基因工程-2章 分子克隆工具酶

1、T4 DNA连接酶的作用机制： ①ATP+DNA ligase(E)→ E-AMP+PPi。 ②E-AMP上的AMP转移到DNA的5′磷酸根 上，使其活化，释放出酶。 ③活化的5′磷酸根与相邻的3′羟基形成3′， 5′－磷酸二酯键，并释放出AMP。
Tris-HCl 50mmol/L pH7.5 MgCl2 10mmol/L NaCl 0-100mmol/L DTT 1mmol/L Volume 20-100μL Temperature 37℃ Time 1-1.5h ◆1个单位限制性核酸内切酶：在建议使用的缓冲液 及温度下，在20μL反应液中反应1h，使1μg标准 DNA完全消化所需的酶量。

1960s，Linn和Arber在研究细胞限制性和修饰现象时在大 肠杆菌中发现了限制性内切酶，人们才搞清了细菌限制和 修饰作用的分子机制。大肠杆菌K株和B株都含有各自不 同的限制-修饰系统，它们均有三个连续的基因位点控制， 其中hsdR编码限制性核酸内切酶，它能识别DNA分子上的 特定位点并将双链DNA切断；hsdM的编码产物是DNA甲 基化酶，催化DNA分子特定位点上的碱基甲基化反应；而 hsdS表达产物的功能则是协助上述两种酶识别特殊的作用 位点。lK和lB长期分别寄生在大肠杆菌的K株和B株中，宿 主细胞内甲基化酶已将其染色体DNA和噬菌体DNA特异 性保护，封闭了自身所产生的限制性核酸内切酶的识别位 点。当外来DNA入侵时，便遭到宿主限制性内切酶的特异 性降解，由于这种降解作用的不完全性，总有极少数入侵 的DNA分子幸免于难，它们得以在宿主细胞内复制，并在 复制过程中被宿主的甲基化酶修饰。此后，入侵噬菌体的 子代便能高频感染同一宿主菌，但丧失了在其原来宿主细 胞中的存活力，因它们在接受了新宿主菌甲基化修饰的同 时，也丧失了原宿主菌甲基化修饰的标记。大肠杆菌C株 不能产生限制性内切酶，因而其它来源的l噬菌体可以感染 C株，而在C株中繁殖的l噬菌体则在K株和B株中受到严格 的限制作用，细菌正是利用限制修饰系统来区分自身DNA 与外源DNA的。
③ 酶切反应的温度 多数标准反应温度是37℃，如SmaI为25℃或 30℃ ，SfiI为50℃ 。 反应温度过度或过低都会影响酶活性，甚至导 致酶失活。 ④DNA分子结构 某些酶切割超螺旋质粒DNA时，酶量比切割线 性DNA时高出多倍，可高达20倍。

⑤核酸内切酶的缓冲液 高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子 强度、极端pH值等，会使一些核酸内切 酶的识别和切割序列发生低特异性，即所 谓的“星活性”现象。
DNA聚合酶(DNA polymerase)
4.反转录酶(reverse transcriptase)
反转录酶是依赖于RNA的DNA聚合酶或称为 RNA指导的DNA聚合酶，它以RNA为模板，催化合 成互补的DNA（complementtary DNA）单链,进而 合成DNA第二条链，
二、DNA连接酶(DNA ligase) DNA连接酶能催化双链DNA切口处的5′-磷酸 根和3′-羟基生成磷酸二酯键，使两末端连 接的一种核酸酶，这种反应需要供给能量。
第二节 其他分子克隆工具酶
DNA modifying enzymes （DNA修饰酶）



Polymerases（聚合酶） ligases （连接酶） Nucleases （核酸酶）
一、DNA聚合酶(DNA polymerase)

以自身ＤＮＡ为模板，以脱氧核苷酸为底物催化 合成新的ＤＮＡ的酶称为ＤＮＡ聚合酶。在微生 物、植物和动物中都发现有这种酶，而且原核细 胞和真核细胞所含的ＤＮＡ聚合酶不只是一种。 大肠杆菌中存在三种，分别称为ＤＮＡ聚合酶Ⅰ、 Ⅱ和Ⅲ；真核细胞中也分离出四种，分别称ＤＮ Ａ聚合酶α、β、γ和线粒体ＤＮＡ聚合酶ｍｔ。目 前常用于基因工程的为大肠杆菌ＤＮＡ聚合酶Ｉ 和Ｔ4ＤＮＡ聚合酶。后者由Ｔ4噬菌体感染大肠 杆菌所得。而用于ＰＣＲ扩增技术的多为耐热的 Taq DNA 聚合酶，它是来自一种水生嗜热杆菌。

黏性末端：指DNA分子在限制性内切核酸 酶的作用下形成的具有互补碱基的单链延 伸形成的末端结构，它们能够通过互补碱 基间的配对而重新连接起来。

平末端：限制性内切核酸酶在识别序列的 对称轴上切割，形成的片段末端。
附图 1
2
5.II型限制性核酸内切酶酶切反应操作
◆大部分II型限制性核酸内切酶需要相似反应条件：
主要特性
限制修饰 蛋白结构 辅助因子 识别序列 切割位点
Ⅰ型
多功能 异源三聚体 ATP Mg2+ SAM 距识别序列1kb处 随机性切割
Ⅱ型
单功能 同源三聚体 Mg2+ 4-6bp回文序列 识别序列内或附 近特异切割
Ⅲ型
双功能 异源二聚体 ATP Mg2+ 距识别序列下游 24-26bp处 随机性切割
10.同裂酶与同尾酶


