禽流感抗原不同佐剂乳化制苗实验
禽流感(H9亚型)油乳剂灭活苗的研制
１ 疫 苗 安 全 性检 验 ． ５
动物实 验 。取 ６只 ４ ６ 龄鸡 ， 颈部皮下 接种 ～周 在 ０ ． ２毫升 制备 的油乳 剂灭 活 苗 ， 观察 ２ 天 ， 查 接种 １ 检 疫 苗 和鸡 的局 部及全 身反应 。
灭活 效果 检 查 。取 １ ０日龄 Ｓ Ｆ鸡 ６只 ， 只注 Ｐ 每
一
（ 石蜡 油 ） 吐 温 一 ０ 乳 化 剂 ， 要 为 聚 氧 已 稀失 和 ８（ 主
水 山梨醇脂 肪 酸脂 ） 。按 常规 方法 乳化 ， 成油 包水 制
型油乳 剂灭 活 疫苗 ， ４ ８Ｃ 置 ～ ￣保存 。
不 同接毒 量 对鸡 胚血 凝 活 性 的影 响 。为 了测 定 不 同接 毒量 对鸡 胚 繁殖病 毒 的影 响 ， 择 １ 、０３ 选 ０ １ － 、 ２ １ 一 １ 一 １ ｘ ０ 、０ 、 ０ ５个 滴度 。每胚接 种 ０２毫升 ， ． 收取接 毒 后 ４ ～ ６小时 死胚 的尿囊 液 ，测 定 红 细胞 凝集 效 ８９ 价 。另外 ， 以种 毒 １ ４ 释 液 ， 每 胚 ０１ 升 和 ０２ ０稀 按 ．毫 ． 毫升 ， 接 种 ５ 各 ０枚 鸡胚 ， 取 接 毒 后 ４ ～ ６小 时 死 收 ８９ 胚 的尿囊 液 ， 以红 细胞凝 集试验 测定 血凝 效价 。 接 毒孵 育 后 死 胚 和 活胚 的血 凝 价测 定 。 以 １ － ０３ 稀 释 的种 毒 ， 每胚 接 种 ０２毫 升 ， ． 收集 接 毒 后 ４ ６ ８ ９
一
１ 材 料 与 方 法
１ 制 备 用 种 毒 ． １
由哈兽研 提供 Ｈ ９亚型 低病 毒株 ， 毒 栋 的红 细 该
胞凝 集 试 验滴 度 为 １ ３ ０ １ ８ ， Ｉ ∞为 １－ ：２ ～ ０ Ｅ Ｄ ２ ０ 属 于 ８
不同来源白油佐剂质量分析及其制备的禽流感疫苗安全性与免疫效力研究
由同一批禽流感灭活抗原与 3 种不同来源 的注射用白油（LH、MC、HZ）分别配制成 6 批 禽 流 感 灭 活 疫 苗 ，每 批 5 000 mL，由 国 内 某 禽 流 感 疫苗定点生产企业制备。 诊断抗原购自哈尔滨兽 医研究所。 1.1.3 SPF 鸡
2009 年第 31 卷第 22 期
实验研究
China Poultry Vol．31,No．22．2009
不同来源白油佐剂质量分析及其制备的 禽流感疫苗安全性与免疫效力研究
何海蓉1，2，姜 平2，梅 忠1，宋立芹1，岳建新1 （1.乾元浩生物股份有限公司研发中心，北京 100083；
2.南京农业大学动物医学院，江苏南京 210095）
表 1 LH、MC、HZ 来源注射用白油全项检测结果（兽药典标准）
检测项目
质量标准
LH1
LH2
LH3
LH4
MC
HZ
性状
无色透明的油状液体； 无色透明的油状 无色透明的油状 无色透明的油状 无色透明的油状 无色透明的油状 无色透明的油状
无臭，无味；日光下不显 液体；无臭，无味； 液体；无臭，无味； 液体；无臭，无味； 液体；无臭，无味； 液体；无臭，无味； 液体；无臭，无味；
黏度与相对密度指标与兽药典检测结果一 致，稠环芳烃检测结果更为精确。 LH1～LH4 组白 油稠环芳烃含量低于 60 mg/kg，与 MC 组及 HZ 组相比差异极显著 ，铅 、砷 含 量 也 低 于 MC 组 及 HZ 组（见表 2）。
禽流感油乳佐剂疫苗质量快速检测方法的建立
将含有 ＡＩＶ Ｈ９ 无菌胚液 （ 简称 Ｈ９ 胚液） 用 ＰＢＳ 稀释为 ＨＡ 效价等于 １∶６４０， 平分为 Ａ、Ｂ 两 份， Ａ 样品按 ０．３％比例加入甲醛溶液（ 浓度为 ３６％） ３７ ℃恒温机中灭活 ２４ ｈ， 置 ４ ℃保存。Ｂ 样品置－ ２０ ℃保存备用。将 Ａ、Ｂ 两样品作 ＨＡ 试验， 确认 ＨＡ 效价为 １∶６４０。将 Ａ 样品分为 ａ１、ａ２ 两样品， Ｂ 样品分为 ｂ１、ｂ２ 两样品。各样品以 ＰＢＳ 作倍比稀 释 依 次 得 ａ１ － ６４０， ａ１ － ３２０， ａ１ － １６０， ａ２ － ６４０， ａ２ － ３２０， ａ２－ １６０， ｂ１－ ６４０， ｂ１－ ３２０， ｂ１－ １６０， ｂ２－ ６４０， ｂ２－ ３２０， ｂ２－ １６０。将 ａ１ 各样品按常规加入 ２ 倍油佐剂 制备成油佐剂灭活疫苗， 将 ｂ１ 样品按常规加入 ２ 倍油佐剂制备成油佐剂灭活疫苗， 将 ａ２、ｂ２ 各样品 按油佐剂比例加入 ２ 倍 ＰＢＳ， 充分摇匀， 使所含疫 苗抗原量与相应的油苗相当， 所有样品处理后， ａ２ 放入－ ２０ ℃冻结保存， 其余样品于 ４ ℃保存， 待检。
２．２ 油乳剂苗的破乳方法筛选结果 ①低温冻融法： 油乳剂经长时间冷冻处理， 均
无法完全冻结华， 取出室温解冻后， 静置未见有效 液相析出。
②研磨法： 室温静置 ５ ｈ 以上， 未见液相析
－ １９ －
中国家禽 !２"００"#７ 年第 !２９$ 卷第 １４ 期
鸡新城疫灭活疫苗三种佐剂乳化效果的比较
鸡新城疫灭活疫苗主要是 由甲醛灭活后与油佐 剂混合乳化制成 。所有 的乳化剂分子都是 由极性 的 亲水基 团和非极性 的亲油基团两部分组成 ，而且两 部分分处分子的两端 ， 形成不对称的结构。这样的分 子结构使得乳化剂分子一部分可溶于水 ，另一部分 易于和油相结合 。乳化剂的作用就在于使用机械作 用分散所得 的液滴不互聚集结 ，在成品质量方面要 通过 试验对不同乳化剂进行研究 ， 以便指导生产。
