/v]）分离范围（kDa）15 15~4512.5 15~6010 18~757.5 30~1205 60~212（四）蛋白质的电转移打开蛋白质转移槽的胶板，依次放入：海绵、两张滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜、再两张滤纸、海绵（以上所有的材料都需缓冲液浸湿，凝胶也必须保持湿润），合上转移槽的胶板，放入转移槽中，凝胶在负极一侧，倒入转移缓冲液，电泳。
western blot 原理
western blot 原理
Western blot（也称为蛋白免疫印迹）是一种常用的实验技术，用于检测和定量分析蛋白质的存在和表达水平。
它通过将蛋白质分子分离并转移到固体支持上，再利用特异性抗体与目标蛋白质结合，从而实现对蛋白质的检测和定量。
Western blot的步骤主要包括样品制备、蛋白质分离、电泳、
膜转移、阻断、抗体结合和检测。
首先，待检样本中的蛋白质需要经过裂解和提取，以便得到总蛋白质。
然后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）或其他电泳方法，将蛋白质按照大小
分离成不同的带。
接下来，将分离的蛋白质转移到聚合物（通常为聚偏二氟乙烯）膜上。
这一步骤通常使用电泳转移系统来实现，通过施加电流，蛋白质从凝胶中转移到膜上。
转移完成后，需要用一种液体（如牛血清白蛋白）来阻断膜上未被结合的位点，以减少非特异性结合。
阻断完成后，将抗体溶液加入到膜中，与目标蛋白质结合。
抗体通常是根据蛋白质的特异性来选择的，可以识别并结合目标蛋白质。
常用的抗体有一抗和二抗，其中一抗直接与目标蛋白质结合，而二抗则与一抗结合。
最后，使用染色剂、放射性标记物或荧光标记物等方法来检测膜上与抗体结合的蛋白质。
这些标记物会与抗体结合并发出可观察的信号，常见的标记物有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP），可以通过化学反应来产生显色。
检测的结果
可以通过成像设备或暴露片来观察和记录。
通过Western blot技术，我们可以了解特定蛋白质在样品中的存在、相对表达水平的变化以及蛋白质的分子量。
它在生物医学研究、药物开发和临床诊断等领域具有广泛的应用。
完整版WesternBlot免疫印迹法实验方法步骤
Western Blot(免疫印迹法)实验方法步骤发布日期:2008-8-25 热门指数:4360Western Blot(免疫印迹法)主要包括以下4个基本步骤：n 样品制备n 电泳分离n 蛋白的膜转移n 免疫杂交与显色――蛋白检测溶液和试剂n 1X 磷酸盐缓冲液(PBS)n Modified RIPA bufferTris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;PMSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mMn 1X SDS 样品缓冲液62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 于25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT, 0.01% w/v溴酚蓝n 转移缓冲液25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇(pH 8.3)n 10X Tris缓冲盐(TBS)准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl调pH为7.6n 脱脂奶粉或BSAn 甲醇n TBS/T缓冲液1X TBS, 0.1% Tween-20）TBS/T封闭缓冲液（n1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSAn 一抗的稀释1X TBS, 0.1% Tween-20 加5% BSA (多抗)或5%脱脂奶粉(单抗)Note: 一般来说, BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。
抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。
n 预染的蛋白质Marker，可用于监测转膜的效率样品制备原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。
westernblot原理
westernblot原理Western blot原理。
Western blot，又称免疫印迹，是一种用于检测特定蛋白质的技术。
它是通过将待检样品中的蛋白质分离、转移至膜上，然后使用特异性抗体结合目标蛋白质，最终通过化学发光或染色的方法来检测目标蛋白质的存在与否。
Western blot技术在生物医学研究中得到广泛应用，尤其在分子生物学、免疫学和生物化学领域。
首先，进行Western blot实验需要进行蛋白质的分离。
通常采用SDS-PAGE凝胶电泳技术，将待检样品中的蛋白质按照大小分离开来。