同裂酶(isoschizomer):不同来源的限制性核酸内 切酶识别与切割相同的核苷酸靶序列，这类酶称 为同裂酶。SmaI和XmaI(CCCGGG)。 同尾酶(isocaudarner):不同来源的限制性核酸内 切酶识别与切割的核苷酸靶序列也各不相同，但 都产生相同的粘性末端，这类酶称为同尾酶。 BamHI(GGATCC))和BglⅡ(AGATCT)。
4.Ⅱ限制性核酸内切酶的功能

Ⅱ限制性核酸内切酶有严格的识别、切割顺序， 它以核酸内切方式水解DNA链中的磷酸二酯键，产 生的DNA片段5′端为P，3′端为OH，识别序列一般为 4～6个碱基对，通常是反转录重复顺序，具有 180°的旋转对称性即回文结构。Ⅱ限制性核酸内 切酶切割双链DNA产生3种不同的切口。

限制性核酸内切酶的命名原则： 属名 种名 株名 Haemophilus influenzae d 流感嗜血杆菌d株 HindⅡ HindⅢ 同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶
3.限制性核酸内切酶的分类 据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及 是否具有修饰酶活性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三类。
8.影响限制性核酸内切酶活性的因素
①DNA样品的纯度 DNA样中混有蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、 EDTA、SDS、NaCl等,都有可能抑制酶活性。 可采用以下方法，提高酶活性： 加大酶的用量，1μg DNA用10U酶 加大反应总体积 延长反应时间
②DNA样品的甲基化程度



大肠杆菌中的dam甲基化酶在5′GATC3′序列中的腺嘌 呤N6位引入甲基，受其影响的酶有Bcl I Mbol 等， 但BamHI、BglII、Sau3A I不受影响。 大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5′CCAGG3′或5′CCTGG3′序 列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有 EcoRII等，但BglI、KpnI不受影响。 采用去甲基化酶的大肠杆菌菌株来制备质粒DNA， 可防止DNA的甲基化。
9.Ⅱ限制性核酸内切酶操作的注意事项 ①商品化的限制性核酸内切酶均为浓缩液，每次 操作时应使用新的吸头去取酶，加入酶的体积 应不超过总体积的10%，否则酶液中的甘油浓 度超过5%时将会抑制酶的活性。 ②整个操作应在0℃进行，即在冰浴中进行，而 且是在加入其它试剂之后，最后加入酶。 ③当切割大量DNA时，通常采用延长反应时间， 减少酶的用量。 ④当DNA需2种或以上酶切时，应用通用缓冲液， 若没有通用缓冲液时，只有用1种酶切完后， 纯化酶切产物，再进行下一个酶切反应。
第二章 分子克隆工具酶



核酸酶：通过切割相邻两个核苷酸残基之 间的磷酸二酯键，从而使核酸分子多核苷 酸链发生水解断裂的蛋白酶叫做核酸酶 工具酶：应用于基因工程的各种核酸酶 核糖核酸酶（RNase）：专门水解断裂 RNA分子的酶。 脱氧核糖核酸酶（DNase）：特异性水解 断裂DNA分子的酶

6.Ⅱ限制性核酸内切酶的主要用途 ①在特异位点上切割DNA，产生特异的限 制性酶片段。 ②用限制酶切出的相同粘性末端，以便 重组。 ③改建质粒。 ④的星活性(star activity) 在极端非标准反应条件下，限制性核酸内 切酶能切割与特异识别序列相似的序列,降 低酶切反应的特异性,这种改变的特殊性称 为限制性核酸内切酶的星活性。 pH>8, 甘 油 浓 度 >5% ， 盐 离 子 浓 度 低 于 50mmol/L时，EcoRI GAATTC改变为NAATTN
3、常用的DNA聚合酶的特点

（1.） 共同特点：把dNTP连续地加到 dsDNA分子的3’-羟基端，催化DNA分子聚 合，而引物不从DNA模板上解离。


（2.） 主要区别：持续合成能力和外 切酶活性不同。
T7 DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不 从模板上掉下来。其它几种DNA聚合酶只能连续 添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。
第一节 限制性核酸内切酶
一、寄主的限制与修饰现象 限制(restriction)：指一定类型的细菌可以 通过限制酶的作用，破坏入侵的噬菌体 DNA，导致噬菌体的寄主幅度受到限制。 限制作用:实际就是限制性内切酶将侵入细 菌体内的外源DNA切成小片断 ，维护宿主 遗传稳定的保护机制。


修饰(modification)：指寄主本身的DNA， 由于在合成后通过甲基化酶的作用得以甲 基化，使DNA得以修饰,从而免遭自身限制 性酶的破坏。 修饰作用:宿主细胞通过甲基化作用达到识 别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。


星活性产生的原因如下： ①反应体系中甘油的浓度大于5%。 ②酶用量过大，大于100U/微克DNA。 ③低离子强度，小于25mmol/L。 ④高pH，大于8.0。 ⑤含有机剂，如乙醇、二甲基亚砜、二甲基乙 酰胺等。 ⑥Mn2+ 、Cu2+ 、Co2+ 、Zn2+ 等非Mg2+ 的二价 离子的存在。 常发生星活性的内切酶有：EcoRI、HindⅢ、 KpnI、PstI、SalI、HinfI等。