冷库 冻 胚 １ ２ 小时左右 ， 即１ ２ ０小时 收 获 。 收获 是 用 自动 收 获 机进 行 ， 调 整好 收 获 时 间 ， 保 证 收获 的病 毒
疫灭活疫苗 ， 至今 己在欧洲 、 亚洲等许多国家推广使
用。 １ ９ ８ ３年 ， 中 国兽 医监察 所 、 哈 尔滨兽 医研 究所 、 北
将 制备 好 的疫 苗 每组 分 别 进 行 观 感 、剂 型 、 粘
１ 材 料 和 方 法 １ ． １ 试 验 材 料 和 实验 动 物
磷 酸 氢 二钠 、 磷 酸 氢二 钾 、 氯 化 钠 等 试剂 均 购 自 国药集 团药 业 股份 有 限公 司 ，试 验 所 需试 剂 为 同批 次 。注射 用水 由本 单 位制备 ， 保存 时 间 ６小 时 。一支 ８道 移 液 器 ， ９ ６孔 “ Ｖ ”形 微 量 反 应 板 ， 自动 接 种 机 （ 需 灭 菌 部件 已经 灭 菌 ） ， 自动 收 获 机 （ 需 灭 菌部 件
液质量 ， 留样做半成品检验 ， 其余进行灭活。 配制浓度为 ０ ． ８ ５ ％的生理盐水 ， １ ２ １ ｏ Ｃ 高压灭菌 ３ Ｏ 分钟。Ｓ Ｐ Ｆ 鸡翅下静脉采血 ， 与等量阿氏液混合 ， 配制 １ ％鸡 红细胞 悬 液 。 对收获 的病 毒 液进行 红 细胞 凝集 试 验 ，选取 其 血凝 效 价 ≥１： ２ ５ ６的再 进 行病 毒
不同白油佐剂制备的H9N2灭活疫苗在SPF鸡上的免疫效果初试验
表 １ 不 同厂 家注 射用矿 物 白油质量 检验 结果
１ 材 料 与 方 法 １．１ 矿 物 白 油 佐 剂 不 同 场 家 注 射 用 白 油 型 号 分 别 为 Ｗ Ｇ４０、ＷＧ５０、ＤＤＥ１７０，由 国 内 两 家 不 同 代 理 商 提 供 。 １．２ 病 毒 灭 活 液 与 标 准血 清 各 项 检 验 合 格 的 鸡 Ｈ。Ｎ 病 毒 灭 活 液 由 山 东 省 农 业 科 学 院 家 禽 研 究所 无 特定病 原 鸡研究 室 提供 。标 准 Ｈ９Ｎ 阳性抗 原 、标 准 Ｈ９Ｎ 阳 性 血 清 、标 准 阴 性 血 清 由 哈 尔 滨 兽 医 研 究 所 提 供 。 １．３ 培 养基 和 药 品 需 氧 菌 培养 基 、厌 氧 菌 培养 基 、霉 菌 培 养 基 等 常 用 培 养 基 由 山 东 省 农 业 科 学 院 家 禽 研 究 所 制 备 和 保 存 ：吐 温 一８０、司 本 一８０由 广 州 市 华 南 农 大 生 物 药 品 有 限 公 司 提 供 。 １．４ 试 验 材 料 及 设 备 ２８ １３龄 ＳＰＦ鸡 ，由 山 东 省 农 业 科 学 院 家 禽 研 究 所 无 特 定 病 原 鸡 研 究 室 提 供 ：ＦＡ２５型 剪 切 机 ，上 海 弗 鲁 克 公 司 生 产 ；禽 用 负 压 隔 离 器 ，苏 州 安 泰 公 司 生 产 。 １．５ 不 同 厂 家 注 射 用 矿 物 白 油 质 量 检 测 相 对 密 度 、运 动 粘 度 、稠 环 芳 烃 、重 金 属 含 量 按 照 《中 华
关 键 词 ：矿 物 白 油 佐 剂 ；运 动 粘 度 ；Ｈｇｑ ；免 疫 效 果
标准操作规程(SOP)——流感禽流感灭活抗原的制备和纯化
该文件用以说明流感、禽流感灭活抗原的制备和纯化的操作规范。
流感/禽流感灭活抗原是为国家流感中心、全国各网络实验室提供季节性流感以及禽流感疫情监测用的参比抗原，该操作规范确保参比抗原的质量得到有效控制，保证参比抗原不被污染和污染环境。
二、范围适用于中国国家流感中心的所有技术人员进行流感/禽流感灭活抗原的制备和纯化。
三、程序（一）生物安全要求H5，H7亚型高致病性禽流感病毒，H2N2亚型流感病毒的操作需要在生物安全3级（BSL-3）实验室中进行。
其余流感病毒的操作需要在生物安全2级（BSL-2级）实验室中进行。
操作人员必须严格按照相应实验室的要求做好个人防护。
（二）材料1．鸡胚：9-10日龄SPF 鸡胚试剂：多聚甲醛，β-丙内酯（取 2 g 于100mL 冰浴过的双蒸水中），7.5%BSA ，7%的Na 2HCO 3，0.5M 磷酸氢二钠缓冲液，无菌PBS 100mmol/L ，pH 7.2~7.4，浓度分别为60%和30%的灭菌蔗糖溶液，75% 酒精，蔗糖，T75细胞瓶。
2．仪器：照卵灯，鸡卵开孔器， 天平，超速离心机，离心管等。
（三）实验步骤1．病毒制备（见流感病毒的鸡胚分离方法SOP ）2．灭活抗原一、目的标准操作规程（SOP ）——（1）禽流感病毒的灭活1）根据鸡胚尿囊腔内收获的量，用移液管吸取多聚甲醛，加入收获的病毒液内，使多聚甲醛的终浓度为1‰。
2）加入多聚甲醛后，立刻充分混匀，并置4ºC放置48h。
3）48h后，将多聚甲醛作用过的病毒液接种9日龄鸡胚进行三次安检盲传，每一种灭活抗原每次安检需接种3~4枚鸡胚（鸡胚接种见鸡胚分离流感病毒SOP）。
4）盲传后收集的鸡胚尿囊液，取部分做HA试验，如果结果为阴性则为灭活安检合格。