SDS-PAGE凝胶电泳是一种将蛋白质按照大小进行分离的技术，其原理是利用SDS对蛋白质进行线性化处理，使得蛋白质获得了相同的电荷密度，然后根据其大小在凝胶中进行分离。
分离后的蛋白质将会转移到膜上，以便后续的抗体结合。
其次，蛋白质的转移是Western blot技术中的关键步骤。
通过将SDS-PAGE凝胶中分离的蛋白质转移到膜上，可以使得蛋白质更易于与抗体结合。
通常使用半湿法或全湿法进行蛋白质的转移，这些方法能够确保蛋白质均匀地转移到膜上，并且保持其在凝胶中的空间结构。
蛋白质转移后，膜上的蛋白质将会与特异性抗体结合。
最后，Western blot的结果可以通过化学发光或染色的方法来检测。
在化学发光法中，膜上的蛋白质与特异性抗体结合后，可以加入辅助试剂使得蛋白质发出化学发光信号，通过光学设备来检测信号的强度从而确定蛋白质的表达水平。
而在染色法中，膜上的蛋白质与特异性抗体结合后，可以使用染色剂将蛋白质标记出来，然后通过凝胶成像系统来观察蛋白质的表达情况。
总之，Western blot技术是一种重要的蛋白质检测方法，其原理简单清晰，操作相对容易。
通过将待检样品中的蛋白质分离、转移至膜上，然后使用特异性抗体结合目标蛋白质，最终通过化学发光或染色的方法来检测目标蛋白质的存在与否。
在生物医学研究中，Western blot技术的应用将会继续发挥重要作用，为科学研究和临床诊断提供帮助。
免疫印迹法
免疫印迹法免疫印迹法（immunobiotting test，IBT）亦称酶联免疫电转移印斑法（enzyme linked immunoelectrotransfer blot，EITB），因与Southern早先建立的检测核酸的印迹方法 Southern blot 相类似，亦被称为Western-blot。
免疫印迹法分三个阶段进行。
第一阶段为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。
此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。
第二阶段为电转移：将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压（100V）和大电流（1～2A），通电45min 转移即可完成。
此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。
第三阶段为酶免疫定位：将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。
常用的HRP底物为3，3’-二氨基联苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈蓝紫色）。
阳性反应的条带清晰可辨，并可根据SDS-PAGE时加入的分子量标准，确定各组分的分子量。
本法综合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性，是一个有效的分析手段，不仅广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性，并可用于疾病的诊断。
在艾滋病病毒感染中此法作为确诊试验。
抗原经电泳转移在硝酸纤维素膜上后，将膜切成小条，配合酶标抗体及显色底物制成的试剂盒，可方便地在实验室中供检测用。
根据出现显色线条的位置可判断有无针对病毒的特异性抗体。
一． SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）基本原理是聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体acr聚合成长链并通过双功能化合物甲叉双丙烯酰胺Bis交联而成的三维网状结构凝胶。
聚丙烯酰胺凝胶的机械性、弹性、透明度、粘着度取决于凝胶的总浓度，总浓度越大，平均孔径越小，机械强度越强。
蛋白免疫印迹技术(WesternBlot)介绍
• 上样
SDS-PAGE电泳
Staking gel Separating gel
转膜
• 膜的选择 最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸纤维素
（Nitrocellulose，NC）膜和聚偏二氟乙烯 （Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋 白印迹。 • 孔径
蛋白免疫印迹技术介绍
主要内容
• Western Blot原理 • Western Blot特点及应用 • Western Blot一般流程 • Western Blot常见问原理
• 混合样品经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后分离，凝胶 中的蛋
一抗、二抗孵育
• 抗体选择 • 抗体稀释液 • 孵育条件 • 漂洗
显色
显色
• 化学发光检测
• 荧光法
显色
GE AI800凝胶成像系统
Western Blot 常见问题
• 样品制备 样本保存 蛋白酶抑制剂
• 抗体 正规厂家，有示例图 抗体保存 一抗二抗匹配 内参和对照
Western Blot 常见问题