5）按此共进行三次安检盲传，如果三次检测均为阴性，则灭活成功，方可安全拿出生物安全三级实验室（BSL-3），供相关实验所需；如果未达到三次安检均合格，则需要再次进行灭活，直至安检合格为止。
不同佐剂制备鸡新城疫、禽流感二联灭活苗免疫效果评价试验
摘要 基于对市场现 有佐 剂产 品的了解取不同佐剂产品作比较 ，以禽 类疫 苗为例。选取鸡新城疫、禽 流感（Ｈ９亚型） 二 联 灭 活 （Ｌａｓｏｔａ株 ＋ＷＤ株 ）灭 活后 抗 原 液 ， 按 不 同佐 剖 的配 苗 比 例 分 别配 制 灭 活 苗 ，验 证 其 免疫 效 果 。 将 添 加 不 同 佐 剂配制的灭 活苗分别 免疫７日龄 商品肉鸡，分６组 ，每 ．￣ｇ３０Ｚ ，其 中１～５组 分别免疫５种不 同佐 剂配 制的禽流 感灭活疫苗， ６组为空 白对照，各 免疫０．３ｍｌ／只。分别于 免疫 后１４、２１、２８、３５ｄ采血 。离心后取血 清，利 用血凝抑 制方法分 别检测 鸡 新城疫和Ｈ９亚 型禽 流感血清抗体 。计算抗 体平均滴度 。试验结 果显示，ＭＦ５９、ＧＥＬ０２和ＩＳＡ７０ＶＧ等新型佐 刺较 传统佐 剂均能产生较 高的抗 体水平且 能使机体在短期 内快速产生 免疫应答反应并能很好的维持其抗体水平。
规 方 法 养 铕 。
１．１．２ 试 验 灭活抗原 鸡新城疫病毒（Ｌａｓｏｔａ株）、Ｈ９亚型 禽流感病 毒（ｗｏ株）二联灭活抗 原液 ：青 岛蔚蓝生物 制品
有 限 公 司 ， 产 。
１．１．３ 检测 试剂 鸡新城疫 ＨＩ实验标 准抗原 和阳性 血清
均购 自中国 兽医药品监察所 ？Ｈ９亚 型禽流感ＨＩ标准抗 原
关键 词 灭 活 苗 佐 剂 免疫 效 果
中图分类号 ：￥８５１．３ 文献标识码 ：Ａ 文章编 号 ：１００７—１７３３（２０１９）０１—０００８—０３
鸡新城疫 Ｄ）是 由新城疫病毒 ＤＶ）引起 的一种急性 高 度接 触性传 染病 ，其 发病 率和 死ｒ＿率 极高 Ｄｌ。禽 流感
表 １ 实 验 分组情 况
禽流感血凝抗原(H5亚型,Re-6株)的制造试验
充 分 。振摇 ４次后 取 出置于 ２ ８ ｃ （ ＝ 保存 。 灭 活病 毒原 液 的检 验 ， 即无 菌检 验 、 灭活 检 验 。冻 干保 护 剂配 制
的不 同方法 比较 ， 采用 ３ 组保护剂 ， 即明胶蔗糖组 ， 由２ ％明胶 ， １ ０ ％蔗 糖 加双 蒸 水 制得 ； 蔗糖 组 ， 由４ ０ ％ 蔗 糖 加双 蒸 水制 得 ； 蔗 糖 脱脂 乳 组 ， 由５ ％蔗 糖 ， １ ０ ％
燥 ，预 冻 阶 段 在 一 ４ ５ ℃ ３个 小 时 ，升 华 阶 段 在
一
升） 、 １ １ ８ ０ ０（ ３ ０微 升 ８ ０倍液 ＋生理 盐水 ２ ７ ０微升 ） 倍 稀 释 。取 ９ ６孔 Ｖ型微 量血 凝 板 ， 每 一 稀 释度 分别
取２ ５微 升 加入 到孑 Ｌ 中， 加入 生 理盐 水 ２ ５微升 ， 再 加 入 １ ％鸡红 细胞悬 液 ２ ５微升 。对 照为 ５ ０微升 生理盐 水 ＋２ ５微 升 ｌ ％鸡 红 细胞 悬 液 。在 微 量振 荡 器振 荡
曙 研 究 与 综 述
禽流感血凝抗原 （ Ｈ ５亚型 ， Ｒ ｅ 一 ６株 ） 的制造试 验
陈海 娟 （ 东北农业大学 哈 尔滨 １ ５ ０ ０ ３ ０ ）
１ 材 料 和 方 法
生 产用 毒种 的繁殖 。 将毒 种用 灭菌 生理盐 水作 １ 万 倍稀 释 ， 尿 囊 腔 内接种 ｌ ０日龄无 特 定病 原 （ Ｓ Ｐ Ｆ） 鸡胚 ， 每胚 ０ ． １ 毫升 ， 置３ ６ ｃ Ｉ ＝ 孵育 ， 收 获接 种 ７ ２小 时 的感染 鸡 胚 液 ， 装 于 灭 菌容器 内 。将 检 验无 菌且 １ ％
鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗三种佐剂乳化效果比较
是 危 害 养 禽 业 最 为 严 重 的 两 种 传 染
先 对 病 毒 或 细 菌 培 养 ，然 后 用 加 热
或 化 学 剂 将 其 灭 活 。 灭 活 疫 苗 即 可
一
．
材 料 和 方 法
（ 一 ）材 料
１ ． 试验 用主要 试 剂 （ 如表 １ ） 。 ２ ． 试 验 用动物 。试 验用 Ｓ Ｐ Ｆ鸡 ，
猪 丹 毒 是 由 猪丹 毒 杆 菌 引起 的
一
中猪 丹 肺 二 联 活 疫 苗 最 常 用 的 ，对 于 猪 丹 肺 二 联 活 疫 苗 免疫 时 ，为 保
胶 颗 粒 的 粒 径 大 小 和 吸附 力 等 特 性
差 异 很 大 。我 们 采 用 了传 统 工 艺 和
种 急 性 、 热 性 败 血 性 传 染 病 ，急
３ ． 试 验 用疲 苗 。鸡 新 城 疫 、 禽
流感 （ Ｈ９ 亚型 ）二联灭活疫苗样品
（ Ａ— Ｍ 、Ａ— Ｆ、 Ａ—Ｈ ） 。
预防 接种的生物 制品。灭活疫 苗是 名称
剂进行研究，以便指导生产 。 厂家
表 １试 验 用主 要试 剂
４ ． 试 验 用主要 仪 器 （ 如表 ２ ） 。
病 ，广泛 分 布 于 世 界 各 国 。这 其 中 ， 最 高 ，在 临 床 上 最 常 见 ，给 我 国 的
由整 个 病 毒 或 细 菌 组 成 ，也 可 由它 新 城 疫 、禽 流感 （ Ｈ ９亚 型 ）二 联 灭
Ｎ Ｄ 与 Ｈ９亚 型 ＡＩ 混 合 感 染 发 病 率 们 的 裂 解 片 段 组 成 为 裂 解 疫 苗 。 鸡
剂混 合 乳 化 制 成 。所 有 的 乳 化 剂 分 的 亲 油 基 团 两 部 分 组 成 。而 且 两 部
禽流感疫苗抗原浓缩工艺的研究
禽流感疫苗抗原浓缩工艺的研究作者：陈丽萍等来源：《福建畜牧兽医》 2017年第4期陈丽萍江兴华福州大北农生物技术有限公司福州 350014摘要为了提升禽流感疫苗中的抗原效价，本研究采用密理博公司的切向流超滤系统，选用不同孔径的超滤膜和浓缩倍数对禽流感病毒（H9N2亚型，HP株）进行浓缩，观察HA和EID50的变化。
结果显示：膜包孔径越大，病毒透过越多，但膜包孔径过小，浓缩时间长；随着浓缩倍数增加，HA和EID50均呈正相关增长，但高浓缩倍数耗时较长。
说明禽流感疫苗生产中应根据抗原相对分子质量、HA、EID50和生产效率选择合适的超滤膜孔径和浓缩倍数。
关键词抗原浓缩禽流感病毒疫苗病毒含量文献标识码：A文章编号：1003-4331（2017）04-0005-03Study on the concentration skills of antigen of avian influenza vaccinesChen Liping Jiang Xinghua（Fuzhou Dabeinong Biotechnology Co. Ltd., Fuzhou 350014）Abstract In order to increase antigen levels of avian influenza vaccines,avian influenza viruses（H9N2 subtype,HP strain） were concentrated with difference pore diameter uLtrafiltration membrane and difference concentration times by tangential flow filtration systems of Merck Millipore. And the HA and EID50 ofavian influenza viruses concentrated were examined to compare and analyze. The resuLts showed that more avian influenza viruses were wasting with increasing of pore diameter of uLtrafiltration membrane, but it took more time with decreasing of pore diameter. Also, HA and EID50 increased depending on concentration times, andit took more time with increasing of concentration times. Overall, it shouLd synthetically consider relative molecuLar mass of antigen, HA, EID50 and production efficiency to choose appropriate pore diameter uLtrafiltration membrane and concentration times in production of avian influenza vaccines.Key words Antigen concentration Avian influenza virus Vaccine Virus content禽流感（Avian influenza，AI）是由正黏病毒科、A型流感病毒属的禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）引起家禽、野鸟和部分哺乳动物发病的一种传染病。
禽流感(H9)灭活疫苗白油佐剂的优选试验_
美国602587在日光下不显荧光0.84129.25法国3396742无色透明的油状液体,无臭、无味、在日光下不显荧光0.82617.2韩国983516无色透明的油状液体,无臭、无味、0.82989.16无色透明油状液体，无臭、无味、在日光下不0.8270~0.846040℃(内径1.0mm)为6.70~9.70mm 2/秒安全用药禽流感（Avian Influenza ，AI ）是由正粘病毒科流感病毒属A 型流感病毒（Avian Influenza Virus ，AIV ）所引起的禽类疾病[1]。
该病毒有囊膜，具有血凝特性，主要通过呼吸道传播，H9亚型禽流感病毒感染鸡群后，会造成大面积的呼吸系统疾病[2]，同时严重影响生殖系统，导致产蛋鸡群的产蛋量大幅下降[3]，且病程较长，发生继发感染时，死亡率增加，药物治疗效果不佳，给养殖业造成严重的经济损失。
目前禽流感的防控主要依靠灭活疫苗免疫接种，而白油佐剂被广泛的应用在禽用灭活疫苗的生产中，白油佐剂的质量也直接影响着疫苗的免疫效果，劣质矿物油甚至能造成鸡群的生产性能下降、发病和死亡，而优质的佐剂可以保证疫苗的质量稳定，使鸡群产生较高的抗体，形成较长的保护期，且注射方便省力。