法（Folin-酚试剂法）、 BCA法等。但各有优 缺点，大家可以根据具体情况选取。按相应 蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品 浓度
SDS-PAGE电泳
• SDS-PAGE 是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液， SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的 氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。
Western Blot 应用
• 从混合蛋白样品中检测目的蛋白 • 目的蛋白的组织定位 • 目的蛋白的表达量分析 • 目的蛋白与其他大分子间相互作用
Western blot 实验技术
二抗与底物反应显色•辣根过氧 Nhomakorabea物酶法（HRP） •碱性磷酸酶法（AP） •化学发光显色法
朱珊丽老师的结果
1 2 3 4 M Mr 1 2 3 4
Fig 1.SDS-PAGE and Western blot analysis for the CT-MOMP multi-epitopes protein
达到最佳程度时，立即用三蒸水洗涤终止反应
转膜
硝酸纤 维素膜
价格便宜
简单快速封闭非特异性抗体结合
膜的选择
封闭非特异性抗体结合麻烦
尼龙膜 价格昂贵
需要更高的蛋白结合率
（尼龙膜： 480µg/cm2 ；硝酸纤维素膜：80µg/cm2 ）
特殊要求下的选择 目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱
需要更大的机械强度
三、免疫染色 1．转移后的NC膜于5%脱脂奶粉中封闭，4℃过夜。 2．TBS洗膜1-2次，10min/次。 3. 加一抗孵育，37 ℃或室温孵育1h。 4. TBS洗3次，10min/次。 5．加HRP标记的抗体，室温1h 。 6．TBS洗3次，10min/次。 7．NC膜再转入DAB显色液中，避光反应，待显色反应
Western Blot基本原理
在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种 固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。
Western Blot一般流程
蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺
凝胶电泳
转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色
【器材】
转移电泳仪 ，硝酸纤维素膜，滤纸，剪刀， 手套
【试剂】
1．一抗 2．二抗：HRP标记的IgG 抗体 3．转移buffer：Tris 3.03g，Gly14.4g，甲醇200ml，加
蛋白质免疫印迹实验WesternBlot
摇动，待所检测的蛋白带显色达到最深程度后，将硝 酸纤维素薄膜转入 PBS 溶液中停止显色反应。取出 硝酸纤维素薄膜，自然晾干后拍照保存结果。
四 思考题
• 1. 为什么裁剪的滤纸必须与凝胶大小 完全一致？若不是这样结果会怎样？
• 2. 电转移时为什么都必须带手套小心 操作并除去气泡， 否则结果会怎样？
• 在进色后应时应注意哪些问题？ • 请简述免疫印迹实验的原理，并将之与
免疫学相关概念联系起来。
2024/2/11
2024/2/11
一 实验原理
• 电泳将蛋白质从凝胶转移到固体支持物 上是通过电转移仪器完成的。它是将固 体支持物面对阳极、凝胶面对阴极，二 者结合在一起，然后将外面二侧用 Whatman 3MM滤纸结合，形成“三明治 ”结构，放入电转移仪器上，加入电泳 缓冲液，通上电源后，蛋白质即可从凝 胶上转移到固体支持物上。
2024/2/11
一 实验原理
其定量关系符合以下公式： • Ve=Vo+KV1 • Ve：某一溶质的洗脱体积 • Vo：层析柱的外水体积 • Vi：层析柱的内水体积 • K：某一溶质的分配系数
2024/2/11
二试剂和器材
1．试剂
电转移缓冲液 pH8.3 • 39mM甘氨酸 • 4.8mM Tris碱 • 0.037% SDS • 20% 甲醇 • 混合2.9克甘氨酸，5.8克Tris,0.37克SDS,加200ml甲2源自24/2/11三 操作步骤
蛋白质印迹法（免疫印迹试验，WesternBlot）
蛋⽩质印迹法（免疫印迹试验，WesternBlot）蛋⽩质印迹法（免疫印迹试验）即 Western Blot。
它是分⼦⽣物学、⽣物化学和免疫遗传学中常⽤的⼀种实验⽅法。
其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或⽣物组织样品进⾏着⾊。
通过分析着⾊的位置和着⾊深度获得特定蛋⽩质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。
蛋⽩免疫印迹（Western Blot）是将电泳分离后的细胞或组织中蛋⽩质从凝胶转移到固相⽀持物NC膜或PVDF膜上，然后⽤特异性抗体检测某特定抗原的⼀种蛋⽩质检测技术，现已⼴泛应⽤于基因在蛋⽩⽔平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个⽅⾯。