因此，通过研究选择优质的白油佐剂对禽用油乳剂灭活疫苗的生产和使用具有重要的理论和实践意义。
1材料与方法1.1主要材料7日龄爱拔益加(AA+)商品肉鸡4200只，由哈尔滨市香坊区养殖场提供；9~11日龄SPF 鸡胚，由哈药集团生物疫苗有限公司SPF 养殖场提供；试验用全部疫苗均由哈药集团生物疫苗有限公司提供；佐剂用矿物油，产地及理化性状见表1；禽流感HI 实验用标准抗原、阳性血清由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供。
禽流感(H9)灭活疫苗白油佐剂的优选试验丛秋实，胡瑞鸿，郑德富，郑孝辉，姜丽萍（哈药集团生物疫苗有限公司黑龙江哈尔滨150069）摘要：采用同一批病毒原液，不同白油佐剂乳化的疫苗，对7日龄肉鸡分组免疫接种，观察并对比各组鸡群的精神状态、采食量、增重、料肉比、疫苗的吸收情况和抗体变化规律，根据以上数据，综合评价佐剂的性能。
禽流感火麻油佐剂灭活疫苗实验室乳化条件研究
（2）司班 -80 占比 司班 -80 占比分别为 2.5％、
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广 西 农 学 报
2023 年
3.0％、3.5％、4.0％、4.5％，吐温 -80 占比为试验（1） 中得到的较优值，油相与水相比例为 2 ∶ 1，转速 为 9000 r/min，分别进行乳化，按《规程》进行稳 定性检验。
（1） 吐 温 -80 占 比 吐 温 占 比 分 别 为 1.0 ％、 1.5％、2.0％、2.5％、3.0％，司班 -80 占比为 2.5％， 油相与水相比例为 2∶1，转速为 9000 r/min，分别 进 行 乳 化。 按《 规 程 》 进 行 稳 定 性 检 验： 取 疫 苗 10 mL 加 入 离 心 管 中， 以 3000 r/min 离 心 15 min， 测定水相析出的量。
（3）油相与水相比例 油相与水相比例分别为 3∶1、7∶3、2∶1、3∶2、1∶1，吐温 -80 占比与司 班 -80 占比采用试验（1）（2）中所得到的较优值， 转速为 9000 r/min，分别进行乳化，按《规程》进 行稳定性检验。
（4）乳化转速 转速分别为 6000 r/min、7000 r/
（1. Guangxi Agricultural Vocational Technical University, Nanning, Guangxi 530007, China; 2 Guangxi Lichengdong Biological Co., Ltd., Nanning, Guangxi 530105, China; 3. Pingnan County Shangdu Street
兽医生物制品处理技术—佐剂配制技术
一、实验目的： 掌握白油佐剂的制备方法 二、实验器材： 1.共用：10号白油、Span-80、硬脂酸铝、天平、称量纸等。 2.每组所需：1个电炉（最好有石棉网）、2个玻璃烧杯、1个 玻璃捧、1个100ml量筒、1个10ml量筒等。
白油佐剂制备
三、实验方法： 1.按10号白油94ml，硬脂酸铝2g，Span-80 6ml的比例混合。 2.将白油和Span-80在电炉上微加热混合至透明。 3.然后取少量混合液加入硬脂酸铝，加热使其完全熔化。 4.再放入全量混合液中，充分混合。 5.高压蒸汽灭菌，110℃加热30min，冷却至50℃左右，再用力 振摇至透明均质状，即为白油佐剂（油相）。
➢ 例：破伤风明矾沉降类毒素 气肿疽明矾菌苗
钾明矾
常用的兽医免疫佐剂
➢ 明矾佐剂苗制备方法 取精制钾明矾配成10%溶液，高压灭菌后冷却至25℃以下， 按1%-2%加入pH8.0±0.2的灭活菌液中，充分振摇即为明矾 佐剂苗。
常用的兽医免疫佐剂
3.弗氏佐剂 ➢ 由匈牙利细菌学家Freund(1935年)
白油佐剂制备
四、注意事项： 油相制备时，温度和时间要掌握好，要使Span-80和硬脂酸 铝充分溶解。
常用的兽医免疫佐剂
1.氢氧化铝胶佐剂 2.明矾佐剂 3.弗氏佐剂 4.油乳佐剂 5.蜂胶佐.氢氧化铝胶佐剂
氢氧化铝胶又称铝胶，其佐剂活 性与质量密切相关。质优的铝胶 分子细腻，胶体状态良好、稳定 ，吸附力强，含Al（OH）3约2% （AlO3为1.3%），保存2年以上 吸附力不变。
树脂，并混入蜜蜂上颚分泌物，以及蜂蜡、花粉及其他一 些有机与无机物的一种天然物质。 蜂胶是一种蜂产品,含有多种氨基酸、酶、多糖、脂肪酸 、维生素及化学元素，是一种优良的天然药物。
禽流感抗原不同佐剂乳化制苗实验
禽流感抗原不同佐剂乳化制苗实验（一）一、二、实验内容及目的禽流感抗原离心灭活后，按制苗总量 500ml，抗原总量都相同，不同佐剂（分别为桑米特SummitP178、桑米特Summit101、进口复合佐剂、国产白油）按需求添加生理盐水配制水相，用 IKA 乳化机乳化制苗，送质检测 HI 及副反应。
通过此次实验结果能初步判断出不同佐剂对禽流感抗原免疫效果的影响。
实验过程禽流感抗原（批号 20180115rt）500ml，技术部离心（3000r/min，5min），离后 500ml 加 7.5ml 甲醛（10%）4℃灭活 48h。
1）样①禽流感抗原+桑米特SummitP178 乳化过程：3600r/min，乳化 5min2）样②禽流感抗原+乳化剂 10ml+ 桑米特Summit101 乳化过程：6600r/min 时水相慢慢倒入油相中，10000r/min 乳化 5min3）样③禽流感抗原：进口复合佐剂 (油包水型佐剂)乳化过程：10000r/min，乳化 5min4）样④禽流感抗原+吐温+国产包油司本+硬脂酸铝，乳化过程：10000r/min，乳化 5min 5）样⑤禽流感抗原+吐温+免疫增强剂+国产包油 +司本+ 硬脂酸铝乳化过程：10000r/min，乳化 5min三、实验结果1）过程结果离前离后灭后抗原浊度HA 浊度HA 浊度HA 备注（20180115rt）124 8 53 7 57．9 4注：1 抗原在成品 6 批生产取样，导致离前浊度小，效价低，入库效价为 10。
但实验样品均一，不影响横向对比。
2.实验时间：2018.02.05 化冻；2018.02.07 离心灭活；2018.02.09 配水相乳化送样。
2）免疫结果样品①2.5 ②5.2③2.2④1.5⑤3.8备注————————14 天 HI21 天 HI 28 天 HI 副反应3.8 7.0 3.8 2.3 6.3 ——4/248.7 ——11/24——10/24——8/24 7/24四、实验分析1. ①②③④的 HI 结果分析可得：佐剂桑米特summit101 制苗免疫效果最好；佐剂桑米特summitp178 与进口复合油佐剂免疫效果基本一样，但明显低于佐剂 summit101 约 3 个滴度；国产白油的免疫效果最差，低于佐剂桑米特summit101 约 4-5 个滴度。
纳米铝佐剂禽流感疫苗(H5N1)免疫反应性试验
纳米铝佐剂禽流感疫苗(H5N1)免疫反应性试验徐爱平;蒋勇;湛淋丽【摘要】通过自制纳米氢氧化铝佐剂,免疫肉鸡.检测发现初期油苗吸收不良,随着日龄的增加,油苗逐渐被吸收形成淡黄色的痕迹,而后逐渐被吸收;纳米佐剂组疫苗在初期吸收良好,淡黄色的痕迹很快被吸收、肌肉表现潮红.49 d时,纳米组炎性细胞已经被吸收殆尽,仅在毛细血管周围残存尚未被完全吸收的炎性细胞;常规铝组的炎性细胞也明显减少,而油苗组仍有大量炎性细胞未被吸收,炎灶明显,说明与油苗相比,纳米疫苗可以降低佐剂的副作用.【期刊名称】《中国兽医杂志》【年(卷),期】2015(051)010【总页数】4页(P84-86,中插2)【关键词】禽流感;纳米铝佐剂疫苗;反应性;免疫【作者】徐爱平;蒋勇;湛淋丽【作者单位】重庆市农业学校,重庆九龙坡 401329;重庆市农业学校,重庆九龙坡401329;重庆市巴南区花溪街道畜牧兽医站,重庆巴南 400045【正文语种】中文【中图分类】S858.31高致病性禽流感（HPAI）是由A型流感病毒引起的一种禽类感染疾病的综合征，它分布广，传播快，国际动物卫生组织（OIE）已将其列为必须报告疫病（notifiable disease），我国也将其列为一类动物疫病。
该病流行已有数百年历史，其造成的损失数不胜数。
自1997年我国香港地区暴发禽流感，并发生H5N1亚型AIV致人死亡之后，该病毒致人死亡的事件频频发生。
目前，我国防控HPAI 的有效途径是注射油乳剂灭活疫苗。
但油佐剂刺激性大、不易被机体吸收，容易在注射部位形成肿块，影响生产性能。
另外，有研究表明，对于生长周期较短的肉鸡，在其宰杀销售之时仍有部分油佐剂残留于机体，严重影响产品质量，因此寻找副作用小的禽流感免疫保护的新型疫苗佐剂，具有重要的应用前景。
目前，纳米颗粒多用作药物载体，增加药物的靶向性和缓释效应，但用做疫苗佐剂的相关报道不多。
1981年Kreuter等首次将纳米材料应用于疫苗佐剂发现，流感病毒抗原与多聚甲基丙烯酸酯纳米颗粒聚合制作的流感病毒疫苗可保护小鼠免受鼠流感病毒侵袭。
禽流感(AI)H9和新城疫二联灭活油佐剂疫苗的研制
禽流感(AI)H9和新城疫二联灭活油佐剂疫苗的研制
刘佃章;杨小燕;赖友辉;华绍桂;黄金兰
【期刊名称】《龙岩学院学报》
【年(卷),期】2005(023)006
【摘要】从本地分离的禽流感(AI)-H9毒株和ND-lasota株,分别在9-11日龄的鸡胚增殖,灭活后用高压匀浆机乳化制成禽流感-H9、新城疫二联灭活油佐(乳)剂疫苗,经效力检验和攻毒试验结果表明,5日龄白羽肉鸡免疫后15天,抗体效价可达1:32以上,并能够保护免疫鸡免受AI的自然感染,ND的抗体效价也达到较高的水平.
【总页数】2页(P66-67)
【作者】刘佃章;杨小燕;赖友辉;华绍桂;黄金兰
【作者单位】森宝(龙岩)公司;龙岩学院生物科学与工程系,福建,龙岩,364000;森宝(龙岩)公司;森宝(龙岩)公司;森宝(龙岩)公司
【正文语种】中文
【中图分类】S859
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禽流感抗原不同佐剂乳化制苗实验（一）一、二、实验内容及目的禽流感抗原离心灭活后，按制苗总量 500ml，抗原总量都相同，不同佐剂（分别为桑米特SummitP178、桑米特Summit101、进口复合佐剂、国产白油）按需求添加生理盐水配制水相，用 IKA 乳化机乳化制苗，送质检测 HI 及副反应。