⼀提起Western blot，⼤家会不禁联想到Southern blot和Northern blot。
其实它们的名字也是个有趣的故事。
1975年，Edwin Southern教授发明了DNA杂交检测技术，故命名为Southern blot。
之后，James Alwine、David Kemp和George Stark三位教授⼜发明了RNA杂交检测技术，因与Southern blot相似，故命名为Northern。
George Stark这位⽜⼈教授在两年后⼜开发出类似的蛋⽩质检测⽅法。
1981年，Neal Burnette将其命名为Western blot。
为什么当时没叫Eastern blot呢？这⽆从考证，不过科学家们还真是挺有创意的。
30年来， Western blot技术已成为蛋⽩质研究中最常⽤的⼯具。
它的标准流程如下：蛋⽩质⾸先通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再通过电泳转移到固相⽀持物上，固相⽀持物包括硝酸纤维素膜、PVDF膜和尼龙膜。
⾸先将膜上未反应的位点封闭起来，以抑制抗体的⾮特异性吸附，这样固定的蛋⽩质即可与特异性的多克隆或单克隆抗体相互作⽤。
最后通过放射、⽣⾊或化学发光的⽅法进⾏定位。
Western Blot原理与Northern Blot、Southern blot类似。
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Western Blot(免疫印迹法)
主要包括以下4个基本步骤：
⏹样品制备
⏹电泳分离
⏹蛋白的膜转移
⏹免疫杂交与显色――蛋白检测
溶液和试剂
⏹1X 磷酸盐缓冲液(PBS)
⏹Modified RIPA buffer
Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;PMSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1
microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mM
⏹1X SDS 样品缓冲液
62.5 mMTris-HCl (pH 6.8 于25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT,
0.01% w/v溴酚蓝
⏹转移缓冲液
25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇(pH 8.3)
⏹10X Tris缓冲盐(TBS)
准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl调pH为7.6
⏹脱脂奶粉或BSA
⏹甲醇
⏹TBS/T缓冲液
1X TBS, 0.1% Tween-20
⏹封闭缓冲液（TBS/T）
1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSA
⏹一抗的稀释
1X TBS, 0.1% Tween-20 加5% BSA (多抗)或5%脱脂奶粉(单抗)
Note:一般来说, BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。
抗体的稀释度参考抗体说明书或根据
实验确定。
⏹预染的蛋白质Marker，可用于监测转膜的效率
样品制备
原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。
1．培养细胞或药物处理。
2．弃培养基，用1X PBS漂洗细胞2次，去尽残留培养基。
3．加入1X SDS样品缓冲液(6-well plate, 100 µl /w或75 cm2 plate, 500-1000 µl/瓶)，刮落细胞，转移到Ep管。
注意：冰上操作。
4．超声10~15秒剪切DNA以减低样品粘性。
5．煮沸样品5 minutes。
6．离心12000g, 5 min，取上清。
7．电泳分离：上样15µl~20 µl 至SDS-PAGE 胶(10 cm x 10 cm)电泳。
如要定量检测某蛋白的表达水平，应用RIPA裂解液(1 ml per 107 cells/100
mm dish/150 cm2 flask)裂解细胞，收集裂解液至离心管中，在振荡器上混
匀4～15min，14000g离心15min（4℃），弃沉淀，用Bradford法或其它
蛋白质测定方法测定上清中蛋白浓度以调整上样体积和上样量，进行
Western杂交时还需设臵内或外参照，通常用beta-actin。
注意：一般上样20~30 µg已足够，如待检蛋白为低丰度蛋白，可加大上样量至100µg，但电泳条带易拖尾，可制备亚细胞组份或采用更敏感的检测方法。
电泳分离（参照SDS-PAGE电泳方法）
转膜
杂交膜的选择是决定Western blot成败的重要环节。
应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。
用于Western blot的膜主要有两种：硝酸纤维素膜(NC) 和PVDF膜。
NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。
根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的NC膜。
因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。
通常用0.45µm和0.2µm两种规格的NC膜。
大于20kD的蛋白可用0.45µm的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2µm的膜了，如用0.45µm的膜就会发生“Blowthrough”的现象。
PVDF膜灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。
但PVDF膜在使用之前必需用纯甲醇浸泡饱和1-5秒钟。
蛋白质常用的转移方法主要有两种：槽式湿转和半干转移。
前者操作容易，转移效率高；而后者适用于大胶的蛋白转移，所用缓冲液少。
以下为槽式湿转的操作步骤。
1.将胶浸于转移缓冲液中平衡10min。
注意：如检测小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易扩散出胶。
2.依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入转移缓冲液中平衡10min。
如用
PVDF膜需用纯甲醇浸泡饱和3-5秒钟。
3.装配转移三明治：海绵→3层滤纸→胶→膜→3层滤纸→海绵，每层放好后，
用试管赶去气泡。
切记：胶放于负极面（黑色面）。
4.将转移槽臵于冰浴中，放入三明治（黑色面对黑色面），加转移缓冲液，
插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。
注意：应再次检查三明治和电极是否装配正确，电源是否接通。
5.转膜结束后，切断电源，取出杂交膜
white (+)black (-)
免疫杂交与显色
1．用25 ml TBS 洗膜5min，室温，摇动。
2．臵膜于25 ml 封闭缓冲液中1h, 室温，摇动。
3．15ml TBS/T洗3次（5 min/T）。
4．加入合适稀释度的一抗，室温孵育1-2h或4°C过夜，缓慢摇动。
5．15 ml TBS/T洗3次（5 min/T）。
6．加入合适稀释度的碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化酶（HRP）标记的二抗，室温孵育1h，缓慢摇动。
7．15 ml TBS/T洗3次（5 min/T）。
8．15 ml TBS洗1次。
9．蛋白检测(显色法或发光法，按相应试剂说明操作)。
注意事项：
1．操作中戴手套，不要用手触膜。
2．PVDF膜在甲醇中浸泡时间不要超过5秒。
3．如检测小于20kD的蛋白应用0.2µm的膜，并可省略转移时的平衡步骤。
4．某些抗原和抗体可被Tween-20洗脱，此时可用1.0% BSA代替Tween-20。
5．关于封闭剂的选择：5%脱脂奶/TBS or PBS: 能和某些抗原相互作用，掩盖抗体结合能力；0.3~3% BSA in PBS：低的内源性交叉反应性。
6．如用0. 1% Tween 20、0.02% NaN3 in PBS or TBS作封闭剂和抗体稀释液，抗体检测后可进行蛋白染色。
7．如要同时检测大分子量和小分子蛋白，最好用梯度胶分离蛋白。
PVDF膜上蛋白的可逆染色
Western杂交时，为确认蛋白是否转至PVDF膜上，可用下列方法对膜上蛋白进行可逆性染色。
1.氨基黑染色
染液：0.5% Amido Black (w/v), 25% isopropanol (v/v) and 10% acetic acid.
染色：将PVDF膜臵于染液中染色数钟，ddH2O 脱色。
2. 考马氏亮蓝染色
染液：0.1% Coomassie Brilliant Blue R-250 (w/v) and 50% methanol (v/v)
脱色液：40% methanol (v/v) with 10% acetic acid (v/v)
染色：将PVDF膜臵于染液中染色15 min.，脱色液脱色。
3．丽春红染色Ponceau S
染液：0.2% w/v Ponceau S in TCA (3% v/v)
染色：将PVDF膜臵于染液中染色5min
脱色：ddH2O 脱色
三、银染
PAGE胶上蛋白质的银染方法有数百种，其原理相似，具体步骤各不相同。
银染为蛋白质的非特异性染色，呈“爆炸性”反应模式，用于蛋白定量时准确性差，但其敏感度高、简便易行，仍被广泛应用。
下面列举的这三种方法为常用的双向电泳凝胶染色法，可与质谱兼容。
其中方法1敏感性最高，方法3背景最低、对比度好。
注意事项：
1.应严格按照操作步骤进行；
2.显色前最好更换新染色盘；
3.显色时变为黄色或棕色后立即弃去，更换新鲜显色液，一般来说染
一块胶应配制500ml染液。
更换2-3次；
4.市售甲醛的浓度为37%；
5.三种方法均与质谱兼容，Blum法敏感性高，但背景呈淡黄色，EMBL
法次之但背景较低，染色点较黑。
V orum相对不敏感，但背景清晰，
信噪比高。