通过此次实验结果能初步判断出不同佐剂对禽流感抗原免疫效果的影响。
实验过程禽流感抗原（批号 20180115rt）500ml，技术部离心（3000r/min，5min），离后 500ml 加 7.5ml 甲醛（10%）4℃灭活 48h。
1）样①禽流感抗原+桑米特SummitP178 乳化过程：3600r/min，乳化 5min2）样②禽流感抗原+乳化剂 10ml+ 桑米特Summit101 乳化过程：6600r/min 时水相慢慢倒入油相中，10000r/min 乳化 5min3）样③禽流感抗原：进口复合佐剂 (油包水型佐剂)乳化过程：10000r/min，乳化 5min4）样④禽流感抗原+吐温+国产包油司本+硬脂酸铝，乳化过程：10000r/min，乳化 5min 5）样⑤禽流感抗原+吐温+免疫增强剂+国产包油 +司本+ 硬脂酸铝乳化过程：10000r/min，乳化 5min三、实验结果1）过程结果离前离后灭后抗原浊度HA 浊度HA 浊度HA 备注（20180115rt）124 8 53 7 57．9 4注：1 抗原在成品 6 批生产取样，导致离前浊度小，效价低，入库效价为 10。
但实验样品均一，不影响横向对比。
2.实验时间：2018.02.05 化冻；2018.02.07 离心灭活；2018.02.09 配水相乳化送样。
2）免疫结果样品①2.5 ②5.2③2.2④1.5⑤3.8备注————————14 天 HI21 天 HI 28 天 HI 副反应3.8 7.0 3.8 2.3 6.3 ——4/248.7 ——11/24——10/24——8/24 7/24四、实验分析1. ①②③④的 HI 结果分析可得：佐剂桑米特summit101 制苗免疫效果最好；佐剂桑米特summitp178 与进口复合油佐剂免疫效果基本一样，但明显低于佐剂 summit101 约 3 个滴度；国产白油的免疫效果最差，低于佐剂桑米特summit101 约 4-5 个滴度。
2. ②④⑤的 HI 结果分析可得：国产白油与添加免疫增强的抗原乳化，其免疫效果明显提高约 4 个滴度，但略低于佐剂桑米特summit101 不添加免疫增强剂制苗的免疫效果。
3. 样②的 14 天、21 天、28 天的 HI 结果可看出：佐剂桑米特summit101 制苗其免疫效果的28 天还有上升趋势。
讨论：1、实验过程显示 101 效果在禽流感病毒灭活后效果好于其他几个佐剂，但应激反应没有实验结论。
下一步实验准备加入应激反应评价。
2、实验持续期只是简单做了个 101 的 28 天观察没有对比，下一步安排同样的实验观察 28 天抗体上升趋势3、实验 178 效果不明显，根据沟通准备调整 178 的配方在做下一次实验4、 101 乳化过程稳定性效果不是很好有分层现象，下一步实验调整配方。
不同佐剂实验（二）一、实验内容及目的按生产禽流感（8+1）的工艺配制水相，分别用佐剂桑米特summit101、进口复合佐剂及进口Marcol52分别乳化制苗，从免疫效果得到最适合生产的佐剂，做好基础工作。
二、实验材料抗原-8（20180113rt）、抗原-1（20180115rt）、生理盐水、吐温、免疫增强剂、PBS、佐剂 summit101、进口复合佐剂、进口 marcol52+司本（116℃，20min）三、实验过程抗原离心灭活：离心机离心（3000r/min，5min），甲醛灭活。
1）样 P-52 抗原-8+抗原-1+乳化剂 10ml+桑米特summit101乳化：6600r/min 时水相慢慢倒入油相中，10000r/min 乳化 10min2）样 P-53 抗原-8+抗原-1+乳化剂+免疫增强剂+桑米特summit101乳化：6600r/min 时水相慢慢倒入油相中，10000r/min 乳化 10min3）样 P-54 抗原-8+抗原-1+免疫增强剂+进口复合佐剂乳化：10000r/min，乳化 10min4）样 P-55 抗原-8+抗原-1+吐温+免疫增强剂+Marcol52乳化：10000r/min，乳化 10min送样要求：P-52P-53P-54P-55 分别内检和外检，测 HI 及副反应；并要求 7 天、14 天及 21 天称重。
四、实验结果1）过程结果浊度HA 备注样品离前163449 离后107离前11 点9离后灭后11 点7 半流抗原-8 抗原 H711 点8 半流————67.6注：实验时间：2018.03.03 化冻；2018.03.05 离心灭活；2018.03.07 配制水相，乳化、送检。
2）免疫结果P-52 P-53 P-54 P-55HI14 天 21 天 28 天 14 天 21 天 28 天 14 天 21 天 14 天 21 天Re-1 -8 4.47.07.08.07.08.44.67.27.78.37.67.65.07.08.27.44.86.47.27.2副反应粘度7/2444.06/2457.66/2458.57/2434.2备注————————3)称重结果批号第 1 天增重率第天16增第 2 天第 3 天第 4 天第 5 天第 6 天第 7 天第10天第13天增重率增重率增重率增重率增重率增重率增重率增重率重率P-52 0.08520.0675-0.00360.03160.05110.04630.01080.01020.0111第 1 天增重率0.10370.1230.19260.22220.13930.08770.14600.15760.12640.13310.16240.25930.30160.19640.18950.21530.23240.18410.19110.21030.33700.41670.26790.25610.27740.31100.23830.26620.25830.44440.44440.32500.36140.37590.39020.29600.32420.30630.50000.54370.37500.42460.43430.45550.38990.42320.37270.66670.75400.91850.98021.15931.2103 0.03570.03160.05840.07050.07580.07170.06270.59300.60220.65400.57040.61430.57560.80350.84670.88720.41160.81230.72690.98951.06201.10530.97831.00680.9114平均P-53批号第天16 增第 2 天第 3 天第 4 天第 5 天第 6 天第 7 天第10天第13天增重率增重率增重率增重率增重率增重率增重率增重率重率0.0217 0.0000 0.0108 0.0317 -0.0154 -0.0154 0.0403 0.0394 0.0161 -0.0137 0.0289 0.0333 0.0931 0.0717 0.0427 0.0000 0.0580 0.0605 0.0383 0.0147 0.0343 0.09780.03870.06940.08730.05790.05770.15380.1290.15220.08450.13170.20630.16600.15380.23810.21510.19590.09220.19860.17040.24830.21160.18420.14550.22100.21710.17770.16910.18610.22830.17960.19870.25400.21240.18460.33330.26160.25910.15700.26710.24810.30000.29690.25380.22550.26450.27760.25090.22430.24850.30070.21480.25570.31350.27410.27310.38460.32970.31500.23210.33940.33330.36900.37200.32910.28360.36590.35940.29620.30150.32130.35870.26410.30990.50000.33980.34230.44320.40140.40530.32760.42960.38890.44480.43690.40560.33450.43480.37010.36930.34190.37010.50000.33800.40480.54760.44790.46920.53110.47310.49380.33790.52710.49260.46900.53580.47250.46910.54350.45910.42160.50740.48010.65220.52110.58670.80160.58300.61540.75820.64160.68000.52220.70400.67040.68970.77820.67290.63270.73190.65480.56450.69850.65650.86590.73940.71120.87700.81850.82690.98530.84230.87000.70990.94580.84810.90690.95560.87330.85820.92390.87900.77700.92650.87291.07970.93661.00301.08731.08111.02691.21251.05021.09160.88051.16611.11111.16901.13651.09301.06911.13771.04630.96171.15811.0750平均P-54平均P-55 0.0972 0.0068 0.1083 0.0889 0.1586 0.1399 0.1005 0.0618 0.1196 0.121平均对照0.08710.05880.0897平均五、实验结果分析1）副反应结果可以看出：佐剂桑米特summit101、进口佐剂、进口 marcol52 三种佐剂免鸡后副反应相差不大。
2） 粘度结果可看出：佐剂 桑米特summit101、进口复合佐剂两种佐剂制得疫苗的粘度差别不大，但明显高于 进口 marcol52 3） HI 结果可看出：1.P-52、P-53、P-54、P-55 对比可得：佐剂 桑米特summit101、进口复合佐剂、进口marcol52 三种佐剂总得免疫效果较理想的是佐剂 桑米特summit101 和进口复合佐剂， 其中佐剂 桑米特summit101 在-1 抗原的免疫效果差于进口复合佐剂，但佐剂 桑米特summit101在-8 抗原的免疫效果明显好于进口复合佐剂。